Ứng dụng kỹ thuật fish (Fluorescent in situ hybridization) trong chẩn đoán đột biến gen elastin gây hội chứng Williams‐Beuren

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 25 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH (FLUORESCENT IN SITU  HYBRIDIZATION) TRONG CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN ELASTIN   GÂY HỘI CHỨNG WILLIAMS‐BEUREN    Nguyễn Thị Băng Sương*  TÓM TẮT Mở đầu: Hội chứng Williams‐Beuren (WBS) là bệnh di truyền trội do đột biến mất đoạn gen Elastin nằm ở  locus 7q11.23 trên trên nhiễm sắc thể số 7. Hội chứng gây ra nhiều tổn thương, đặc biệt là ở hệ tim mạch. Chẩn  đoán xác định bệnh có ý nghĩa quan trọng trong tiên lượng các dị tật cũng như định hướng điều trị cho bệnh  nhân. Ở Việt Nam, việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán xác định WBS còn rất hạn  chế.  Mục tiêu: Chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội chứng Williams bằng kỹ thuật FISH.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Những bệnh nhân được chẩn đoán Williams‐Beuren trên lâm  sàng với vẻ mặt điển hình và các tổn thương tim mạch đặc hiệu cũng như đã có kết quả dương tính với phản  ứng MLPA. Tiến hành kỹ thuật FISH để xây dựng quy trình.    Kết quả: Tất cả các bệnh nhân đều dương tính với phản ứng FISH.   Kết luận: Như vậy kỹ thuật FISH là phương pháp sinh học phân tử có thể ứng dụng trong chẩn đoán xác  định WBS ở Việt Nam.  Từ khóa: 7q11.23, FISH, MLPA, vi mất đoạn, Williams‐Beuren.  ABSTRACT  APPLICATION OF FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION FOR DIAGNOSIS OF MUTATIONS  IN ELASTIN GENE WHICH CAUSE WILLIAMS‐BEUREN SYNDROME  Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 24 ‐ 28  Introduction: Williams‐Beuren syndrome (WBS) is the dominant genetic disease caused by a mutation in  Elastin gene which  locates  in 7q11.23  of  region  on  chromosome 7. Most  of mutations  is deletion. Syndrome  caused many injuries, especially in the cardiovascular system. In many countries, FISH has been used for genetic  diagnosis of William‐Beuren syndrome.  Objectives: Diagnosis of mutations in Elastin gene by fluorescent in situ hybridization technique.   Patients  and methods:  Five patients were diagnosed William‐Beuren based on  clinical and  subclinical  diagnostic results. In addition, DNA of all these patients were analysed by multiplex ligation‐dependent probe  applification technique and we found that their Elastin gene were deleted. Design FISH procedure to diagnose  William‐Beuren syndrome.  Results: All five patients were positive with FISH reaction, their Elastin gene showed mutations.  Conclusions: We have successfully applied the FISH technique for the diagnosis of William-Beuren syndrome. Keywords: 7q11.23, FISH, MLPA, deletion, Williams‐Beuren.  ĐẶT VẤN ĐỀ Sự  mất  đoạn  có  kích  thước  từ  1,55  đến  1,85Mb  trên nhiễm  sắc  thể  số 7,  liên quan  đến  26‐28 gene,  được  cho  là nguyên nhân gây nên  * Đại học Y Dược TP.HCM   Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương,   ĐT: 0914007038,   Email: suongnguyenmd@gmail.com.