Xây dựng quy trình pha chế bộ kit định lượng Creatinin trong huyết thanh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 652 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHA CHẾ BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG CREATININ TRONG HUYẾT THANH Nguyễn Thị Phương Thảo*, Trần Thanh Nhãn** TÓM TẮT: Mở đầu: Việc sản xuất những bộ kit thử dùng cho định lượng các chất trong lĩnh vực xét nghiệm sinh hóa là một vấn đề đã được giải quyết khá lâu ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật. Trong khi đó, tại nước ta hiện nay hầu hết các bộ kit dùng trong lĩnh vực này đều phải nhập khẩu. Sản xuất trong nước những bộ kit thử cho các xét nghiệm hóa sinh với chất lượng ổn định, giá thành rẻ là một đòi hỏi cấp thiết Mục tiêu: Xây dựng quy trình pha chế và tiêu chuẩn hóa bộ kit định lượng creatinin trong huyết thanh. Phương pháp nghiên cứu: Ứng dụng các phần mềm vi tính (Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel) để tối ưu hoá công thức bộ kit. Sự ổn định của bộ kit được xác định bằng phương pháp tự nhiên và phương pháp lão hóa cấp tốc. Kết quả: Đề tài đã khảo sát được các thông số tối ưu của bộ kit. Các thông số tối ưu như sau: nồng độ acid picric = 21,06 mmol/L; nồng độ NaOH = 333,55 mmol/L; nồng độ creatinin chuẩn = 5,41 mg/dL; thời gian t1 = 10 giây; thời gian t2 = 104 giây. Thời hạn sử dụng bộ kit được dự đoán là 42 tháng kể từ khi pha chế ở điều kiện bảo quản mát từ 2 - 8 0C. Bộ kit được sử dụng để định lượng nồng độ creatinin trong huyết thanh của 327 bệnh nhân và 21 huyết thanh nội kiểm tra tại phòng sinh hoá, bệnh viện Quận 4, thành phố Hồ Chí Minh và có so sánh thống kê kết quả với bộ kit ngoại nhập (ISE - Ý) đang sử dụng tại đây. Kết quả cho thấy, bộ kit có chất lượng tương đương với bộ kit ngoại nhập. Kết luận: Đã thực hiện được việc tối ưu hóa công thức pha chế bộ kit định lượng creatinin trong huyết thanh và thẩm định được công thức tối ưu. Từ khóa: creatinin, huyết thanh, kit thử, tối ưu hóa. ABSTRACT ESTABLISHMENT OF PROCESS OF MANUFACTURING FOR THE KIT USING SERUM CREATININE QUANTIFY Nguyen Thi Phuong Thao, Tran Thanh Nhan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 652 - 659 Background: The production of the kit used to quantify substances in the field of biochemistry is a problem has been solved a long time in European countries, American and Japan. Meanwhile, in Viet Nam almost of the kits used in this field is imported. The production of test kits for the biochemical tests with stable quality, low price is an urgent requirement Objective: Process development and standardization of the kit for the quantification of the creatinin in serum. Methods: Computer softwares (Design - Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel) were applied in the optimum mixing formular of the kit. Real time method and accelerated study were used to determine the stability of the kit. *Bệnh viện đa khoa Quận 4 TPHCM ** Khoa Dược ĐHYD TPHCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Thanh Nhãn ĐT: 0908593032 Email: nhanchi2002@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 653 Results: This study has investigated to optimize parameters of the kit. Resulting conditions