Alpha-momorcharin: Protein tiềm năng được ứng dụng trong nông nghiệp

72 Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 ALPHA-MOMORCHARIN: PROTEIN TIỀM NĂNG ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP NGUYỄN THỊ THU THẢO1 LÊ THỊ TRÚC LINH1, ĐẶNG THANH DŨNG1,* 1Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh *Email: dung.dthanh@ou.edu.vn (Ngày nhận: 23/08/2018; Ngày nhận lại: 29/09/2018; Ngày duyệt đăng: 15/10/2018) TÓM TẮT Alpha-momorcharin (α-MMC) thuộc tuýp I protein bất hoạt ribosome (ribosome- inactivating protein) được tìm thấy trong trái khổ qua. Hiện nay, α-MMC đang được nghiên cứu như một protein chức năng có tiềm năng ứng dụng trong y dược và nông nghiệp. Ngoài khả năng chống lại khối u trong giai đoạn đầu của ung thư của α-MMC trong y dược, những nghiên cứu gần đây cho thấy protein này có khả năng kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấmtrong nông nghiệp cây trồng. Hiểu được cơ chế hoạt động của α-MMC sẽ góp phần quan trọng trong việc tìm ra phương pháp cũng như là sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng vào lĩnh vực nông nghiệp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thảo luận cơ chế hoạt động của α-MMC và khả năng kháng nấm và virus trong cây trồng. Từ khóa: Alpha-momorcharin; Antifungus; Antivirus; Mechanism. Alpha-momorcharin: A potential protein in agricultural application ABSTRACT Alpha-momorcharin (α-MMC) is a type-I ribosome inactivating protein which is found in Momordica charantia. Recently, α-MMC has emerged as a potential protein for medical and agricultural applications. Proteinα-MMC is able to fight against tumor cells in the early stage of cancer. In addition, this α-MMC has shown a strong biological capacity for anti-virus, anti- bacteria, and anti-fungi in crops. Understanding the molecular mechanism of α-MMC function will provide an alternative approach as well as the production of inoculants applied in the area of agriculture. In this study, we discuss the mechanism of α-MMC and its application in fungal and viral resistance. Keywords: Alpha-momorcharin; Antifungus; antivirus; mechanism. 1. Giới Thiệu Nấm, virus là các tác nhân gây bệnh chính trên cây trồng (bên cạnh vi khuẩn), là nguyên nhân dẫn đến các thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp trong nước cũng như là trên thế giới (Doehlemann, Okmen, Zhu, & Sharon, 2017; Scholthof và cộng sự, 2011). Các tác nhân gây bệnh này xâm nhiễm vào cây trồng, làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước và chất dinh dưỡng, dẫn đến cây héo vàng; thối rễ, gốc, thân; còi cọc và chết; năng suất thu hoạch giảm (Dean và cộng sự, 2012; Termorshuizen, 2016). Trường hợp nghiêm trọng hơn, có thể dẫn đến mất trắng khi nấm lây lan ra khắp diện tích trồng. Tác nhân virus xâm nhiễm vào tế bào cây kí chủ thông qua các vết thương nhỏ do sâu bọ, nấm gây ra hoặc qua Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 73 các vết thương cơ giới. Virus sinh sôi, nhân lên và lây lan từ tế bào này sang tế bào khác, lan nhanh đến hầu hết các bộ phận của cây và gây ra các triệu chứng: cây còi cọc, lá biến dạng (cuốn lại, còi cọc, vàng lá, có các vết loét, đốm, khảm vàng hoặc nâu), trường hợp nặng sẽ gây chết cây (Marche, Roth, Manohar, Dollet, & Baltz, 1993). Để phòng và trị bệnh do nấm gây ra, nông dân thường sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Việc này có thể làm mất cân bằng sinh thái trong đất, một số vi sinh vật có lợi trong đất cũng bị tiêu diệt, gây ô nhiễm môi trường. Đối với tác nhân gây bệnh là virus, hiện vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, biện pháp chủ yếu hiện nay là phòng bệnh: chọn giống sạch bệnh hoặc kháng bệnh, vệ sinh đồng ruộng, luân canh, tiêu diệt các tác nhân truyền bệnh. Các biện pháp này có hiệu quả rất hạn chế trong việc kiểm soát bệnh. Các nghiên cứu mới đã phát hiện ra protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating protein – RIP) có khả năng bất hoạt ribosome của nhiều sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật; dẫn đến tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của tế bào (Fabbrini, Katayama, Nakase, & Vago, 2017; Zhu, Zhou, Ji, & Chen, 2018) (Hình 1). Trong đó, alpha-momorcharin (α-MMC) là một thành viên thuộc gia đình protein RIP, được tìm thấy trong trái khổ qua (đặt biệt có nhiều trong hạt), protein này có rất nhiều hoạt tính sinh học: kháng khối u (anti-tumor) (Deng và cộng sự, 2016), ức chế sự sao chép của HIV-1 (Zheng, Ben, & Jin, 1999), ức chế sự phát triển của tế bào ung thư dạ con JAR; đặc biệt là hoạt tính kháng nấm và kháng virus rộng (Yang, Meng, Chen, Lin, & Xi, 2016; Zheng và cộng sự, 