Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactic

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.000114 TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC Phạm Thị Mỹ*, Lê Thị Mai Tóm tắt: Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria, LAB) đã được tìm thấy và sử dụng nhiều trong các sản phẩm lên men truyền thống, theo điều kiện tự nhiên. Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh vi khuẩn lactic có khả năng sinh các chất kháng khuẩn, trong đó có bacteriocin (một loại kháng sinh sinh học có bản chất protein). Mục tiêu của nghiên cứu này là tuyển chọn những chủng vi khuẩn LAB có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao từ một số thực phẩm lên men tự nhiên, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Từ một số sản phẩm lên men (dưa chuột muối, rau cải muối, nem chua) đã phân lập được 9 chủng LAB và tuyển chọn được 3 chủng LAB (N1, D3, D5) có khả năng đối kháng cao với 2 chủng vi khuẩn chỉ thị. Đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của 3 chủng LAB tuyển chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hơp: môi trường MRS với pH 6,5 và nuôi ở 37 oC trong thời gian 48 h. Từ khóa: Bacteriocin, kháng khuẩn, lactic, vi khuẩn. 1. MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria, LAB) được xem là vi sinh vật an toàn (Generally Recognized as Safe, GRAS) và được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và y tế,... (Sabo et al., 2014). Những năm gần đây, nhóm vi khuẩn này được đánh giá là nguồn tiềm năng to lớn sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, được quan tâm nhiều nhất trong số đó là bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở ribosome ở cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) (Dobson et al., 2012). Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại (Cleveland et al., 2001; Dimov, 2007). Bacteriocin của vi khuẩn lactic được xem là một giải pháp mới hữu hiệu trong phòng, chống vi khuẩn gây bệnh và gây thối thực phẩm mà không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người do chúng bị thủy phân nhanh bởi các protease trong đường ruột của người (De Vuyst, Leroy, 2007; Zhang et al., 2010). Chính vì vậy nên không những chỉ LAB mà còn cả bacteriocin do vi khuẩn này sinh tổng hợp ra được nghiên cứu rộng rãi (Bromberg et al., 2004; Chen và Hoover, 2003). Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn của LAB chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như điều kiện lên men, các nguồn dinh dưỡng. Chính vì vậy sàng lọc, tuyển chọn những chủng LAB có hoạt tính đối kháng mạnh đồng thời nghiên cứu tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp là mục tiêu của nghiên cứu này. Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng *Email: ptmy@ued.udn.vn PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 919 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Một số thực phẩm lên men: Dưa chuột muối, rau cải muối, nem chua thu mua tại siêu thị Coopmart, Đà Nẵng. - Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu thực phẩm lên men nêu trên. - Chủng chỉ thị E. coli, B. subtilis được lấy từ Phòng thí nghiệm Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phân lập và định danh sơ bộ LAB: Cân chính xác 10 g mẫu cho vào bình nón chứa 90 mL môi trường MRS bổ sung nystatin với nồng độ 50 mg/L (Ishola R. O et al., 2012). Sau đó đem ủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 37 oC trong vòng 24 giờ. Thành phần môi trường MRS bao gồm: glucose (20 g); CaCO3(5 g); cao thịt (10 g); pepton (10 g); Cao nấm men (5 g), tween 80 (1 ml); K2HPO4 (2 g); CH3COONa (5 g); triamoni citrate (2 g); MgSO4.7H2O (0,58 g); MnSO4.4H2O (0,28 g); pH 7,0. Sau khi tăng sinh, pha loãng mẫu ở độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7. Hút 0,1 mL dịch ở các độ pha loãng cấy vào môi trường MRS agar có bổ sung nystatin với nồng