are as followed: concentration of picric acid = 21.06 mmol/L, concentration of NaOH = 333.55 mmol/L, concentration of standard creatimin = 5.41 mg/dL, time t1 = 10 seconds, time t2 = 104 seconds. The expiry date of the kit was predicted 42 months from the manufacture date at 2 - 80C. The kit was used for the quantitative determination of the creatinin in the serum of 327 patients and 21 samples control (Internal Quality Control) at Biochemistry department of District 4 hospital, at Ho Chi Minh city. And then we compare with imported kit (ISE - Italy) are using currently at hospital. The results showed the quality of this kit is the same with the kit imported (I.S.E - Italy). Conclusion: We have investigated to optimize parameters of the kit using serum creatinine quantify and evaluated the optimal formula of this kit Keywords: creatinin, serum, kit, optimize. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý về thận là bệnh lý rất thường gặp hiện nay. Một trong những biểu hiện của bệnh là sự tăng nồng độ creatinin trong máu. Do đó việc định lượng creatinin trong huyết thanh là một trong những xét nghiệm sinh hóa quan trọng cần được thực hiện để giúp cho việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh có hiệu quả. Ở Việt Nam hiện nay, một số phòng thí nghiệm của các trường Đại học như Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh và của công ty Nam Khoa có nghiên cứu sản xuất các bộ kit thử, nhưng chủ yếu dùng trong sinh học phân tử nhằm xác định các tác nhân gây bệnh trên người và động vật như: bộ kit PCR (Polymerase Chain Reaction) chẩn đoán lao, PCR chẩn đoán sốt xuất huyết, PCR chẩn đoán thương hàn, PCR chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm, Việc nghiên cứu sản xuất các bộ kit dùng trong xét nghiệm hóa sinh cho đến nay hầu như chưa được quan tâm. Bộ môn Sinh Hóa - Độc Chất, khoa Dược Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh trong 3 năm gần đây đã đi theo hướng nghiên cứu này. Trong lĩnh vực xét nghiệm hóa sinh lâm sàng, hầu hết các phòng xét nghiệm đều sử dụng các bộ kit ngoại nhập. Đó là một trong những nguyên nhân làm tăng giá thành các xét nghiệm, đồng thời làm tăng thêm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân. Việc sản xuất trong nước những bộ kit cho các xét nghiệm hóa sinh với chất lượng ổn định, giá thành rẻ là một đòi hỏi cấp thiết. Xuất phát từ tình hình trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu xây dựng quy trình pha chế và tiêu chuẩn hóa bộ kit định lượng creatinin trong huyết thanh. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu: Picric acid Merck – Germany NaOH Merck – Germany Na2HPO4 Merck – Germany Creatinin chuẩn (2 mg/dL) I.S.E – Italy Multicalibrator serum Bio Rad – USA Huyết thanh bệnh nhân Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm và tối ưu hoá quy trình pha chế bộ kit(1,4,6) Quy trình định lượng creatinin: Hút chính xác 500 μL thuốc thử R1 (dung dịch acid picric) và 500 μL thuốc thử R2 (dung dịch NaOH và Na2HPO4). Trộn đều hai dung dịch để tạo thành 1000 μL thuốc thử R. Hút chính xác 100 μL dung dịch mẫu thử. Trộn đều và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm và thời gian được chọn. Thiết kế