Tối ưu hoá qui trình thuỷ phân flavonoid và xây dựng quy trình định lượng flavonoid từ dịch thuỷ phân lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp HPLC

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 455 TỐI ƯU HOÁ QUI TRÌNH THUỶ PHÂN FLAVONOID VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TỪ DỊCH THUỶ PHÂN LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Hoàng Anh Việt*, Dương Thị Đan Thanh*,Nguyễn Thị Kim Oanh, *Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu các điều kiện thủy phân flavonoid toàn phần để thu được flavonoid dạng aglycon và áp dụng phần mềm tối ưu hoá để xác định các điều kiện thuỷ phân flavonoid tối ưu. Từ đó xây dựng qui trình định lượng quercetin và kaempferol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp: Khảo sát các phương pháp chiết xuất flavonoid toàn phần và tối ưu hoá các điều kiện thủy phân flavonoid toàn phần từ lá TNHC. Từ mẫu thử là flavonoid aglycon thu được, xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời quercetin và kaempferol trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. Kết quả: Tìm được phương pháp chiết xuất flavonoid bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn và các điều kiện thủy phân flavonoid đến dạng aglycon. Xây dựng được qui trình định lượng đồng thời quercetin và kaempferol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và tối ưu hóa các thông số thủy phân flavonoid theo mô hình Box-Behnken. Kết luận: Các kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng chiết flavonoid toàn phần và thuỷ phân dịch chiết với điều kiện tối ưu nhất để thu được flavonoid aglycon với lượng lớn, qui trình định lượng đạt các yêu cầu thẩm định nên có thể sử dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu TNHC. Từ khóa: Trinh Nữ Hoàng Cung, flavonoid, chiết lỏng siêu tới hạn, sắc ký lỏng hiệu năng cao, kaempferol, quercetin... ABSTRACT OPTIMIZED FLAVONOID HYDROLYSIS AND CONSTRUCTION FLAVONOID QUANTITATIVE PROCESS BY HPLC FROM HYDROLYSIS EXTRACT OF CRINUM LATIFOLIUM LEAVES Hoang Anh Viet, Dương Thi Dan Thanh, Nguyen Thi Kim Oanh, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 455 - 462 Objectives: In oder to improve the quality control as well as to isolate flavonoid compounds from Crinum latifolium L. Conditions for flavonoid extraction and simultaneous quantitation of quercetin and kaempferol in the leaf extract by HPLC was established. Methods: Study on conditions for total flavonoid extraction by super - critical fluid and hydrolysis conditions for flavonoid in the leaf powder of Crinum latifolium L was done. The simultaneous quantitation quercetin and kaempferol in leaf extract by HPLC was established. Results: The assay simultaneous of 2 theses flavonoids was studied by LC-DAD method. We also presented the optimization of the hydrolysis procedure (Box-Behnken schema). Conclusions: The simultaneous quantitation method of quercetin and kaempferol in leaf extract *Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm - Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp. HCM Tác giả liên hệ: ThS. Hoàng Anh Việt ĐT: 0908260987 Email: viethoanganh82@yahoo.com.