Xây dựng quy trình định lượng tạp chất phân hủy của Esomeprazol bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 134 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP CHẤT PHÂN HỦY CỦA ESOMEPRAZOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Lê Trung Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Đối với một nguyên liệu hay chế phẩm thuốc, tác dụng dược lý của hoạt chất chính bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó có các chất phân hủy. Đây là một trong những nguyên nhân gây tác dụng phụ hay làm giảm tác dụng dược lý của hoạt chất chính. Do đó, ngoài những tiêu chuẩn xác định chất lượng của thuốc như định tính, định lượng, độ hòa tan..., việc kiểm soát tạp chất phân hủy hiện diện trong nguyên liệu và chế phẩm tương ứng cũng cần thiết. Thuốc kháng acid Esomeprazol STADA được sản xuất từ nguyên liệu esomeprazol bởi công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam cũng không phải là trường hợp ngoại lệ.Hiện tại, chỉ duy nhất Dược điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất cho nguyên liệu này và chưa có chuyên luận chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành phẩm Esomeprazol STADA cũng chưa xây dựng chỉ tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì vậy, việc xây dựng một qui trình định lượng tạp chất phân hủy trong nguyên liệu và chế phẩm của hoạt chất này là cần thiết. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao phađảo để định lượng tạp chất phân hủy trong nguyên liệu esomeprazol và chế phẩm Esomeprazol STADA. Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để tách tạp chất phân hủy và esomeprazol, sử dụng cột sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động acetonitril - đệm pH 7,6 (25:75), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, bước sóng phát hiện 280 nm. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có khoảng tuyến tính từ 0,04 – 0,50 ppm với hệ số tương quan cao, giới hạn phát hiện 0,01 ppm, giới hạn định lượng 0,04 ppm, độ đúng với tỉ lệ phục hồi 98% - 102% và độ chính xác với RSD < 2%. Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng tạp chất phân hủy của esomeprazol. Quy trình đã được áp dụng để kiểm tra tạp chất phân hủy trong 3 lô nguyên liệu và 3 lô thành phẩm tương ứng. Từ khóa: tạp chất phân hủy, esomeprazol, sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF DEGRADATION IMPURITY OF ESOMEPRAZOLE BY HPLC Le Trung Hau, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 134 - 138 Introduction – Aims::For drug substances ormedicines, pharmacologicaleffectoftheactiveingredientis affected bymanyfactors such as presence of degradation impurities. This is oneofthecauses of side effects orreducingpharmacological effectsofthe active ingredient. Therefore, the quality of drugs is not only monitored by identification, assay, and dissolution tests, etc but also controlled via impurity tests in raw materials and finished products. The antacid Esomeprazol STADA capsule produced by STADA Viet Nam Joint Venture Co., Ltd is not an exception. Currently, the API monograph esomeprazole with impurities tests is only available in European Pharmacopoeia.While specification of Esomeprazol STADA finished product has not had impurity test yet. Hence, development of a method for degradation impurity assay in esomeprazole raw material and finished product is * Công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Lê Trung Hậu ĐT: 0913799068 Email: diemnhim@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 135 necessary. Subjects and Methods: A reversed phase high performance liquid chromatographic method was developed for quantitative determination of degradation impuirity in esomeprazole raw material and Esomeprazol STADA finished product. The appropriate chromatographic conditions were found out for complete separation of degradation Results: impurity and esomeprazole, using Eursopher C8 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mixture of acetonitril and buffer pH 7.6 (25:75, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection wavelength of 280 nm. The method was validated and shown linearity range from 0.04 ppm to 0.50 ppm with high correlation coefficient, detection limit of 0.01 ppm, quantitation limit of 0.04 ppm, accuracy with recovery ratio in 98% - 102%, and precision with RSD < 2%. Conclusion: A liquid chromatographic method was successfully developed for degradation impurity assay of esomeprazole. The validated method was applied for impurity test in three batches of raw materials and of finished products. Key words: Degradation impurity, esomeprazole, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, ngoài