độ 50 mg/L và ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc, sau đó làm thuần và bảo quản. Tiến hành một số thử nghiệm để định danh sơ bộ vi khuẩn lactic gồm nhuộm Gram, thử nghiệm catalase theo Ashmaig et al., (2009) và Karthikeyan & Santhosh (2009). - Kiểm tra khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann dựa vào nguyên tắc: acid lactic phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thử Uffelmann làm màu thuốc thử chuyển sang màu vàng sáng, dựa vào đó xác định được VK có sinh acid lactic hay không (Nguyễn Lân Dũng và nnk., 1972). - Phương pháp xác định khả năng di dộng của vi khuẩn: Chủng vi khuẩn được cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MRS đặc theo phương thẳng đứng ở 37 °C trong 48h. Nếu vi khuẩn mọc lan ra xung quang đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có tính di động. Nếu vi khuẩn mọc thẳng đứng theo đường cấy chứng tỏ không có khả năng di dộng (James G. C and Natalie, 2002). - Phương pháp đục lỗ thạch để nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của bacteriocin thô: chủng sinh tổng hợp bacteriocin được nuôi tăng sinh trên môi trường MRS lỏng ở nhiệt độ 37 °C sau 48 h, chuyển 1 ml vào ống Eppendoff rồi đem ly tâm 10000 vòng/ trong 10 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch nổi. Hút dịch nổi và đo pH ban đầu, rồi tiến hành điều chỉnh pH bằng NaOH 0,1 N để đưa về pH 6,5. Sau đó hút 10 µL dịch bacteriocin thô bơm vào giếng thạch đã đục lỗ với kích thước như nhau (đĩa thạch đã tra vi sinh vật kiểm định để khô). Tiến hành ủ các đĩa trong 48 h ở 37 oC, tiến hành quan sát và ghi nhận kích thước vùng kháng khuẩn xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn (Hwanhlen et al., 2011). - Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn: 920 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM + pH: Các chủng LAB được nuôi cấy lắc trên môi trường MRS lỏng với các giá trị pH khác nhau: pH 5, pH 5,5, pH 6, pH 6,5, pH 7, ở nhiệt độ 37 oC. + Nhiệt độ: Các chủng LAB được nuôi cấy lắc trên môi trong môi trường MRS lỏng có với pH chọn ở thí nghiệm trước, ở 4 mức nhiệt độ 25 oC, 30 oC, 37 oC, 45 oC. + Thời gian: Tiến hành nuôi cấy lắc các chủng LAB trên môi trường MRS lỏng có pH và nhiệt độ được chọn ở các thí nghiệm trước, sau đó tại các mốc thời gian 24 h, 48 h và 72 h lần lượt tiến hành thu dịch thể đem đi thử hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị. Các thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn được đánh giá thông qua đường kính vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của dịch thể sau khi ly tâm và điều chỉnh pH về 6,5 theo các điều kiện nuôi cấy khác nhau. - Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu phân tích từ các thí nghiệm được tính toán thống kê bằng chương trình SPSS. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn lactic Đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn từ một số mẫu thực phẩm lên men tự nhiên (dưa chuột muối, rau cải muối, nem chua). Kết quả cho thấy, đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng rất đa dạng và đều có khả năng sinh acid lactic khi thử nghiệm trên môi trường MRS (Bảng 1). Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng LAB đã phân lập được TT Nguồn phân lập Kí hiệu chủng Hình dạng tế bào Gram Khả năng di động Hoạt tính catalase Khả năng sinh acid lactic Hình thái khuẩn lạc, kích thước 1 Dưa chuột muối D1 Cầu + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng ngà, 1,8 - 2 mm 2 D3 Que ngắn + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa, 0,8 - 1 mm 3 D5 Cầu + - - + Tròn, trơn, nhẵn, trắng đục 1 - 1,2 mm 4 Rau cải muối R1 Que ngắn + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa, 0,2 - 0,5 mm 5 R2 Cầu + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa, 0,6 - 0,8 mm 6 R4 Que ngắn + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa 0,8 - 1 mm 