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 456 was built and validated with all requirements such as specificity, repeatability, accuracy, linearity and system suitability. This is the first time of fast, simple HPLC method is reported for the simultaneous quantitative determination of quercetin and kaempferol in Crinum latifolium L. material. Key words: Crinum latifolium, flavonoid, HPLC, quercetin, kaempferol ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến nay, có nhiều công trình nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh lá Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC) có tác dụng chữa khỏi bệnh u phì đại lành tính tuyến tiền liệt góp phần mang lại niềm tin của bệnh nhân đối với cao chiết từ lá cây TNHC. Đã có nhiều báo cáo về thành phần hóa học của lá TNHC thuộc các nhóm hoạt chất chính như alkaloid, flavonoid(4,5) và với định hướng chiết cũng như ứng dụng phần mềm tối ưu hóa(1,2,3) nhằm xác định các điều kiện thuỷ phân flavonoid toàn phần tốt nhất để thu được flavonoid aglycon với hiệu suất cao, nên chúng tôi chọn đề tài “Tối ưu hoá qui trình thuỷ phân flavonoid và xây dựng qui trình định lượng flavonoid từ dịch thuỷ phân lá Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) bằng phương pháp HPLC” ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Lá Trinh Nữ Hoàng Cung thu hái tại Bình Định vào tháng 5 năm 2010. Chất đối chiếu, hóa chất, dung môi - Chất đối chiếu: quercetin do Viện kiểm nghiệm cung cấp, độ tinh khiết 91,34 % và kaempferol do Sigma - Aldrich, Singapore cung cấp, độ tinh khiết ≥ 96%. - Trang thiết bị: máy HPLC hiệu Waters, Model Alliance 2695; Detector PDA; Cột Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A0, 250 x 4,6 mm, 5 μm; bể siêu âm Elma (Đức); máy đo pH hiệu Metrohm (Đức); cân phân tích Sartorius CP 224S (độ nhạy 0,1 mg); nồi cách thủy Memmert WB -14. Hệ thống chiết lỏng siêu tới hạn của Công ty TNHH Công nghệ hóa học T. C. L thuộc Sở Khoa học và công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Viện công nghệ hóa học, hiệu HS 064 - 08. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát quy trình chiết flavonoid toàn phần Bột lá Trinh Nữ Hoàng Cung được chiết xuất bằng cách thăm dò 2 phương pháp khác nhau. - Ngấm kiệt: làm ẩm một lượng bột lá Trinh Nữ Hoàng Cung với cồn 96%, để qua 24 giờ, thu dịch chiết và lắc dịch với cyclohexan 2lần (125 và 75 ml) để xử lý tạp, sau đó cô thu hồi dung môi (cồn 96%) thu được cao lỏng. - Chiết lỏng siêu tới hạn: làm ẩm một lượng bột với cồn theo tỉ lệ 1:1, nạp vào hệ thống chiết lỏng siêu tới hạn (nhiệt độ 300C, áp suất 100 bar, khí CO2 đạt trạng thái siêu tới hạn) và sau đó thu dịch chiết, cô thu hồi dung môi thu được cao lỏng. Cân lượng cao thu được sau khi chiết; hiệu suất chiết được tính theo tỷ lệ của khối lượng cao lỏng thu được so với lượng lá khô sử dụng, quan sát thể chất và màu sắc cao lỏng cũng như thực hiện các phản ứng hóa học để định tính flavonoid nhằm chọn phương pháp chiết xuất tốt nhất. Thăm dò qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn và thủy phân flavonoid từ lá TNHC Sau khi chọn lựa chiết flavonoid toàn phần bằng phương pháp siêu tới hạn, việc tạo flavonoid dạng aglycon được nghiên cứu bằng cách thủy phân flavonoid toàn phần đã chiết từ lá Trinh Nữ Hoàng