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  26 hội  chứng  Williams‐Beuren  (WBS,  Williams‐ Beuren  syndrome). Ước  tính  trên  thế giới  tỷ  lệ  mắc  bệnh  là  1/10000  ca  sinh,  trong  đó  sự mất  đoạn 1,55Mb chiếm phần  lớn. Gen Elastin, nằm  giữa vùng mất  đoạn,  có vai  trò  rất quan  trọng  trong chức năng của cơ thể. Sự đột biến làm mất  đi gene này gây ra các dị tật đặc trưng nhất của  hội  chứng Williams‐Beuren  như  hẹp  trên  van  động mạch  chủ, hẹp  động mạch phổi ngoại vi  hay bất thường của động mạch nuôi cơ(2,12,13).  Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về đột  biến gene gây nên hội chứng WBS và phát triển  các phương pháp  chẩn  đoán  sinh học phân  tử  khác nhau, mỗi phương pháp có các ưu nhược  điểm khác nhau(6,10,12).   Ở  Việt  Nam,  những  nghiên  cứu  trên  hội  chứng WBS vẫn  còn hạn  chế. Hiện nay  tại  các  trung  tâm phẫu  thuật  tim mạch  trong  cả nước  nói  chung  và  tại  thành  phố Hồ Chí Minh  nói  riêng,  bệnh  nhân  được  chẩn  đoán  hội  chứng  Williams chỉ dựa vào các đặc điểm hình thể đặc  trưng, nhất là khuôn mặt gợi ý, tính cách cởi mở  và  đặc  biệt  là  tổn  thương  hẹp  trên  van  động  mạch  chủ  và/hoặc  hẹp  động  mạch  phổi  chứ  chưa có chẩn đoán phân tử chính xác. Mặc khác,  những  trẻ  em mắc hội  chứng Williams  nhưng  không có biểu hiện tim mạch thì hầu như bị bỏ  sót  chẩn  đoán.  Việc  chẩn  đoán  chính  xác  hội  chứng  Williams  bằng  phương  pháp  sinh  học  phân  tử  sẽ giúp nâng  cao khả năng phát hiện  bệnh cũng như thiết lập cơ sở cho việc theo dõi  lâu dài cũng như có những biện pháp tư vấn, hỗ  trợ thích hợp.  Tiêu  chuẩn  vàng  giúp  chẩn  đoán  bệnh  là  phân  tích phát hiện đột biến gen,  trong đó đột  biến  gen  Elastin  là  nguyên  nhân  chủ  yếu  gây  bệnh(11). Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã ứng  dụng thành công quy trình chẩn đoán đột biến  mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Tuy  nhiên một số tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có  giá trị đặc hiệu cao trong xác định đột biến gen  Elastin. FISH  là một kỹ  thuật phân  tích nhiễm  sắc thể sử dụng các probe gene elastin chuẩn bị  sẵn. Nếu một bệnh nhân có hai copy ELN (mỗi  copy nằm trên một nhiễm sắc thể số 7) thì người  này  không mắc  hội  chứng Williams. Nếu một  người chỉ có một copy ELN thì được chẩn đoán  mắc  hội  chứng  này.  Gần  như  tất  cả  (98‐99%)  bệnh nhân mắc hội chứng Williams có mất đoạn  gene ELN cùng với 26 gene khác(4).  Một khi  tuổi  thọ bệnh nhân mắc hội chứng  Williams được tăng lên thì khả năng kết hôn và  sinh  con  có  thể  xảy  ra. Trong  trường hợp này  chẩn đoán xác định bằng phương pháp phân tủ  sẽ  tạo  điều kiện  cho  tư vấn di  truyền và  chẩn  đoán  trước  sinh. Xuất phát  từ nhu  cầu  thực  tế  trên,  chúng  tôi  tiến  hành  đề  tài  “Ứng  dụng  kỹ  thuật  FISH  (Fluorescence  In  Situ  Hybridization)  trong chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội  chứng Williams”  ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP  Đối tượng nghiên cứu  Nhóm chứng  10  nam  và  10  nữ  bình  thường,  tiền  sử  gia  đình không có ai mắc bệnh di truyền.  