mô hình thực nghiệm D-Optimal bằng phần mềm Design-Expert v6, 2002 (Stat – Ease Inc, USA) Tối ưu hóa quy trình bởi phần mềm INForm 3.0, 2003 (Intelligensys Ltd., UK) Thẩm định quy trình tối ưu(1,6,5) Pha chế bộ kit định lượng creatinin theo công thức tối ưu và tiến hành thẩm định quy trình tối ưu: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 654 Miền giá trị: Lấy mức tối ưu của nồng độ creatinin làm mức cơ sở, tiến hành pha dãy nồng độ creatinin thấp và cao hơn mức cơ sở với khoảng biến thiên là 1 mg/dL. Đo độ hấp thu của các mức đã thiết lập. Vẽ đường tuyến tính. Khi có sự lệch khỏi đường tuyến tính của một điểm nào đó, tiến hành pha dãy nồng độ creatinin trong khoảng giữa mức lệch và mức còn tuyến tính kề cận, với khoảng biến thiên là 0,1 mg/dL. Từ đó xác định được khoảng tuyến tính cần tìm. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính: Pha 1 dãy nồng độ creatinin với 6 nồng độ khác nhau, đo độ hấp thu 6 lần ở mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình. Với sự hỗ trợ của phần mềm Ms - Excel, tìm ra phương trình hồi quy tương quan giữa độ hấp thu (biến số phụ thuộc y) và nồng độ (biến số độc lập x), R2 và các hệ số hồi quy. Vẽ đường tuyến tính. Độ đặc hiệu: Xác định giá trị độ hấp thu ở mỗi trong 6 nồng độ creatinin là 2 mg/dl của mẫu chuẩn và mẫu thử (mẫu huyết thanh).So sánh 2 giá trị trung bình độ hấp thu của mẫu chuẩn và mẫu thử, dùng trắc nghiệm t tương ứng từng cặp (t - Test: Paired Two Sample for Means) để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không (với sự hỗ trợ của phần mềm Ms-Excel). Trong đó: n1 - số lần thực hiện thí nghiệm của mẫu x n2 - số lần thực hiện thí nghiệm của mẫu y s - phương sai Nếu | t | < tp(f): bộ kit có tính đặc hiệu. Độ chính xác (precision) Là mức độ sát gần giữa các giá trị riêng lẻ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Người ta phân biệt ba khái niệm: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ sao lại. Trong đó: SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn : giá trị trung bình của các giá trị CV%: hệ số phân tán Độ lặp lại (repeatibility): Thể hiện mức độ chính xác hay mức độ lặp lại, mức độ dao động giữa các kết quả thực nghiệm được thực hiện trong: Cùng một phòng thí nghiệm. Cùng một mẫu thử đồng nhất. Cùng một kiểm nghiệm viên. Cùng một khoảng thời gian. Đo 3 lần lặp lại ở mỗi một trong cùng 6 nồng độ trong miền giá trị của phương pháp phân tích và tính CV, yêu cầu CV ≤ 5%. Độ chính xác trung gian (intermediate precision): Biểu thị độ chính xác của phương pháp theo các biến số của phòng thí nghiệm tại: Nhiều ngày khác nhau. Với nhiều kiểm nghiệm viên. Với các dụng cụ khác nhau. Độ sao chép lại (reproducibility): Biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu trên cùng một mẫu đồng nhất. Tương tự như độ lặp lại với điều kiện: Phòng thí nghiệm thay đổi. Thay đổi phương pháp. Độ đúng: Pha dung dịch creatinin ở 3 mức nồng độ (80%, 100%, 120%) so với nồng độ đã được tối ưu. Từ độ hấp thu thu được, dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ thực tế (Oi), sau đó tính tỷ lệ phục hồi F% và độ lệch thực nghiệm B% theo biểu thức (với yêu cầu B% ≤ 2%, F%: 100 ± 2%.): N Ei EiOi B N /)100( 1 ∑ −= Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 655 N Ei OiF N /)100( 1 ∑= Trong đó - B: độ lệch thực nghiệm F: tỷ lệ phục hồi Ei: nồng độ theo lý thuyết Oi: nồng độ theo thực tế Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit(2,7,8) Sản xuất trên quy mô phòng thí nghiệm 3 lô thuốc thử định lượng creatinin, tiến hành thử nghiệm độ ổn định của bộ kit bằng 2 phương pháp ở 3 điều kiện theo dõi Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp dài hạn Điều kiện bảo quản bộ kit theo phương pháp dài hạn là 5 ± 30C. Khi mỗi lô bộ kit vừa được pha chế xong, chúng tiến hành định lượng mẫu creatinin chuẩn, kết quả thu được là độ hấp thu trung bình của 6 lần thí nghiệm ở mỗi lô. Thực hiện lặp lại thao tác này mỗi 3 tháng và so sánh kết quả với lần đầu tiên để kiểm tra độ ổn định của bộ kit. Thời gian kết thúc thực nghiệm là thời gian mà một trong các tiêu chí của thuốc thử không đạt (màu sắc, độ kết tủa, độ nhớt,...) hoặc cho kết quả định lượng mẫu có sai số ≥10%. Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính liên quan giữa thời gian bảo quản và nồng độ đo được (ln[C]). Từ đó có thể dự đoán được tuổi thọ của thuốc. Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp già hoá cấp tốc Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 25 ± 3 oC. Khi mỗi lô bộ kit vừa được pha chế xong, chúng tiến hành định lượng mẫu creatinin chuẩn, kết quả thu được là độ hấp thu trung bình của 6 lần thí nghiệm ở mỗi lô. Thực hiện lặp lại thao tác này mỗi tháng và so sánh kết quả với lần đầu tiên để kiểm tra độ ổn định của bộ kit. Thời gian kết thúc thực nghiệm là thời gian mà 1 trong các tiêu chí của thuốc thử không đạt (màu sắc, độ kết tủa, độ nhớt,...) hoặc cho kết quả định lượng mẫu có sai số ≥ 10%. Áp dụng phương trình Van’t Hoff: t CCK t Δ − = )/ln( 0 Trong đó: C và C0: hàm lượng của thuốc ở thời điểm trước t0 và sau t Δt = khoảng thời gian = t0 - t k: hệ số Van’t Hoff = 2Δ/10 Δ: mức chênh lệch nhiệt độ (với: Δ = t1 - t2) Tính tuổi thọ của bộ kit với nhiệt độ già hóa là 250C và nhiệt độ bảo quản thật là 50C. Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 40 ± 3 oC: tương tự ở nhiệt độ 25 ± 3 oC. Áp dụng phương trình Arrhenius để tính tuổi thọ của bộ kit Từ hệ số K tìm được ở nhiệt độ bảo quản 250C và 400C, tính lnK ở mỗi điều kiện bảo quản. Thiết lập bảng tương ứng giữa lnK và 1000/T tương ứng ở từng nhiệt độ (T: là nhiệt độ tuyệt đối Kelvins, với T = 273 + tbảo quản ) Lập đường tuyến tính liên quan giữa lnK và 1000/T. Suy ra lnK nhiệt độ bảo quản Từ lnK nhiệt độ bảo quản tính được t90 ở nhiệt độ bảo quản với: t90 = 0,1053/K nhiệt độ bảo quản Tuổi thọ được xác định của bộ kit: là kết quả tuổi thọ có thời gian ngắn nhất tìm được từ các phương pháp thử nghiệm được nghiên cứu. Ứng dụng bộ kit trên mẫu huyết thanh bệnh nhân(6) Chúng tôi sử dụng bộ kit pha chế để định lượng creatinin ở 21 mẫu huyết thanh nội kiểm tra (IQC: Internal Quality Control) và 327 mẫu huyết thanh bệnh nhân tại bệnh viện quận 4 So sánh kết quả với bộ kit ngoại nhập (I.S.E - Italy). Dùng trắc nghiệm F so sánh 2 phương sai (F - Test: Paired Two Sample for Variances) và trắc nghiệm t phương sai bằng nhau hoặc khác nhau (t - Test: Two - Sample Assuming Equal Variances) hoặc (t - Test: Two - Sample Assuming Unequal Variances) để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 656 KẾT QUẢ Thiết kế thực nghiệm và tối ưu hoá quy trình pha chế bộ kit Quy trình định lượng creatinin chịu ảnh hưởng của các yếu tố sau: Acid picric, NaOH, nồng độ creatinin chuẩn, thời gian đo cuối. Bảng 1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng Yếu tố Mức Acid picric (mmol/ L) 4,37 15,28 26,2 NaOH (mmol/ L) 120 240 360 Creatinin chuẩn (mg/dL) 1,0 3,5 6,0 Thời gian đo cuối (giây) 60 90 120 Thông số tối ưu: dữ liệu đầu ra của phần mềm thông minh INForm v3 là các thông số của quy trình đã được tối ưu hoá, gồm có: Acid picric = 21,06 mmol/ L NaOH) = 333,55 mmol/ L Creatinin chuẩn = 5,41 mg/ dL Thời gian đo cuối = 104 giây Thẩm định quy trình tối ưu Khoảng tuyến tính: 0,4 – 16 mg/dl Phương trình hồi quy tuyến tính ŷ= 0,0479x + 0,0031 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 5 10 15 20 Nồng độ Creatinin (mg/dL) Độ h ấp th u (O D 50 0) Đường chuẩn Hình 1. Đường chuẩn giữa độ hấp thu và nồng độ Độ đặc hiệu Bảng 2. Kết quả độ hấp thu trong thử nghiệm độ đặc hiệu. Độ hấp thu Mẫu thử Mẫu chuẩn Mẫu 1 0,0991 0,0994 Mẫu 2 0,0993 0,0997 Độ hấp thu Mẫu thử Mẫu chuẩn Mẫu 3 0,0990 0,0989 Mẫu 4 0,0993 0,0992 Mẫu 5 0,0988 0,0995 Mẫu 6 0,0982 0,0990 Trắc nghiệm t tương ứng từng cặp (t-Test: Paired Two Sample for Means) cho thấy sự không khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa giá trị độ hấp thu của mẫu chuẩn và mẫu thử (| tSta | = 2,13 < t0,05 = 2,507). Độ lặp lại Kết quả đánh giá về độ lặp lại của quy trình tối ưu được trình bày trong bảng 3 (với nồng độ creatinin là 5,4 mg/dL). Bảng 3. Kết quả thực nghiệm về độ lặp lại. Lần lặp lại Nồng độ Creatinin thực (mg/dL) Độ hấp thu Nồng độ Creatinin từ đường chuẩn (mg/dL) 1 5,4 0,2622 5,47 2 5,4 0,2613 5,39 3 5,4 0,2608 5,31 4 5,4 0,2618 5,50 5 5,4 0,2627 5,42 6 5,4 0,2618 5,43 Từ kết quả bảng 3, chúng tôi tính được CV% = 1,12% < 5%. Kết quả này cho thấy quy trình tối ưu có độ lặp lại đạt yêu cầu của một quy trình phân tích. Độ chính xác trung gian Độ hấp thu tương ứng với nồng độ creatinin chuẩn có nồng độ 5,4 mg/dl của mẫu được xác định bởi ba kỹ thuật viên bằng ba máy phân tích hoá học: LCD - Echo, Humalyzer 2000 và BSA 3000. Từ kết quả bảng 4, chúng tôi tính được CV% = 1,07 % < 5%. Kết quả này cho thấy quy trình tối ưu đạt độ chính xác trung gian. Bảng 4. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian Nồng độ creatinin đo được từ các máy Lần lặp lại Nồng độ Creatinin thực (mg/dL) LCD - Echo Humalyzer 2000 BSA 3000 1 5,4 5,52 5,47 5,43 2 5,4 5,42 5,39 5,54 3 5,4 5,32 5,46 5,48 ŷ = 0,0479x + 0,0031 R2 = 0,9999 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 657 Nồng độ creatinin đo được từ các máy Lần lặp lại Nồng độ Creatinin thực (mg/dL) LCD - Echo Humalyzer 2000 BSA 3000 4 5,4 5,49 5,41 5,45 5 5,4 5,42 5,35 5,37 Nồng độ creatinin đo được từ các máy Lần lặp lại Nồng độ Creatinin thực (mg/dL) LCD - Echo Humalyzer 2000 BSA 3000 6 5,4 5,32 5,48 5,46 CV% ở mỗi máy 1,41% 0,87% 0.94% Độ sao chép lại Bảng 5. Kết quả thử nghiệm độ sao chép lại NỒNG ĐỘ CREATININ (mg/dL) CV% Ngày thử nghiệm Tên mẫu thử Thử nghiệm (MS: 8723) Cùng phương pháp Cùng