Cung trong môi trường acid. Lượng cao chứa flavonoid dạng aglycon thu được sau khi thủy phân sẽ được xử lý để triển khai HPLC Qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá TNHC được tiến hành qua nhiều giai đoạn: - Giai đoạn 1: Chiết flavonoid toàn phần bằng phương pháp siêu tới hạn, lặp lại quy trình đã nghiên cứu với quy mô lớn hơn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 457 - Giai đoạn 2: Thủy phân flavonoid từ dịch chiết siêu tới hạn (sử dụng môi trường acid HCl 20%, với nhiệt độ 850C trong thời gian 3 giờ) - Giai đoạn 3: Chiết flavonoid dạng aglycon bằng dung môi EtOAc - Giai đoạn 4: Tinh chế flavonoid dạng aglycon - Giai đoạn 5: Phân tích bằng hệ thống HPLC Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng quercetin và kaempferol trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC Thăm dò các điều kiện để tách quercetin và kaempferol có trong cao chiết flavonoid đã thủy phân bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Thưc hiện việc khảo sát tính tương thích hệ thống; thẩm định quy trình định lượng rồi xây dựng tiêu chuẩn định lượng quercetin và kaempferol trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. Tối ưu hóa quy trình thủy phân flavonoid toàn phần trong lá TNHC bằng phần mềm JMP 4.0 Thay đổi các thông số trong điều kiện thủy phân như nhiệt độ, thời gian, nồng độ acid để khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến hàm lượng quercetin và kaempferol có trong lá Trinh Nữ Hoàng Cung trong quá trình chiết xuất. Phần mềm JMP là phần mềm của SAS Institute Inc., được phát triển bởi John Sall có nhiều tính năng từ việc phân tích dữ liệu với những thuật toán về xác suất thống kê, những minh họa cụ thể bằng hình ảnh (đồ thị, biểu đồ), cung cấp nhiều công cụ để xử lý số liệu, được sử dụng để tối ưu hoá các điều kiện thuỷ phân thông qua các thông số hiệu suất chiết xuất flavonoid (Y %) khi thay đổi các điều kiện thủy phân ( Xi ): nồng độ acid (X1), thời gian thủy phân (X2) và nhiệt độ thủy phân (X3). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả khảo sát qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần Bảng 1. Khối lượng và thể chất cao của các phương pháp chiết Phương pháp chiết Khối lượng bột lá ban đầu (g) Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%) Ngấm kiệt 700 98,0 14 Chiết lỏng siêu tới hạn 700 141,33 20,19 Nhận xét: với cùng một lượng dược liệu, phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp ngấm kiệt. Phương pháp chiết Màu dịch chiết Tốc độ phản ứng hóa học định tính Thể chất dịch chiết Ngấm kiệt Vàng nâu Chậm Lỏng Chiết lỏng siêu tới hạn Xanh lá Rõ ràng và nhanh Đậm đặc dù chưa cô thu hồi Do đó phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn được chọn để xây dựng qui trình định lượng flavonoid toàn phần có trong lá TNHC. Thăm dò qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần bằng phương pháp chiết longr siêu tới hạn và thủy phân flavonoid từ lá TNHC Qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá TNHC được tiến hành qua nhiều giai đoạn: - Giai đoạn 1: Chiết 141,33 gam flavonoid toàn phần bằng phương pháp siêu tới hạn được - Giai đoạn 2: Thủy phân flavonoid từ dịch chiết siêu tới hạn (acid HCl 20%, nhiệt độ 850C; trong