Nhóm nghiên cứu  5  bệnh  nhân  (2  nam  và  3  nữ)  được  chẩn  đoán mắc phải hội chứng Williams‐Beuren dựa  vào các  triệu chứng  lâm sàng, cận  lâm sàng và  đã  được  xác  định  có  đột  biến mất  đoạn  gen  Elastin bằng kỹ thuật MLPA.  Phương pháp nghiên cứu  Lấy mẫu xét nghiệm  Lấy 5 ml máu ngoại biên trong ống nắp xanh  lá cây chứa heparin. Tiến hành ly tâm thu bạch  cầu,  trữ  trong dung dịch  fixative  (3 methanol:1  acid acetic)   Tiến hành kỹ thuật FISH   Quy trình FISH được thực hiện theo hướng  dẫn của kit Vysis (Abbott). Theo đó các mẫu dò  và mẫu được biến tính ở 73oC trong 5 phút và lai  qua  đêm  ở 37oC. Sau bước  rửa, DAPI  được  sử  dụng như màu nền. Mẫu sẽ được quan sát dưới  kính hiển vi huỳnh quang Leika DM2000. Hiện  nay,  theo  hãng  sản  xuất,  các  probe  và  màu  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 27 tương ứng được sử dụng là: WS ‐ LSI ELN (màu  cam)/ LSI D7S486, D7S522 (màu xanh lá).   Xử lý mẫu  Nhược  trương  tế bào bằng dung dịch KCL  0,56%.  Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy.  Nhỏ  cặn  tế bào  lên  lam kính  sạch  đã  đánh  dấu sẵn vùng lai.  Biến  tính DNA  đích  bằng  dung  dịch  biến  tính Formamide 70%/2X SSC.  Khử dung dịch biến tính bằng cồn 70%, 85%,  100%.  Tiến hành phản ứng lai giữa DNA dò với DNA  đích và rửa sau lai  Nhỏ 3 μl DNA dò lên vùng vừa lai đã được  đánh dấu.  Đậy  lá kính mỏng  lên vùng vừa  lai và dán  viền xung quanh bằng dung kịch keo.  Ủ tiêu bản ở 37°C qua đêm.  Bỏ lá kính mỏng và lớp keo dán ra khỏi tiêu  bản.  Lần  lượt  rửa  tiêu bản  trong hai dung dịch  rửa Formamide 50%/4X SSC và 2X SSC.  Rửa sạch bằng dung dịch PBS pH7,4.  Nhuộm, quan sát và phân tích tiêu bản  Nhỏ 10 μl  thuốc nhuộm DAPI  lên vùng  lai  trên tiêu bản. Rửa bằng dung dịch PBS pH 7,4.  Nhỏ  dung  dịch  DABCO  chống  bay  màu  thuốc thuộm lên vùng lai, đậy lá kính mỏng lên  và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.  Đánh giá, phân tích kết quả lai theo chỉ dẫn  của hãng sản xuất.  KẾT QUẢ  Nhóm  chứng  thực  hiện  phản  ứng  FISH  đồng thời với mẫu bệnh nhân nhằm để so sánh.  Trong đó nhóm chứng sẽ cho kết quả có 2 vị trí  phát tín hiệu huỳnh quang màu cam và 2 vị trí  phát  tín hiệu huỳnh quang màu xanh  lá  (Hình  1A). Kết quả phản  ứng FISH  của 5 bệnh nhân  dưới dạng hình ảnh được trình bày ở hình 1B.   Hình 1: Kết quả FISH. A: Người bình thường, có hai  huỳnh quang màu xanh và hai huỳnh quang màu đỏ;  B: Bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gây hội chứng  Williams‐Beuren, chỉ xuất hiện hai huỳnh quang  màu xanh và một huỳnh quang màu đỏ.  BÀN LUẬN  Từ khi FISH ra đời, kỹ thuật này được ứng  dụng cho chẩn đoán các bệnh liên quan đến rối  loạn  nhiễm  sắc  thể.  So  sánh  với  các  phương  pháp ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác  như  real‐time  PCR, microsatellite,  FISH  vẫn  là  tiêu chuẩn vàng được các phòng xét nghiệm trên  thế giới sử dụng  làm cơ sở để kiểm chứng kết  quả.  Mặc  dù  FISH  là  một  phương  pháp  tốn  nhiều công  lao động, đòi hỏi  thời gian và sự  tỉ  mỉ, không thể tự động hóa được. Thêm vào đó,  các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất độc hại.  