nhóm Cùng phương pháp Cùng nhóm 26/05/09 EQAS7 - 11 7,17 7,07 7,38 1,39 2,93 30/06/09 EQAS7 - 12 3,59 3,48 3,71 3,06 3,34 28/07/09 EQAS8 - 01 6,22 6,07 6,45 2,41 3,70 25/08/09 EQAS8 - 02 1,21 1,25 1,18 3,31 2,48 29/09/09 EQAS8 - 03 2,80 2,89 2,97 3,21 6,07 27/10/09 EQAS8 - 04 8,02 8,22 8,80 2,49 9,73 Qua bảng phân tích kết quả thử nghiệm độ sao chép lại của quy trình định lượng creatinin trong huyết thanh bằng bộ kit, nhận thấy: - Đối với nhóm có cùng phương pháp thử nghiệm (động học dựa trên phản ứng Jaffé), kết quả định lượng creatinin từ bộ kit so với kết quả trung bình của nhóm này có CV% đều < 5%. - Đối với nhóm cùng nhóm (cùng nhóm máy phân tích mẫu), kết quả định lượng creatinin từ bộ kit so với kết quả trung bình của nhóm này trong lần 6 so sánh có 2 lần cho kết quả có CV% > 5%. Vì nhóm này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, nên sự phân tán tương đối rộng. Nhóm này chỉ có giá trị tham khảo. Thử nghiệm độ sao chép trên đã xác định quy trình định lượng creatinin trong huyết thanh bằng bộ kit đạt độ sao chép theo yêu cầu. Qua các thử nghiệm về độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ sao chép lại đã cho thấy quy trình định lượng creatinin trong huyết thanh bằng bộ kit nghiên cứu đạt độ chính xác gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ sao chép lại. Độ đúng Bảng 6. Kết quả thử nghiệm độ đúng Mức % Ei (mg/dL) Ai Oi (mg/dL) 4,3 0,21094 4,33 4,3 0,20854 4,28 80% 4,3 0,20854 4,28 5,4 0,26182 5,39 5,4 0,26566 5,47 100% 5,4 0,26518 5,46 6,5 0,32854 6,78 6,5 0,31942 6,59 120% 6,5 0,32374 6,68 Dựa vào số liệu trên bảng 3, chúng tôi tính được độ lệch thực nghiệm là B = 1,41% và tỷ lệ hồi phục F = 102 %. Kết quả này cho thấy quy trình tối ưu đạt độ đúng đạt theo yêu cầu. Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit Phương pháp dài hạn Đánh giá về mặt cảm quan: quan sát qua những chu kỳ dùng thuốc thử định lượng creatinin trong 2 lọ R1 và R2 ở cả 3 lô cho thấy thuốc thử trong, không đổi màu, không xuất hiện kết tủa. Kết quả xác định nồng độ thay đổi theo thời gian của phương pháp này được thể hiện ở bảng sau Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 658 Bảng 7. Sự thay đổi nồng độ theo thời gian (phương pháp dài hạn). Nồng độ creatinin Chu kỳ Lô 1 Lô 2 Lô 3 Bắt đầu 2,047 2,022 2,027 3 tháng 2,035 2,010 2,020 6 tháng 2,017 1,999 2,000 9 tháng 2,001 1,988 1,990 12 tháng 1,987 1,977 1,976 Với sự hỗ trợ của phần mềm Excel, chúng tôi thiết lập được các đường tuyến tính liên quan giữa thời gian bảo quản và nồng độ (ln[C]). Từ đó xác định tuổi thọ ở mỗi lô bộ kit theo phương pháp dài hạn: Bảng 8.Tuổi thọ theo phương pháp dài hạn. Lô 1 Lô 2 Lô 3 42 tháng 56 tháng 48 tháng Phương pháp già hóa cấp tốc Áp dụng phương trình Van’t Hoff tính tuổi thọ bộ kit Điều kiện 250C có hệ số Van’t Hoff k = 22. Tuổi thọ của 3 lô bộ kit là Bảng 9. Tuổi thọ của bộ kit ở 250C Lô 1 Lô 2 Lô 3 52 tháng 59 tháng 55 tháng Điều kiện 400C có hệ số Van’t Hoff k = 23,5. Tuổi thọ của 3 lô bộ kit tìm được ở bảng sau: Bảng 10. Tuổi thọ của bộ kit ở 400C Lô 1 Lô 2 Lô 3 51 tháng 56 tháng 54 tháng Áp dụng phương trình Arrhenius tính tuổi thọ bộ kit Bảng 11.Tuổi thọ của bộ kit tính theo phương trình Arrhenius Nhiệt