việc nghiên cứu tác dụng dược lý của các hoạt chất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo sát tác dụng dược lý của các tạp chất có thể phát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm do nguyên liệu đầu vào còn lẫn tạp hoặc tạp chất phân hủy trong quá trình sản xuất và lưu hành. Những tạp chất phát sinh có thể làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc hoặc gây các tác dụng khác nhau với hậu quả không lường trước được. Việc kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong chế phẩm tương ứng đã được quy định chặt chẻ đối với phần lớn chuyên luận trong Dược điển các nước (EP, USP, BP).Esomeprazol (Nexium, Esomeprazol STADA) là đồng phân S của omeprazol, được dùng làm thuốc ức chế bơm proton, làm giảm tiết acid dạ dày (4).Hiện tại, chỉ duy nhất Dược điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất cho nguyên liệu này và chưa có chuyên luận chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành phẩm Esomeprazol STADA cũng chưa xây dựng chỉ tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì vậy, việc xây dựng một qui trình định lượng tạp chất phân hủy trong nguyên liệu và chế phẩm của hoạt chất này là cần thiết. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Tạp chất phân hủy của esomeprazol: 5- Methoxy-2-(((4-methoxy-3,5-dimethyl pyridin-2- l)methyl)sulphonyl)-1H-benzimidazole (tạp D, Sulphon)(1,3). Trang thiết bị, hóa chất và dung môi Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20A. Cột sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm). Cột Inert Sustain C8 (125 x 4,6 mm; 5 μm). Cân phân tích GH 202 Mettler Toledo. Các thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn. Hóa chất và dung môi Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck).Dinatri hydrophosphat, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện phân tích Esomeprazol và tạp D là những chất phân cực, nên pha động sử dụng phải phân cực. Vì vậy, sắc ký pha đảo được áp dụng. Theo Dược điển Châu Âu, điều kiện sắc ký để kiểm tra tạp phân hủy là sử dụng cột pha đảo C8, pha động bao gồm acetonitril và đệm phosphat pH 7,6 (27:73). Căn cứ vào đó, một số điều kiện sắc ký Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 136 đã được khảo sát như cột sắc ký, kích thước cột, tỉ lệ dung môi pha động, nồng độ mẫu đo để chọn được điều kiện sắc ký thích hợp thỏa mãn các yêu cầu sau: độ phân giải Rs giữa tạp D và esomeprazol (và các tạp khác nếu có) phải lớn hơn 1,5; hệ số bất đối (As) của pic tạp D phải nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5. Điều kiện sắc ký ban đầu(1): pha động acetonitril - đệm pH 7,6 (27:73), cột sắc ký phả đảo C8 (125 x 4,6 mm, 5 μm), bước sóng phát hiện 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 40 μl. Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn của ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Xác định hàm lượng tạp chất trong nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol Phương pháp sau khi thẩm định sẽ được ứng dụng để xác định hàm lượng tạp phân hủy trong nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện phân tích Dựa theo điều kiện sắc ký trong Dược điển Châu Âu, sử dụng cột pha đảo C8 (125 x 4,6 mm; 5 μm), do đó cột Inert Sustain có kích thước tương đương được sử dụng để khảo sát trên hỗn hợp chuẩn esomeprazol và tạp D, tỉ lệ tạp D là 0,2% so với esomeporazol (1). Kết quả cho thấy esomeprazol và tạp D không tách hoàn toàn. Khi tăng chiều dài cột lên 250 mm, độ phân giải vẫn không được cải thiện. Các khảo sát tiếp theo được tiến hành trên cột sắc ký Eurospher C8 cho thấy độ phân giải được cải thiện đáng kể với cột Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), esomeprazol và tạp D tách hoàn toàn. Kết quả khảo sát tỉ lệ acetonitril và đệm phosphat pH 7,6 lên độ phân giải của mẫu thử giả lập (được chuẩn bị từ chế phẩm Esomeprazol STADA có thêm chuẩn tạp D sao cho tỷ lệ tạp D là 0,2% so với esomeprazol) cho thấy: - Với tỉ lệ 27:73, esomeprazol và tạp D tách hoàn toàn, độ phân giải giữa tạp chưa biết gần tạp D nhất khoảng 1,3. - Với tỉ lệ 25:75, esomeprazol và tạp D tách hoàn toàn, độ phân giải giữa tạp chưa biết gần tạp D nhất khoảng 2,7. Khảo sát tỉ lệ giữa esomeprazol và tạp D cho thấy hỗn hợp esomeprazol và tạp D có nồng độ tương ứng 200 ppm và 0,4 ppm khi tiến hành sắc ký nhiều lần liên tiếp thì 2 pic vẫn tách hoàn toàn, hệ số bất đối của pic tạp D vẫn nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và số đĩa lý thuyết cột không bị giảm, điều này chứng tỏ cột không bị quá tải. Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng tạp D là: - Pha động: acetonitril - đệm phosphat pH 7,6 (25:75) - Cột sắc ký: Eurospher (250 x 4,6 mm; 5 μm) - Bước sóng phát hiện: 280 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 40 μl Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp của hệ thống Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6) Thông số Chất RSD% của thời gian lưu (tR) RSD% của diện tích pic (S) RS AS RSD% của số đĩa lý thuyết Tạp D 0,50 0,42 - 1,0 1,53 Esomeprazol 0,24 0,17 11,6 1,1 1,65 Nhận xét: Hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại đều nhỏ hơn 2%. Độ phân giải lớn hơn 1,5. Tiến hành sắc ký 6 lần trên mẫu thử cũng cho thấy độ phân giải giữa pic tạp D và pic gần nhất lớn hơn 1,5. Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp của hệ thống. Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu giả dược, mẫu chuẩn, mẫu thử (chế phẩm Esomeprazol Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 137 STADA) theo điều kiện sắc ký đã chọn, mỗi mẫu tiêm 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu trắng và mẫu giả dược không xuất hiện pic tại thời gian lưu của pic tạp D và pic esomeprazol, sắc ký đồ mẫu thử cho 2 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 pic tạp D và esomeprazol trong mẫu chuẩn, tạp D tách hoàn toàn esomeprazol và các tạp chưa biết khác với độ phân giải lớn hơn 1,5. Như vậy, qui trình phân tích có tính đặc hiệu. Sắc ký đồ của các mẫu được minh họa ở hình 1. Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu giả dược, mẫu chuẩn và mẫu thử. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ nhất còn phát hiện được để xác định LOD và pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ chính xác và độ đúng để xác định LOQ. Đo tín hiệu thu được từ mẫu trắng (N) và mẫu thử (S). Thiết lập tỉ số S/N. Nồng độ mẫu thử tại điểm có S/N = 3/1 là LOD và S/N = 10/1 là LOQ. Kết quả thu được như sau: LOD và LOQ của tạp D lần lượt là 0,01μg/ml và 0,04 μg/ml. Khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng Khoảng tuyến tính được xác định trong khoảng nồng độ từ LOQ - 120% so với giới hạn qui định (0,2%). Tiến hành pha 6 dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Mỗi dung dịch tiến hành sắc ký 2 lần. Độ lặp lại: Chuẩn bị 6 mẫu thử và 6 mẫu thử giả lập, tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần trong cùng một ngày. Độ chính xác trung gian: chuẩn bị mẫu giống như độ lặp lại và tiến hành trong 2 ngày khác nhau, trên thiết bị phân tích khác. Mẫu chuẩn Mẫu th Mẫu trắng Mẫu giả dược Esomeprazol Esomeprazol Tạp D Tạp D Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 138 Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm chuẩn tạp D vào mẫu thử ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với giới hạn quy định (0,2%). Ở mỗi mức nồng độ, chuẩn bị 3 mẫu và tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần. Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính từ 0,04 ppm – 0,50 ppm với giá trị bình phương của hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác. Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng Tạp D Phương trình hồi qui y = 57279,9x Khoảng tuyến tính (ppm, µg/ml) 0,04 – 0,50 R2 0,9997 Độ lặp lại (RSD, n = 6) Mẫu thử: 1,91%; Mẫu thử giả lập: 1,16% Độ chính xác trung gian (RSD, n = 18) Mẫu thử: 1,78%; Mẫu thử giả lập: 1,61% Độ đúng (tỷ lệ hồi phục, n=9) 98,23% - 101,39% Xác định hàm lượng tạp D trong nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol Tiến hành xác định tạp D trên 3 lô nguyên liệu và 3 lô chế phẩm tương ứng. Mỗi lô chuẩn bị 2 mẫu. Mỗi mẫu sắc ký 2 lần với điều kiện sắc ký đã chọn. Bảng 3: Kết quả xác định hàm lượng tạp D trong nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol Lô Nguyên liệu Chế phẩm (%) 1 Không phát hiện 0,10 2 Không phát hiện 0,10 3 Không phát hiện 0,09 KẾT LUẬN Dựa vào các kết quả thực nghiệm thu được, có thể áp dụng quy trình đã thiết lập để định lượng tạp chất phân hủy D trong nguyên liệu esomeprazol và trong chế phẩm Esomeprazol STADA. Quy trình có tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, giúp phát hiện và kiểm tra tạp chất phân hủy trong nguyên liệu và thành phẩm tương ứng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. European pharmacopoeia (2010), 1951-1953. 2. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5. 3. Nalwade SU, Reddy VR, Rao DD, Morisetti NK(2012), A validated stability indicating ultra performance liquid chromatographic method for determination of impurities in esomeprazole magnesium gastro resistance tablets, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 57:109-114 4. Reuters T (2009), Physicians’ Desk Referrence, 652. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014