Tuy  nhiên  về  mặt  hiệu  quả  của  xét  nghiệm,  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  28 FISH có độ ổn định cao hơn so với MLPA. Đặc  biệt  là đối với các dạng đột biến mất đoạn dài  trên nhiễm sắc thể như ở hội chứng WBS(6,10).  Một kỹ  thuật khác cũng được phát  triển để  chuẩn đoán WBS  là  real‐time PCR  (hay QPCR,  PCR  định  lượng).  Đây  cũng  được  coi  là một  chiến lượng hay vì nguyên tắc không quá phức  tạp,  thao  tác  cũng  đơn  giản  có  thể  tự  động  hóa(7,14). Tuy nhiên,  thực hiện kỹ  thuật này  cần  thiết bị hiện đại, quá trình chuẩn hóa và thiết kế  gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật đặc biệt là trình  tự đặc  trưng. Bên  cạnh  đó  số  lượng phản  ứng  cần  thiết  cho một  xét nghiệm  (thường phải  sử  dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều vùng  mục  tiêu  trên  vùng Williams‐Beuren)  làm  cho  giá thành của phương pháp này có thể tăng cao.  Phương pháp sử dụng microsatellite cho độ  nhạy khá cao cũng như có thể phán đoán được  kích thước của trình tự bị mất và giá thành rẻ(5).  Tuy nhiên phương pháp này  lại có  thể cho kết  quả âm tính giả do chỉ kiểm tra gián tiếp sự tồn  tại của vùng gene mục tiêu. Vì vậy có thể bỏ sót  một số trường hợp.  Trong nghiên  cứu,  chúng  tôi  đã  ứng dụng  thành công kỹ thuật FISH trong chẩn đoán WBS.  Kết  quả  của  chúng  tôi  thu  được  cho  thấy  các  bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng,  cũng như đã dương  tính với phản  ứng MLPA   đều  cho  kết  quả  có  đột  biến  mất  đoạn  gen  Elastin.  Cả  5  bệnh  nhân  tham  gia  vào  nghiên  cứu đều cho kết quả giống nhau với mất đoạn  gen Elastin trên một allen, đây là dạng mất đoạn  điển hình ở các bệnh nhân WBS. Bệnh di truyền  trội  trên nhiễm sắc  thể  thường nên chỉ cần đột  biến  trên  1  allele  đã  biểu  hiện  kiểu  hình  đặc  trưng  của  hội  chứng WBS.  Điều  này  phù  hợp  với các nghiên cứu của Bayes M và Dutra RL(0, 4).    Kết quả FISH đối với bố và mẹ của hai bệnh  nhân  trong  số 5 bệnh nhân  được khảo  sát  cho  kết quả âm tính (không được hiển thị), ở cả hai  gia  đình,  người  bố  và mẹ  đều  là  người  bình  thường  không mang  gen  bệnh.  Như  vậy  đột  biến  ở bệnh nhân  là  đột biến  tự phát  sinh chứ  không phải do di  truyền  từ  bố hoặc mẹ.  Điều  này  cũng  hoàn  toàn  hợp  lý  với  cơ  chế  gây  ra  WBS, do sự sai hỏng trong quá trình tái tổ hợp  tương  đồng  ở  quá  trình  giảm  phân  tạo  giao  tử(18,12). Tuy nhiên khi những người mắc phải hội  chứng này lớn lên, lập gia đình thì khả năng gây  bệnh cho người con  là 50%(11). Do vậy cần phải  chẩn đoán hội chứng WBS để có hướng điều trị  hợp lý, tránh xảy ra trường hợp đột tử do nguy  cơ  tim  mạch,  cũng  như  giúp  quản  lý  sự  lan  truyền gen bệnh trong cộng đồng.  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ những bàn luận ở trên chúng tôi kết luận  rằng  FISH  là một  phương  pháp  cần  được  sử  dụng làm nền tảng cho các phương pháp khác ở  các  phòng  thí  nghiệm,  phù  hợp  với  điều  kiện  của  Việt  Nam  trong  chẩn  đoán  các  bệnh  di  truyền nói chung và bệnh Williams‐Beuren nói  riêng.   