thời gian 3 giờ) - Giai đoạn 3: Chiết flavonoid dạng aglycon - Giai đoạn 4: Tinh chế flavonoid dạng aglycon - Giai đoạn 5: Phân tích bằng hệ thống HPLC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 458 Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng quercetin và kaempferol trong lá TNHC Thăm dò điều kiện để triển khai HPLC với đầu dò PDA Sau khi tiến hành thăm dò, điều kiện sắc ký được chọn như sau: Cột Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 100 A0; 250 x 4,6 mm; 5 μm; pha động: Acetonitril : H3PO4 (pH = 2,5) = (23,5 : 76,5); nhiệt độ cột: 400C; Thể tích bơm mẫu: 10 μl; Tốc độ dòng: 1 ml/ phút; Bước sóng phát hiện: 355 nm Hình 1. Sắc ký đồ của chất đối chiếu quercetin và kaempferol theo điều kiện đã chọn Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu quercetin Số lần bơm tR S H K > 2 α 1,05<α<2 Rs Rs≥ 2 AF 0,8≤AF1,2 N > 2000 1 18,21 2398536 86530 12,01 1,21 9,54 1,18 15663 2 18,20 2396844 87573 12,00 1,16 9,08 1,17 15518 3 18,28 2427682 86301 12,06 1,17 9,11 1,19 15342 4 18,27 2435825 86622 12,05 1,21 8,91 1,20 15294 5 18,25 2454094 86356 12,03 1,18 9,39 1,19 15407 6 18,26 2409690 86301 12,05 1,19 9,63 1,18 15185 TB 18,24 2420445 86614 12,03 1,19 9,28 1,18 15401 SD 0,03 22689 488 0,02 0,02 0,28 0,01 170 RSD% 0,18 0.94 0,56 0,19 1,81 3,06 0,87 1,10 Bảng 3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu kaempferol Số lần bơm tR S H K’>2 α 1,05<α<2 Rs Rs≥ 2 AF 0,8≤AF1,2 N > 2000 1 35.44 3284688 73618 24.20 1,22 10.04 1.20 15663 2 35.62 3270266 72880 24.08 1,21 10.11 1.19 15518 3 35.60 3290887 72634 24.39 1,24 9.87 1.14 15342 4 35.44 3204003 73474 24.84 1,26 10.08 1.17 15294 5 35.45 3190312 72235 24.53 1,24 10.43 1.15 15407 6 35.82 3312896 71765 24.70 1,21 10.02 1.18 15185 TB 35.56 3258842 72768 24.46 1,23 10.09 1.17 15401 SD 0.15 49901.45 712.71 0.29 0,02 0.19 0.02 170 RSD% 0.42 1.53 0.98 1.18 1,63 1.86 1.81 1,10 Nhận xét Hầu hết các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép và có RSD% ≤ 2, do đó qui trình đạt tính phù hợp hệ thống Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 459 Thẩm định qui trình Tính đặc hiệu Triển khai HPLC của mẫu đối chiếu quercetin và kaempferol; mẫu thử là cao chiết flavonoid đã thủy phân và thêm một lượng chất đối chiếu quercetin và kaempferol vào mẫu thử, quan sát diện tích đỉnh của quercetin và kaempferol trong mẫu thử tăng lên so với lúc chưa cho chất đối chiếu. Hình 2. Sắc ký đồ của chất đối chiếu quercetin và kaempferol Hình 3. Sắc ký đồ của quercetin và kaempferol trong cao chiết flavonoid Hình 4. Sắc ký đồ của quercetin và kaempferol trong cao chiết flavonoid thêm chất đối chiếu Nhận xét: thêm một lượng chất đối chiếu quercetin và kaempferol vào mẫu thử, diện tích và chiều cao của pic ở mẫu thử thêm chất đối chiếu tăng lên rõ rệt. Quan sát phổ UV của chất đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu đều có cực đại hấp thu giống nhau. Như vậy qui trình đạt yêu cầu về tính đặc hiệu Tính tuyến tính Bảng 4. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của quercetin và kaempferol Dung dịch X1 X2 X3 X4 X5 X6 Nồng độ (μg/ml) 3 7,5 12 15 22,5 30 Diện tích đỉnh quercetin 16945 5 42533 0 68479 9 85242 2 12636 30 16563 07 Diện tích đỉnh kaempferol 24345 5 54330 8 86479 9 10724 22 15636 30 21014 27 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 460 Hình 5. Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin và kaempferol Khoảng tuyến tính: 3 – 30 μg/ ml Phương trình hồi quy tuyến tính Quercetin: ŷ = 55136x + 14957 Hệ số tương quan: R2 = 0,9996 Phương trình hồi quy tuyến tính của kaempferol : ŷ = 79111x – 7059,4 Hệ số tương quan: R2=0,9998 Độ đúng Sử dụng phương pháp thêm chất đối chiếu quercetin và kaempferol vào dung dịch thử. Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng của quercetin và kaempferol Hàm lượng chuẩn thêm vào (μg) Hàm lượng chuẩn tìm thấy (μg) Tỉ lệ phục hồi (%) Mức thêm vào quercetin kaempferol quercetin kaempferol quercetin kaempferol 80% 5,17 5,21 5,24 5,26 101,31 103,71 100% 6,50 6,48 6,75 6,43 103,91 99,20 120% 8,21 8,09 8,23 8,27 100,23 102,18 Độ lặp lại Tiến hành trên 6 mẫu cao chiết siêu tới hạn khác nhau. Bảng 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của các cao chiết siêu tới hạn Mẫu Hàm lượng quercetin/ 100g bột lá TNHC (mg) Hàm lượng kaempferol/ 100g bột lá TNHC (mg) 1 22,37 24,32 2 22,16 25,14 3 22,00 25,33 4 22,14 24,37 5 22,47 25,02 6 21,67 25,36 Trung bình 22,14 24,92 SD 0,29 0,47 RSD% 1,29 1,87 Giới hạn tin cậy ± 0,23 ± 0,37 Khoảng tin cậy 22,14 ± 0,23 24,92 ± 0,37 Qui trình định lượng quercetin và kaempferol trong lá TNHC Chiết xuất flavonoid toàn phần: bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn Pha chế các dung dịch thử nghiệm : - Pha dung dịch chuẩn quercetin và kaempferol có nồng độ 0,05 mg/ml - Pha dung dịch thử chứa flavonoid từ cao chiết lỏng siêu tới hạn - Tiến hành thử nghiệm: bơm mẫu đối chiếu quercetin và kaempferol và mẫu thử vào hệ thống HPLC, triển khai theo các điều kiện đã chọn. Công thức tính toán Hàm lượng quercetin hoặc kaempferol có trong 100 g bột lá TNHC là : 100 )100( 10010)( × −× × ××= hp C A AmgX C c t Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 461 At: diện tích đỉnh quercetin hoặc kaempferol trong dung dịch mẫu thử; Ac: diện tích đỉnh quercetin hoặc kaempferol trong dung dịch đối chiếu; Cc: nồng độ quercetin hoặc kaempferol trong dung dịch đối chiếu (mg/ml); p: khối lượng cân bột lá TNHC (g); h: độ ẩm của bột lá TNHC (%) Kết quả tính toán Hàm lượng trung bình của quercetin có trong 100 gam bột lá TNHC là: 22,14 ± 0,23 mg Hàm lượng trung bình của kaempferol có trong 100 gam bột lá TNHC là: 24,92 ± 0,37 mg Tối ưu hóa qui trình thủy phân flavonoid toàn phần trong lá TNHC bằng phần mềm JMP 4.0 Xác định các biến số của quá trình thủy phân Thay đổi các điều kiện thủy phân như nhiệt độ, thời gian, nồng độ acid để khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến hàm lượng flavonoid trong quá trình chiết xuất. Để có thể tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu Box - Behnken, cần xác định khoảng biến thiên của mỗi yếu tố khảo sát. Nhiệt độ : khoảng khảo sát 75 - 950C. Nồng độ HCl: khoảng khảo sát 5 - 20 % Thời gian thủy phân: khoảng khảo sát 3 - 7 giờ. Tiến hành với 3 biến sẽ có 33 = 27 thí nghiệm. Thực hiện 15 thí nghiệm ngẫu nhiên với sự thay đổi điều kiện thủy phân Xác định các điều kiện thuỷ phân tối ưu với sự hỗ trợ của phần mềm JMP 4.0 Bảng 7. Hàm lượng quercetin