Tối ưu hóa quy trình tổng hợp Nifedipin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 481 TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP NIFEDIPIN Nguyễn Thị Nguyệt Anh*, Lê Minh Trí*, Trần Thành Đạo*, Nguyễn Thị Thu Hà * TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nifedipin thuộc nhóm chẹn kênh calci chọn lọc, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tim mạch. Hiện nay, nhu cầu về nifedipin ở Việt Nam là khá lớn và phải nhập khẩu, vì thế việc nghiên cứu quy trình tổng hợp nguyên liệu dùng cho việc sản xuất thuốc là rất cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: Tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng, mô hình Box-Behnken, với sự hỗ trợ của phần JMP (phiên bản 4.0). Phương pháp nghiên cứu: Nifedipin được điều chế dựa trên phản ứng tổng hợp dihydropyridin của Hantzsch. Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Behken và tối ưu hóa bằng phương pháp thống kê, với sự hỗ trợ của phần JMP (phiên bản 4.0). Hiệu suất của phản ứng được tính dựa trên kết quả định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả nghiên cứu: Xác định được ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng, tương tác giữa các yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng. Xác định được điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến của phản ứng. Thẩm định lại kết quả bằng cách tiến hành 3 phản ứng tổng hợp nifedipin ở điều kiện dự kiến, với lượng các chất ban đầu tham gia phản ứng lớn hơn 10 lần. Tinh chế nifedipin thu được từ 3 phản ứng trên, kiểm định nifedipin tổng hợp được theo các tiêu chuẩn của BP 2007. Kết luận: Tối ưu hóa được quy trình tổng hợp nifedipin theo mô hình Box-Behnken nhờ phần mềm JMP có thể áp dụng trong điều kiện ở Việt nam. Từ khóa: mô hình Box-Behnken, phần mềm thống kê JMP, quy trình tổng hợp nifedipin. ABSTRACT OPTIMIZATION OF PARAMETERS FOR PROCEDURE OF SYNTHESIS OF NIFEDIPINE Nguyen Thi Nguyet Anh, Le Minh Tri, Tran Thanh Dao, Nguyen Thi Thu Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 481 - 486 Background: Nifedipine, a dihydropyridine calcium channel blocker is commonly used for treatment of cardiovascular diseases such as antianginal and antihypertensive. Nifedipine is imported costly with a large scale for formulations. Therefore, setting up an optimal process for synthesis of nifedipine is critical need towards local pharmaceutical factories. Methods: Nifedipine was synthesized via the Hantzsch reaction, in which the conditions were established following the Box-Behnken design. The optimal conditions were treated by statistics software JMP version 4.0. Results: The procedure for making nifedipine with high yield in laboratory conditions was established successfully. Conclusion: This optimal and possible procedure of synthesis of nifedipine could be developed to apply in bigger scale. Keywords: Box-Behnken design, JMP software, procedure for synthesis of nifedipine. *Khoa Dược; Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thị Thu Hà ĐT: 38392387 Email: nthithuha2002@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 482 ĐẶT VẤN ĐỀ Nifedipin thuộc nhóm chẹn kênh calci chọn lọc(6), được sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực mãn tính kiểu ổn định. Hiện nay, nhu cầu về nifedipin ở Việt Nam là khá lớn và phần lớn nguyên liệu dùng cho việc sản xuất thuốc là nhập khẩu, vì thế việc