Vì  những  nghiên  cứu WBS  trên  quần  thể  người Việt Nam  là chưa  rộng  rãi nhưng  lại  rất  cần thiết, chúng tôi đề nghị cần có những nghiên  cứu  lớn  hơn,  trong  đó  sử  dụng  phương  pháp  FISH đề khảo sát là rất phù hợp.  TÀI LIỆU THAM KHẢO   1. Bayes M, Magano LF, Rivera N, Flores R, Perez  Jurado LA  (2003). Mutational mechanisms of Williams‐Beuren syndrome  deletions. Am J Hum Genet, 73: 131‐51.  2. Burn J. (1986) Williams syndrome. J Med Genet, 23: 389‐95.  3. Deutsch  SI,  Rosse  RB,  Schwartz  BL  (2007).  Williams  syndrome: a genetic deletion disorder presenting clues to the  biology  of  sociability  and  clinical  challenges  of  hypersociability. CNS Spectr, 12: 903‐7.  4. Dutra RL, Honjo RS, Kulikowski LD, Fonseca FM, Pieri PC,  Jehee FS, Bertola DR, Kim CA (2012). Copy number variation  in Williams‐Beuren syndrome: suitable diagnostic strategy for  developing countries. BMC Res Notes, 5, 13.  5. Dutra RL, Pieri Pde C, Teixeira AC, Honjo RS, Bertola DR,  Kim CA (2011). Detection of deletions at 7q11.23 in Williams‐ Beuren  syndrome  by  polymorphic  markers.  Clinics  (Sao  Paulo), 66: 959‐64.  6. Eronen M,  Peippo M,  Hiippala  A,  Raatikka M,  Arvio M,  Johansson  R,  Kahkonen  M  (2002).  Cardiovascular  manifestations in 75 patients with Williams syndrome. J Med  Genet, 39: 554‐8.  7. Howald C, Merla G, Digilio MC, Amenta S, Lyle R, Deutsch  S,  Choudhury  U,  Bottani  A,  Antonarakis  SE,  Fryssira  H,  Dallapiccola  B,  Reymond  A  (2006).  Two  high  throughput  technologies  to  detect  segmental  aneuploidies  identify  new  Williams‐Beuren syndrome patients with atypical deletions. J  Med Genet, 43: 266‐73.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 29 8. Kozlowski  P,  Jasinska  AJ,  Kwiatkowski  DJ  (2008).  New  applications  and  developments  in  the  use  of  multiplex  ligation‐dependent  probe  amplification.  Electrophoresis,  29:  4627‐36.  9. Lowery MC, Morris  CA,  Ewart A,  Brothman  LJ,  Zhu  XL,  Leonard  CO,  Carey  JC,  Keating  M,  Brothman  AR  (1995).  Strong correlation of elastin deletions, detected by FISH, with  Williams  syndrome:  evaluation of  235 patients. Am  J Hum  Genet, 57: 49‐53.  10. Merla G, Brunetti‐Pierri N, Micale L, Fusco C  (2010). Copy  number  variants  at  Williams‐Beuren  syndrome  7q11.23  region. Hum Genet, 128: 3‐26.  11. Metcalfe K, Simeonov E, Beckett W, Donnai D, Tassabehji M  (2005). Autosomal dominant  inheritance of Williams‐Beuren  syndrome  in  a  father  and  son with  haploinsufficiency  for  FKBP6. Clin Dysmorphol, 14: 61‐5.  12. Pober BR (2010). Williams‐Beuren syndrome. N Engl J Med,  362: 239‐52.  13. Pober  BR,  Johnson  M,  Urban  Z  (2008).  Mechanisms  and  treatment  of  cardiovascular  disease  in  Williams‐Beuren  syndrome. J Clin Invest, 118: 1606‐15.  14. Schubert  C,  Laccone  F  (2006). Williams‐Beuren  syndrome:  determination  of  deletion  size  using  quantitative  real‐time  PCR. Int J Mol Med, 18: 799‐806.  Ngày nhận bài         29/08/2013.  Ngày phản biện nhận xét bài báo   04/09/2013.  Ngày bài báo được đăng:    18/10/2013