và kaempferol theo các điều kiện đã khảo sát Điều kiện TT Nhiệt độ Nồng độ HCl Thời gian Hàm lượng quercetin (mg/100 gam lá TNHC) Hàm lượng kaempferol (mg/100 gam lá TNHC) 1 95 5 5 2,63 4,18 2 95 12,5 3 28,34 4,42 3 95 12,5 7 9,58 12,59 4 95 20 5 10,80 27,37 5 85 5 7 26,88 28,89 6 85 12,5 5 40,66 34,69 Điều kiện TT Nhiệt độ Nồng độ HCl Thời gian Hàm lượng quercetin (mg/100 gam lá TNHC) Hàm lượng kaempferol (mg/100 gam lá TNHC) 7 85 12,5 5 40,66 34,69 8 85 12,5 5 40,66 34,69 9 85 20 7 29,75 21,49 10 85 20 3 27,00 29,18 11 85 5 3 36,32 17,55 12 75 5 5 21,89 10,51 13 75 12,5 3 25,00 11.62 14 75 12,5 7 18,15 9,09 15 75 20 5 6,32 12,47 Sau khi nhập các giá trị và tiến hành tối ưu hoá bằng phần mếm JMP 4.0, thu được kết quả như sau Bảng 8. Điều kiện thủy phân tối ưu Yếu tố ảnh hưởng quercetin kaempferol Nhiệt độ thủy phân (°C) 85 85 Nồng độ HCl (%) 12,5 12,5 Thời gian thủy phân (giờ) 5 5 Nhận xét: như vậy các điều kiện thủy phân tối ưu trong quá trình chiết lỏng siêu tới hạn flavonoid từ lá TNHC cho hiệu suất chiết quercetin và kaempferol cao nhất là nhiệt độ thủy phân 850C, nồng độ HCl 12,5%, thời gian thủy phân 5 giờ. Xác định phương pháp chiết xuất flavonoid toàn phần và điều kiện tối ưu để thuỷ phân flavonoid Bột lá TNHC được làm ẩm với cồn 96% trong 1 giờ rồi đặt vào hệ thống chiết siêu tới hạn. Điều chỉnh áp suất 100 bar, nhiệt độ 300C. Khởi động hệ thống chiết lỏng siêu tới hạn. Dịch chiết có màu xanh lá, được thủy phân bằng dung dịch HCl 12,5% ; 5 giờ ở 850C. Lọc lấy dịch, cho vào bình lắng và lắc với EtOAc. Dịch EtOAc được cô giảm áp đến cao có màu vàng nâu. Xử lý và bơm vào hệ thống HPLC. KẾT LUẬN – BÀN LUẬN Chúng tôi đã: - Thăm dò và xác định được hệ dung môi pha động để thẩm định qui trình định lượng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 462 quercetin và kaempferol trong cao chiết siêu tới hạn bằng phương pháp HPLC. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân flavonoid chiết từ lá TNHC. Yếu tố đó là: nhiệt độ thủy phân; thời gian thủy phân; nồng độ phần trăm của HCl cần dùng. - Bố trí 15 thí nghiệm theo mô hình Box - Behnken. Sử dụng quy trình định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp HPLC. - Sử dụng phần mềm thông minh JMP 4.0 và xác định được điều kiện thủy phân tối ưu để thủy phân flavonoid glycoside toàn phần thành flavonoid aglycon từ lá TNHC (Crinum latifolium L.) là : - Nhiệt độ thủy phân : 85 °C - Nồng độ HCl : 12,5 % - Thời gian thủy phân : 5 giờ - Xác định được phương pháp chiết quercetin và kaempferol từ lá TNHC bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn cũng như xác định hàm lượng của quercetin và kaempferol có trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. JMP DOE Guide, Release 6, SAS institute Inc : USA, 2005; pp 103-115 2. JMP Introductory Guide, Release 6, SAS institute Inc : USA, 2005; pp 3-30, 47-56. 3. JMP Start Graph Guide, Release 6, SAS institute Inc : USA, 2005; pp 7-20, 201-230. 4. Mai Đình Trị, Nguyễn Công Hào (2005), “Phenylpropanoid và flavonol glycosides được cô lập từ lá cây tươi Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.”, Tạp chí hóa học, 2 (34), tr. 8–10. 5. Nguyen Thanh Sy, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue (2009) “