7 Nem chua N1 Cầu + - - + Tròn, trơn nhẵn, màu trắng ngà, 1,8 - 2 mm 8 N2 Que ngắn + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa, 0,8 - 1,2 mm 9 N7 Que + - - + Tròn, trơn nhẵn, trắng sữa, 0,8 - 1,25 mm PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 921 Kết quả nghiên cứu đặc điểm tế bào cho thấy hình dạng của 9 chủng phân lập được chủ yếu hình que ngắn hoặc hình cầu và hình thái khuẩn lạc chủ yếu tròn, trơn nhẵn, màu trắng sữa hoặc trắng ngà, kích thước các khuẩn lạc từ nhỏ khoảng 0,5-1,3 mm, mọc riêng rẽ, các chủng đều có khả năng sinh axit lactic, âm tính với phản ứng catalase, không có khả năng di động và đều Gram (+). Bước đầu nhận định 9 chủng vi khuẩn này xác suất cao là các chủng LAB. Tiếp theo, chúng tôi sử dụng 9 chủng vi khuẩn này để tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn cao nhất. 3.2. Tuyển chọn chủng LAB sinh chất kháng khuẩn Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng LAB đã phân lập được với vi khuẩn kiểm định E. coli và B. subtilis được thể hiện trong Hình 1 và Bảng 2. Hình 1. Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị của 9 chủng LAB Từ kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị của các chủng LAB phân lập được nhóm nghiên cứu đo được kích thước vòng kháng khuẩn. Kết quả được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2. Đường kính vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của 9 chủng LAB STT Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (∆D mm) E. coli B. subtilis 1 D1 13,33a 7,67a 2 D3 18,33b 12,67b 3 D5 20,33bc 17,67c 4 R1 14ae 8,67ae 5 R2 12,33af 10bf 6 R4 - - 7 N1 17,33bd 16d 8 N4 - - 9 N7 - - * Các mẫu tự khác nhau (a, b, c, d, e, f) biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%. 922 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Kết quả nghiên cứu ở Bảng 2 và Hình 1 cho thấy, trong 9 chủng LAB phân lập được có 6 chủng (D1, D3, D5, R1, R2, N1) có khả năng đối kháng với 2 chủng chỉ thị và 3 chủng còn lại (R4, N4, N7) không thể hiện khả năng ức chế 2 chủng chỉ thị. Tuy nhiên, khả năng đối kháng của mỗi chủng là khác nhau và khác nhau đối với từng chủng chỉ thị. Cụ thể là trong 6 chủng có khả năng đối kháng với 2 chủng chỉ thị thì nhận thấy rằng có 3 chủng (N1, D3, D5) là những chủng có hiệu lực ức chế mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng là: ∆DE(N1) = 17,33abd mm, ∆DB(N1) = 16d mm, ∆DE(D3)= 18,33b mm, ∆DB(D3)= 12,67b mm và ∆DE(D5) = 20,33bc mm, ∆DB(D5) = 17,67c mm. Kết quả này khả quan hơn so với kết quả nghiên cứu của Ngô Thị Phương Dung và nnk. (2011), trong 46 dòng LAB phân lập từ dưa cải muối chua, kim chi, sữa chua vinamilk, sữa chua uống yakul, nem chua, men tiêu hóa đông khô, chỉ 10 dòng sinh ra chất bacteriocin chống lại vi khuẩn chỉ thị B. subtilis , trong đó chỉ có dòng DC213A có đường kính vòng vô khuẩn rộng nhất là 22 mm. Trong một nghiên cứu khác của Onda et al. (1999), chỉ có 1 trong 125 dòng LAB phân lập từ các sản phẩm Miso của Nhật Bản biểu hiện tính kháng khuẩn đối với hai dòng chỉ thị B. subtilis JCM1465 và Staphylococcus aureus JCM1465. Như vậy, sau khi khảo sát khả năng kháng 2 chủng vi khuẩn chỉ thị của 9 chủng LAB phân lập được thì thấy có 3 chủng D3, D5, N1 có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn các chủng còn lại. Vì thế, 3 chủng D3, D5, N1 được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn của 3 chủng LAB được tuyển chọn Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy pH môi trường có tác động đáng kể vào sự tăng trưởng và khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn đặc biệt là bacteriocin của LAB (Todorov et al., 2005). Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS ở 37 oC với pH thay đổi trong khoảng từ 5-7. Kết quả ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị của 3 chủng LAB (N1, D3, D5) khi nuôi trong môi trường MRS ở các giá trị pH khác nhau Chủng pH Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị (mm) N1 D3 D5 E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis 5 12,67a 10,33a 14,67b 11,00ab 12,67ac 14,67c 5.5 15,67a 14,67a 16,67ab 12,67ab 17bc 16ac 6 17,33bd 16d 18,33b 12,67b 20,33bc 17,67c 6.5 20,67a 17,67a 19,33ab 16,67b 22,33c 19,33c 7 16,33a 11,33a 13,33b 12,33ab 16,67ac 16,33c * Các mẫu tự khác nhau (a, b, c, d) biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dòng) ở độ tin cậy 95%. Kết quả ở Bảng 3 cho thấy pH môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn của 3 chủng N1, D3, D5 tuy nhiên với mức độ không nhiều. Khi tăng dần giá trị pH từ 5 đến 6,5 thì hoạt tính ức chế sự phát triển của vi khuẩn PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 923 chỉ thị tăng lên và đạt giá trị cực đại tại pH = 6,5 với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20,67a mm, ∆DB(N1) = 17,67a mm, ∆DE(D3) = 19,33ab mm, ∆DB(D3) = 16,67b mm và ∆DE(D5) = 22,33c mm, ∆DB(D5) = 19,33c mm. Tiếp tục tăng pH lên 7 thì nhận thấy hoạt tính ức chế giảm đi. Điều này chứng tỏ rằng tại pH 6,5, 3 chủng LAB thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị cao nhất. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước. Todorov và Dicks (2005), khi khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn L. plantarum ST194BZ ở các điều kiện pH khác nhau cũng cho hoạt tính bacteriocin cao nhất với pH môi trường là 6,5. Theo nghiên cứu của Patil et al., 2011, chủng Pediococcus acidilactici MPK1 sinh hoạt tính mạnh nhất ở pH 7. Còn đối với chủng L. plantarum SC01 sinh hoạt tính mạnh nhất ở pH 6 (Lê Ngọc Thùy Trang và Phạm Minh Nhựt, 2014). Thông qua những nghiên cứu này có thể thấy, mặc dù đều thuộc nhóm LAB nhưng đối với mỗi chủng phân lập từ các nguồn mẫu khác nhau ở mỗi vùng khác nhau thì chúng có khả năng phát triển tốt ở một giá trị pH khác nhau. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp các hợp chất của vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng và nnk., 1998). Với mục đích xác định được nhiệt độ tối thích cho quá trình tổng hợp các chất, kháng khuẩn, nhóm nghiên cứu tiến hành thí nghiệm khảo sát trên môi trường MRS ở pH 6,5 và nuôi ở dải nhiệt độ là 25 oC, 30 oC, 37 oC, 45 oC. Kết quả thể hiện ở Bảng 4. Dựa vào Bảng 4, nhận thấy rằng khi tăng nhiệt độ nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn của 3 chủng VK N1, D3, D5 cũng tăng dần và đạt cực đại ở khoảng 37 oC với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20,67a mm, ∆DB(N1) = 17,67a mm, ∆DE(D3) = 19,33ab mm, ∆DB(D3)= 16,67b mm và ∆DE(D5) = 22,33c mm, ∆DB(D5) = 19,33c mm, nhưng tiếp tục tăng nhiệt độ lên 45 oC thì khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị lại giảm. Kết quả này trùng khớp với nghiên cứu của Todorov và Dicks (2005) trước đó. Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy 37 oC là nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy các chủng LAB sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất. Bảng 4. Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị của 3 chủng LAB (N1, D3, D5) khi nuôi trong môi trường MRS ở các mức nhiệt độ Chủng t°C Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị (mm) N1 D3 D5 E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis 25 °C 12a 10,67a 12,33ab 12,33ab 14,67abc 12c 30 °C 17a 16a 15,33b 13ab 16,67bc 14,67bc 37 °C 20,67a 17,67a 19,33ab 16,67b 22,33c 19,33c 45 °C 17,33a 15,67a 17b 14b 19,33ac 17,33c *Các mẫu tự khác nhau (a, b, c) biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dòng) ở độ tin cậy 95%. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Để kiểm tra ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB, nhóm nghiên cứu tiến hành nuôi 3 chủng LAB (N1, D3, D5) 924 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM trên môi trường MRS ở pH 6,5, nhiệt độ 37 oC và thu nhận dịch vi khuẩn tại 3 thời điểm khác nhau: 24 h, 48 h và 72 h. Kết quả được thể hiện ở Bảng 5. Bảng 5. Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị của 3 chủng LAB (N1, D3, D5) tại các thời điểm khác nhau Chủng Thời gian Kích thước vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị (mm) N1 D3 D5 E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis 24h 8,33a 8,33a 6,33b 6,33ab 8,67bc 8bc 48h 20,67a 17,67a 19,33ab 16,67b 22,33c 19,33c 72h 15,67a 16,33a 17ab 14b 18,67ac 17,33bc *Các mẫu tự khác nhau (a, b, c) biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dòng) ở độ tin cậy 95%. Kết quả đo kích thước vòng ức chế 2 chủng VK chỉ thị ở Bảng 5 cho thấy, khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của 3 chủng LAB phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy. Tại thời điểm sau 48h nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn ở cả 3 chủng N1, D3, D5 đều cho kết quả cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20,67a mm, ∆DB(N1) = 17,67a mm, ∆DE(D3)= 19,33ab mm, ∆DB(D3)= 16,67b mm và ∆DE(D5) = 22,33c mm, ∆DB(D5) = 19,33c mm. Khi tiếp tục tăng thời gian nuôi cấy lên 72h thì thấy rằng đường kính vòng ức chế các chủng VK chỉ thị giảm đi. Trong nghiên cứu này chỉ thực hiện ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn thông qua vòng kháng khuẩn và nhận thấy hoạt tính ở 48h là mạnh nhất, đây là cũng là thời điểm vi khuẩn lactic sinh trưởng mạnh nhất và sinh khối đạt cực đại, do đó khả năng sinh các hợp chất cũng là lớn nhất và có hoạt tính mạnh nhất. Tiếp tục tăng thời gian nuôi cấy, vi khuẩn bước vào pha suy vong, tế bào trở nên già và chết đi dẫn đến khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sơ cấp cũng giảm đi, đồng thời hoạt tính kháng khuẩn cũng bị giảm theo thời gian. Bên cạnh đó, khi vi khuẩn bước vào pha suy vong sẽ có nhiều tế bào bị chết, tự phân/vỡ tế bào giải phóng một loạt các chất bên trong tế bào. Các chất này có thể là nguồn dinh dưỡng bổ sung giúp các tế bào còn sống tăng sinh thêm lần nữa (gọi là sinh trưởng rốn/sinh trưởng thêm) nhưng cũng có thể là nguồn chất ức chế sinh trưởng (VD: các protease được giải phóng) sẽ dẫn đến kích thích các tế bào còn lại tự phân/tự vỡ tế bào. Protease giải phóng từ bên trong tế bào ra ngoài môi trường có thể xúc tác thủy phân các bacteriocin bên ngoài môi trường, làm mất hoạt tính của bacteriocin (vì bacteriocin có bản chất peptides). Nếu chất kháng khuẩn không có bản chất protein thì nó có thể bị trung hòa, bị bất hoạt bởi các chất do tế bào chết tiết ra hoặc đơn giản là chúng không bền nên thời gian càng lâu chúng càng giảm hoạt tính (Wood & Holzapfel, 1995; Nguyễn Lân Dũng, 1998). Từ các nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu đã tìm ra điều kiện thích hợp để thu được các chất kháng khuẩn lớn nhất đối với 3 chủng LAB (N1, D3, D5) đó là: môi trường MRS ở pH 6,5, nhiệt độ 37 oC và thu nhận sau 48 h nuôi cấy. 4. KẾT LUẬN Từ một số sản phẩm lên men (dưa chuột muối, rau cải muối, nem chua) đã phân lập được 9 chủng LAB và tuyển chọn được 3 chủng LAB (N1, D3, D5) có khả năng đối PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 925 kháng mạnh với hai chủng vi khuẩn chỉ thị. Đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn của 3 chủng LAB tuyển chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu được các chất kháng khuẩn lớn nhất: môi trường MRS với pH 6,5 và nuôi ở 37 oC trong thời gian 48 h. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashmaig A., Hasan A., El Gaali E., 2009. Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional Sudanese fermented camel’s milk (Gariss). Afr. J. Microbiol. Res., 3(8): 451-457. Bromberg R., Moreno I., Zaganini C. L., Delboni R. R., Oliveira J. D., 2004. Isolation of bacteriocin- producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity. Braz. J. Microbiol., 35 (1): 1678-4405. Chen H. and Hoover D. G., 2003. Bacteriocins and the