Xây dựng quy trình định lượng glucosamin bằng phương pháp hplc với đầu dò PDA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 157 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Nguyễn Lục Thơ*, Nguyễn Thị Chung**, Nguyễn Đức Tuấn*** TÓM TẮT Mục tiêu: Hiện nay, glucosamin đã được Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh. Glucosamin được định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo, đầu dò PDA. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đãđược khảo sát như tốc độ dòng, thành phần và tỷ lệ dung môi pha động. Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm acetonitril – đệm phosphat pH 3 có triethylamin (35:65, tt/tt), bước sóng phát hiện 195 nm, tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng từ 600 – 1400 µg/ml, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác. Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng glucosamin. Quy trình đã được áp dụng để định lượng glucosamin trong viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ hòa tan. Từ khóa: Glucosamin, sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLUCOSAMINE BY HPLC WITH PDA DETECTOR Nguyen Luc Tho, Nguyen Thi Chung, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 157 - 161 Objective: Currently, glucosamine has been approved as a drug for improving arthritis by the European Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA). The aim of the study was to develop a HPLC-PDA method for quantitative determination of glucosamine. Subjects and Methods: The subject of this study was glucosamine sulfate 750 mg fast-release coated-film tablets. Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity. Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of glucosamine, using an Ascentic RP C8 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mixture of acetonitrile and phosphate buffer pH 3.0 containing triethylamine (35:65, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 0.5 ml/min., and detection wavelength of 195 nm. The method was shown high selectivity, wide linearity range from 600 to 1,400 * Sở Y tế Đồng Nai ** Hội Dược học TP. Hồ Chí Minh *** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Lục Thơ - ĐT: 0913799068 -- Email:diemnhim@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 158 μg mL−1. Intra-day relative standard deviation was below 2% and the recovery range was 98% - 102%. Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully developed for quantitative determination of glucosamine. The validated method was applied for quantitative determination of glucosamine in glucosamine sulfate 750 mg fast-release tablet, and of glucosamine released from dissolution test. Key words: Glucosamine, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh xương khớp đang là vấn đề lớn của xã hội vì nó có thể làm người bệnh tàn phế, suy giảm sức lao động. Trong nhiều thập niên qua, việc điều trị viêm khớp chủ yếu là dùng các thuốc kháng viêm giảm đau nhằm mục đích giảm các triệu chứng đau và hạn chế vận động khớp viêm cho người bệnh.Tuy nhiên những thuốc này có rất nhiều tác dụng phụ và thường không cải thiện được tình trạng bệnh lý của sụn khớp bị hư hỏng. Theo khuyến cáo của Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA), glucosamin được xem là thuốc có hiệu quả và có nhiều ưu điểm hơn các thuốc kháng viêm non- steroid do có rất ít tác dụng phụ. Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, vì vậy đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg (tương đương với glucosamin sulfat kali clorid 1000 mg) giải phóng nhanh, số lô: 121009, hạn dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Ampharco (USA). Trang thiết bị, hóa chất, dung môi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996. Cân phân tích Sartorius BP221S. Máy đo pH Metrohm 744. Bể siêu âm Elma. Hóa chất, dung môi Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Merck).Acid phosphoric, kali hydroxyd, triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc glucosamin là một base hữu cơ và tham khảo chuyên luận glucosamin trong Dược điển Việt Nam IV (1), kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo được áp dụng với pha động bao gồm dung dịch đệm phosphat pH 3 và acetonitril, sắc ký đồ được ghi tại bước sóng 195 nm. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như tốc độ dòng, tỷ lệ dung môi pha động, thêm vào pha động triethylamin (TEA) để cải thiện hệ số đối xứng của pic glucosamin. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, sẽ tiến hành thẩm định quy trình theo hướng dẫn của ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Sau khi được thẩm định, quy trình này sẽ được ứng dụng để định lượng glucosamin trong viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ hòa tan. Chuẩn bị mẫu và dung dịch đệm Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác 100 mg glucosamin HCl, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 65 ml nước, siêu âm 5 phút. Thêm nước vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Dung dịch mẫu thử:Lấy 20 viên bao phim bất kỳ, lột bỏ màng bao, cân khối lượng viên nhân, nghiền mịn, trộn đều, tính khối lượng trung bình 1 viên nhân. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng 125 mg glucosamin sulfat kali clorid, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml nước, siêu âm 10 phút. Thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Lọc tiếp qua màng lọc 0,45 µm. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 159 Mẫu trắng: Mẫu trắng 1: pha động; Mẫu trắng 2: mẫu giả dược (chuẩn bị tương tự dung dịch mẫu thử nhưng không có glucosamin). Dung dịch đệm phosphat pH 3: lấy chính xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng trong 1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 3 bằng dung dịch kali hydroxyd 30%, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch đệm phosphat pH 3 có triethylamin: lấy chính xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng trong 1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 3 bằng dung dịch kali hydroxyd 30%, thêm tiếp 2,1 ml triethylamin, tiếp tục điều chỉnh đến pH 3 bằng dung dịch acid phosphoric 1%, lọc qua màng lọc 0,45 µm. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thăm dòđiều kiện sắc ký Trong các điều kiện sắc ký khảo sát, hai điều kiện ảnh hưởng đến thời gian lưu và hệ số đối xứng của pic glucosamin được trình bày trong bảng 1. Hình 1 và hình 2 minh họa sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn khi tiến hành sắc ký theo hai điều kiện này. Bảng 1: Hai điều kiện sắc ký khảo sát Điều kiện 1 Điều kiện 2 Pha động Acetonitril: đệm phosphat pH 3 (35:65, tt/tt) Acetonitril: đệm phosphat pH 3 có triethylamin (35:65, tt/tt) Thời gian lưu (phút) 5,173 5,216 Hệ số đối xứng pic glucosamin 1,6 1,2 Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 1. Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 2. Nhận xét: Thời gian lưu của glucosamin hầu như không thay đổi ở cả 2 điều kiện. Với điều kiện 1, hệ số đối xứng của pic glucosamin có giá trị 1,6. Với điều kiện 2 (có thêm TEA), hệ số đối xứng được cải thiện đáng kể, có giá trị 1,2. Như vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng glucosamin sulfat kali clorid như sau: Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 3 có TEA: acetonitril (65:35, tt/tt) Cột sắc ký: Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Đầu dò PDA: 195 nm Thể tích bơm mẫu: 10 µl Thẩm định phương pháp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 160 Khảo sát tính phù hợp của hệ thống Bảng 2:Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6) Mẫu Giá trị thống kê tR (phút) S (µAU x giây) As N Chuẩn Trung bình 5,204 1318685 1,2 11756 SD 0,003 8515 0,0 18 RSD 0,05% 0,65% 0,51% 0,62% Thử Xtb 5,033 1043176 1,2 11628 SD 0,002 13391 0,0 42 RSD 0,05% 1,28% 1,17% 1,46% tR: thời gian lưu, S: diện tích pic, As: hệ số đối xứng, N: số đĩa lý thuyết Nhận xét: Hệ số đối xứng có giá trị trung bình trong khoảng 0,8 – 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại của mẫu chuẩn và mẫu thử đều nhỏ hơn 2%.Vậy quy trình định lượngglucosamin đạt tính phù hợp của hệ thống. Tính chọn lọc Hình 3 minh họa sắc ký đồ pha động, mẫu giả dược, mẫu chuẩn và mẫu thử. Kết quả khảo sát tính chọn lọc cho thấy: thời gian lưu của pic hoạt chất trong mẫu thử tương đương với thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng và mẫu giả dược không có pic trùng với pic glucosamin. Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic glucosamin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn.Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu chuẩn. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic của đầu dò PDA cho thấy pic glucosamin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu. Như vậy, qui trình định lượng glucosamin có tính chọn lọc. (a) (b) (c) (d) Hình 3:Sắc ký đồ pha động (a), mẫu giả dược (b) mẫu chuẩn (c), mẫu thử (d). Độ đúng, độ chính xác và khoảng tuyến tính Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác. Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác và khoảng tuyến tính Chỉ tiêu thẩm định Giá trị thống kê Phương trình hồi qui y = 1379,5x – 59340; R2 = Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 161 0,9999 Khoảng tuyến tính (µg/ml) 600 - 1400 Độ lặp lại (n=6) RSD = 1,71% Độ chính xác liên ngày (n=18) RSD = 0,45% Độ đúng (tỷ lệ hồi phục, n=9) 99,9% - 101,1 % Ứng dụng quy trình định lượng glucosamin trong viên nén glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ hòa tan Quy trình phân tích sau khi thẩm định đã được ứng dụng để định lượng glucosamin sulfat kali clorid trong 3 lô pilot và trong thử nghiệm độ hòa tan sau 10 phút. Glucosamin sulfat kali clorid được hòa tan trên 85% sau 10 phút ở cả 3 lô thuốc.Với chỉ tiêu định lượng, cả 3 lô đều có hàm lượng glucosamin sulfat kali clorid nằm trong khoảng từ 90% - 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Bảng 4: Kết quả định lượng và thử nghiệm độ hòa tan trên 3 lô thành phẩm (n=6) Chỉ tiêu Phần trăm glucosamin sulfat kali clorid so với nhãn Lô 1 Lô 2 Lô 2 Độ hòa tan 91,39% 91,36% 91,12% Định lượng 99,59% 99,72% 101,33% KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng glucosamin. Phương pháp đạt tính phù hợp của hệ thống, có tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao, khoảng tuyến tính rộng.Quy trình này có thể được ứng dụng để định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 289-292. 2. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical proceduces: text and methodology, 1-13. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014