nghiên cứu quy trình tổng hợp là rất cần thiết, đó là lý do đề tài “Tối ưu hoá quy trình tổng hợp nifedipin trong điều kiện của Việt Nam” được chọn để khảo sát. Nghiên cứu này tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng, mô hình Box-Behnken, với sự hỗ trợ của phần JMP (phiên bản 4.0)(2) Ngoài ra, chúng tôi tính hiệu suất của phản ứng dựa trên kết quả định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance chromatography liquid - HPLC) vì vậy kết quả thu được sẽ chính xác và tin cậy hơn so với phương pháp cân. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phản ứng tổng hợp Nifedipin được điều chế dựa trên phản ứng tổng hợp dihydropyridin của Hantzsch(3,4) Sơ đồ 1. Phản ứng Hantzsch tổng hợp nifedipin Bố trí thí nghiệm Phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo thiết kế bề mặt đáp ứng, mô hình Box-Behnken. Mô hình này là những cấu trúc đối xứng trong đó mỗi thí nghiệm được tạo bởi 3 yếu tố, mỗi yếu tố khảo sát được mã hóa trong hệ tọa độ không thứ nguyên có 3 mức: tọa độ của phương án bằng 0, các yếu tố mã hóa nhận 2 giá trị -1 và +1 tương ứng với mức dưới và mức trên. Tiến hành tổng hợp Nifedipin được tổng hợp ở những điều kiện khác nhau (dựa vào nghiên cứu tiền tối ưu) với sự thay đổi lần lượt 3 yếu tố: - Nhiệt độ phản ứng: thay đổi theo 3 mức 55, 60, 65 oC. - Tỷ lệ mol methyl acetoacetat: thay đổi theo 3 mức 2,25; 2,45; 2,65. - Tỷ lệ ammoniac đậm đặc: thay đổi theo 3 mức 1,6; 1,8 và 2. Bố trí thực nghiệm dựa theo các điều kiện nêu trên thông qua phần mềm JMP, ở mỗi điều kiện tiến hành 2 phản ứng, tổng cộng có 30 phản ứng ở 15 điều kiện tương ứng. Dùng giá trị hiệu suất phản ứng tổng hợp thu được theo từng điều kiện để đánh giá hiệu quả của quá trình tổng hợp. Áp dụng qui trình định lượng nifedipin mô tả trong Dược điển BP 2007 bằng phương pháp HPLC để xác định lượng nifedipin tạo thành trong hỗn hợp phản ứng. Để đảm bảo quy trình này đạt được các yêu cầu trong định lượng: tính chọn lọc, độ lặp lại, độ đúng, và khoảng tuyến tính (0,06 mg/ml đến 0,24 mg/ml) cần phải thẩm định lại qui trình. Các điều kiện sắc ký như sau: - Cột: C18, kích thước cột 25 cm x 4,6 mm, kích thước pha tĩnh 5 µm. - Pha động: methanol-acetonitril-nước với tỷ lệ thể tích 25:25:50 - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, - Thể tích bơm mẫu: 25 µl Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 483 Phân tích kết quả Kết quả thu được từ 30 thí nghiệm sẽ được xử lý bằng phần mềm thống kê JMP (phiên bản 4.0), từ đó xác định được mối tương quan giữa các yếu tố nhiệt độ, tỉ lệ mol, thời gian đối với hiệu suất phản ứng; đồng thời xây dựng được phương trình bề mặt đáp ứng và dự đoán điều kiện phản ứng cho hiệu suất tối ưu. Thẩm định lại quy trình đã được tối ưu hóa Từ các thông số đã lựa chọn cho phản ứng điều chế, tiến hành 3 phản ứng tổng hợp lại nifedipin ở điều kiện dự kiến, với lượng các chất ban đầu tham gia phản ứng lớn hơn 10 lần. Tinh chế lượng nifedipin thu được từ 3 phản ứng trên bằng kết tinh trong ethanol Kiểm định nifedipin theo các tiêu chuẩn của BP 2007. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hiệu suất của phản ứng điều chế nifedipin được tóm tắt trong Bảng 2. Bảng 2. Hiệu suất phản ứng điều chế nifedipin trong các điều kiện khác nhau STT Mã thí nghiệm Tỷ lệ mol methyl acetoacetat/2 -nitro benzaldehyd (X1) Nhiệt độ phản ứng X2 Tỷ lệ mol ammoniac /2- nitrobenz- aldehyd (X3) Hiệu suất (%) (Y) 1 0+- 2,45 65 1,6 61,4 2 -+0 2,25 65 1,8 84,8 3 000 2,45 60 1,8 93,2 4 000 2,45 60 1,8 93,2 5 +0- 2,65 60 1,6 64,4 6 +0+ 2,65 60 2,0 55,6 7 ++0 2,65 65 1,8 89,0 8 -0+ 2,25 60 2,0 62,9 9 000 2,45 60 1,8 86,7 10 000 2,45 60 1,8 92,6 11 0++ 2,45 65 2,0 60,6 12 0-+ 2,45 55 2,0 54,1 13 000 2,45 60 1,8 92,8 14 0-+ 2,45 55 2,0 55,0 15 -0- 2,25 60 1,6 60,3 16 0++ 2,45 65 2,0 62,4 17 0-- 2,45 55 1,6 59,1 18 -0+ 2,25 60 2,0 62,9 19 +0+ 2,65 60 2,0 47,5 20 -+0 2,25 65 1,8 88,7 21 +-0 26,5 55 1,8 52,9 22 --0 2,25 55 1,8 59,8 23 +0- 2,65 60 1,6 67,9 24 ++0 2,65 65 1,8 81,5 25 +-0 26,5 55 1,8 54,8 26 --0 2,25 55 1,8 63,9 27 0-- 2,45 55 1,6 60,8 28 0+- 2,45 65 1,6 57,9 29 000 2,45 60 1,8 92,9 30 -0- 2,25 60 1,6 53,9 Phương trình đường cong của mô hình bề mặt đáp ứng Từ kết quả trên, phần mềm JMP đã xác định được phương trình đường cong của mô hình bề mặt đáp ứng như sau: 2 3 2 2 2 1312 74375,2224375,1073125,91,5867875,79,91 XXXXXXY −−−−+= Trong đó Y là hiệu suất phản ứng tổng hợp (%), X1, X2 và X3 là các biến thay đổi như đã xác định trong Bảng 2. Đường cong này cho thấy mối quan hệ giữa các yếu tố với hiệu suất là đáng tin cậy với độ tin cậy 95 % và hệ số tương quan R2 = 0,89. Ngoài ra, Hình 1 (xử lý với JMP) cũng cho thấy yếu tố nhiệt độ (X2) là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu suất tổng hợp. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 484 X1: tỷ lệ mol của methyl acetoacetat/2-nitrobenzaldehyd; X2: nhiệt độ; X3: tỷ lệ mol của dung dịch amoniac Hình 1. Mô tả mối quan hệ giữa các yếu tố với hiệu suất tổng hợp nifedipin Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng Trong 3 yếu tố, chỉ có nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng ý nghĩa nhất lên hiệu suất phản ứng với độ tin cậy là 95 %: khi nhiệt độ tăng thì hiệu suất tăng nhưng khi nhiệt độ lớn hơn 65 oC, hiệu suất không tăng thêm nữa và còn giảm nhẹ do sự thủy phân của liên kết ester trong phân tử và sự xuất hiện các tạp phân hủy khác của nifedipin. Tăng tỷ lệ mol của methyl acetoacetat và dung dịch ammoniac làm hiệu suất phản ứng tăng. Nhưng hiệu suất chỉ tăng trong một khoảng tỷ lệ mol nhất định, nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol của 2 yếu tố trên thì hiệu suất sẽ không tăng lên nữa do lúc này 2-nitro benzaldehyd đã hết, lượng dư amoniac sẽ làm sản phẩm khó kết tủa hơn. Hình 2. Mô hình bề mặt đáp ứng được thể hiện bởi các yếu tố Tương tác giữa các yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng Thực nghiệm xác định có 3 yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng như sau: - Tương tác tỷ lệ mol giữa methyl acetoacetat và 2-nitro benzaldehyd. - Tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ mol của methyl acetoacetat. - Tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ mol của amoniac. Tương tác tỷ lệ mol giữa methyl acetoacetat và 2-nitro benzaldehyd Ở tỷ lệ mol của methyl acetoacetat so với 2- nitro benzaldehyd là 2,25 và 2,65: hiệu suất của phản ứng tăng khi tỷ lệ mol này nằm trong khoảng 1,60 đến 1,85. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol thì hiệu suất sẽ giảm. Tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ mol của methyl acetoacetat Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 485 Ở nhiệt độ 55 oC và 65 oC: hiệu suất của phản ứng tăng khi tỷ lệ mol của methyl acetoacetat so với 2-nitro benzaldehyd từ 2,25 đến 2,50. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol thì hiệu suất sẽ giảm nhưng ở nhiệt độ 55 oC thì biến đổi ít hơn. Tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ mol của amoniac Ở nhiệt độ 55 oC và 65 oC: hiệu suất của phản ứng tăng khi tỷ lệ mol của amoniac nằm trong khoảng 1,60 đến 1,85 nhưng ở nhiệt độ 55 oC thì hiệu suất thấp hơn ở 65 oC. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol thì hiệu suất sẽ giảm. (xem Hình 3) Hình 3. Tương tác giữa các yếu tố lên phản ứng Xác định điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến Dựa vào đồ thị biểu diễn trên Hình 4 có thể xác định được các thông số thích hợp để điều chế nifedipin với hiệu suất cao. Hình 4. Điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến bởi phần mềm JMP Điều kiện tối ưu của phản ứng: - Tỷ lệ mol của methyl acetoacetat là 2,44 - Nhiệt độ là 61,9 oC (62 oC) - Tỷ lệ mol của amoniac là 1,79 (1,8) - Hiệu suất dự kiến là 93,39 % Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 486 Thẩm định lại các thông số phản ứng Tiến hành 3 phản ứng tổng hợp nifedipin ở điều kiện dự kiến, với lượng các chất ban đầu tham gia phản ứng lớn hơn 10 lần, kết quả thu được tóm tắt trong Bảng 3. Bảng 3. Hiệu suất phản ứng tổng hợp thực nghiệm Hiệu suất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hiệu suất phản ứng (%) 93,1 92,0 92,4 Hiệu suất trung bình (%) 92,5 ± 0,556 % (dự đoán 93,4%) Tinh chế nifedipin thu được từ 3 phản ứng trên bằng kết tinh lại trong ethanol, hiệu suất tinh chế là 89,2 %. Kiểm định nifedipin tổng hợp được theo các tiêu chuẩn của BP 2007(1). Kết quả cho thấy sản phẩm thu được đạt các chỉ tiêu qui định trong BP 2007, ngoại trừ các tạp chất liên quan do không có mẫu tạp chuẩn đối chiếu (xem Bảng 4). Bảng 4. Kết quả kiểm nghiệm một số chỉ tiêu nifedipin theo BP 2007 STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU KẾT QUẢ 1 Tính chất Màu vàng, tinh thể nhỏ, thực tế không tan trong nước, tan hoàn toàn trong aceton, tan rất ít trong ethanol. Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 171-175 oC Đúng Định tính Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của nifedipin chuẩn. Đúng 2 Sắc ký lớp mỏng Vết của chế phẩm và nifedipin chuẩn phải giống nhau về hình dạng vết và trị số Rf Đúng 3 Định lượng Chế phẩm phải chứa từ 98,0 đến 102,0 % nifedipin tính theo chế phẩm khô Đạt (101 %) Nifedipin tổng hợp đạt các tiêu chuẩn định tính và hàm lượng theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2007. KẾT LUẬN Nifedipin đã được tổng hợp với quy trình được tối ưu hóa theo mô hình Box-Behnken nhờ phần mềm JMP, các điều kiện tối ưu như sau: - Nhiệt độ phản ứng là 61,9 oC. - Tỷ lệ mol của methyl acetoacetat là 2,44. - Tỷ lệ mol của amoniac là 1,79. Sản phẩm đạt các chỉ tiêu định tính và định lượng của Dược điển Anh 2007. Phương pháp điều chế này với các nguyên liệu, điều kiện tiến hành đơn giản có thể áp dụng trong nước để sản xuất nifedipin. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bristish Pharmacopoiea (2007), CD-ROM. 2. JMP DOE Guide (2005), Release 6, SAS institute Inc, p. 103- 115. 3. Mathias Berwe et al.; Process for preparing nifedipine. US. Patent 6294673 B1 4. Pal Benko et al.,(1993); 1,4-dihydro-pyridine intermediates, US. Patent 5216157. 5. The United States Pharmacopeia 29 (2006), p.1528-1531. 6. Trần Thị Thu Hằng (2005), Dược lực học, NXB Phương Đông TP HCM, p. 525-544.