1999; Zhu và cộng sự, 2013). Protein α-MMC đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều loại nấm và virus khác nhau (Zhu và cộng sự, 2013), bao gồm: nấm Fusarium spp., nấm Aspergillus spp., nấm Sclerotinia sclerotiorum, nấm Bipolaris maydis, nấm Magnaporthe grisea, virus ChiVMV (Chilli veinal mottle virus), virus CMV (Cucumber mosaic virus), virus TMV (Tobacco mosaic virus) và virus TuMV (Turnip mosaic potyvirus). Đây đều là những tác nhân gây bệnh phổ biến và thường gặp trên cây trồng (lúa, cây có múi, cà chua, dưa leo, ớt, tiêu,) (Dean và cộng sự, 2012; Ng, Liu, Sze, & Yeung, 1994; Scholthof và cộng sự, 2011). Điều này cho thấy tiềm năng rất lớn khi ứng dụng hoạt tính kháng nấm và kháng virus của protein α-MMC vào việc kiểm soát và điều trị các bệnh trên cây trồng do nấm và virus gây ra. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thảo luận về cơ chế hoat động của α- MMC cũng như là khả năng kháng nấm và virus của protein α-MMC cũng như là tiềm năng ứng dụng của protein này trong nông nghiệp cây trồng. Hình 1. Mô hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của ribosome-inactivating proteins (Zhu và cộng sự, 2018) 74 Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 2. Cơ chế hoạt động của protein alpha- momorcharin (α-MMC) Protein α-MMC thuộc nhóm protein bất hoạt ribosome được tìm thấy trong hạt trái khổ qua (hay mướp đắng) gồm 286 amino acid. Trong đó tiểu phần hoạt tính có 246 amino acid (từ vị trí amino acid 24 đến vị trí amino acid 269). Tiểu phần hoạt tính đóng vai trò xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase trong phân tử RNA ribosome, dẫn đến bất hoạt hệ thống RNA ribosome. Điều này làm ức chế các quá trình dịch mã tạo protein của tế bào. Trong cấu trúc tiểu phần hoạt tính, ba amino acid: Ile71, Glu160 và Arg163 đóng vai trò quan trọng trong vai trò xúc tác thủy phân của α-MMC. Trong khi Glu160 tích điện âm đóng vai trò ổn định ion oxycarbonium, những liên kết hydrogen ở vị trí N1 và N3 của Adenine với Ile71 và Arg163 tạo điều kiện thuận lợi cho việc α-MMC bẻ gãy liên kết cộng hóa trị giữa N9 của Adenine và C1 của khung đường (Hình 2) (Ren, Wang, Dong, & Stuart, 1994). Sự bẻ gãy liên kết giữa Adenine và khung đường bởi α-MMC dẫn đến bất hoạt RNA ribosome và ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào làm giết chết tế bào. Hình 2. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung đường trong phân tử RNA ribosome (Ren và cộng sự, 1994) 3. Vai trò của α-MMC trong việc kháng nấm cho cây trồng Nông nghiệp cây trồng đang phải chịu sự tấn công của nhiều loại nấm làm cho năng suất cây trồng giảm đi đáng kể. Do đó, chế phẩm sinh học từ thiên nhiên giúp cho cây trồng kháng lại những mầm bệnh là điều cấp thiết hiện nay. Trong nghiên cứu về vai trò α-MMC trong việc kháng nấm, các nhà khoa học đã trình bày về khả năng kháng lại những nấm gây hại cho cây trồng của protein α-MMC. Các loại nấm gây hại cho mùa màng được sử dụng trong nghiên cứu này như: Bipolaris maydis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum and Sclerotinia selerotiorum (Zhu và cộng sự, 2013) (Hình 3). Kết quả cho thấy tất cả các loại nấm bị ức chế 67% (Bipolaris maydis), 65% (Aspergillus niger), 53% (Aspergillus oryzae), 51% (Fusarium graminearum) và 50% (Sclerotinia selerotiorum) khi có sự hiện diện của α-MMC (500 µg/ml) so với các mẫu đối chứng. α-MMC kháng trên 50% đối với các chủng nấm, trong đó có khả năng kháng Bipolaris maydis cao nhất lên đến 67%. Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 75 Hình 3. Khả năng kháng của α-MMC đối với các loại nấm gây hại cho cây trồng như. Bipolaris maydis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum and Sclerotinia selerotiorum (Zhu và cộng sự, 2013) Khả năng kháng của α-MMC cũng tùy thuộc vào nồng độ và thời gian. α-MMC ức chế sự nảy mầm của bào tử, do đó ức chế sự lan rộng của nấm. Hiện nay, cơ chế kháng của α-MMC được cho là giống những protein khác, chúng phá vỡ màng của nấm và xâm nhiễm vào bên trong dẫn đến giết chết tế bào nấm (Zhu và cộng sự, 2018). 4. Vai trò của α-MMC trong việc kháng cucumber mosaic virus (CMV) Nghiên cứu vai trò của α-MMC trong quá trình ức chế sự nhân lên của virus CMV gây bệnh cho cây trồng đã được thực hiện (Yang và cộng sự, 2016). Trong thí nghiệm vai trò α-MMC kháng lại CMV, lá cây được xử lý với α-MMC hoặc nước trước khi cho nhiễm virus CMV. Kết quả cho thấy sự phiên mã để tạo ra RNA của của virus CMV giảm nhiều ở lá cây được xử lý α-MMC và ngay trong cả lá non (Hình 4A). Hình 4. Ảnh hưởng của α-MMC lên hàm lượng JA và SA. Hàm lượng của JA (A) và SA (B) trong lá cây khi xử lý với virus CMV hay cả CMV và α-MMC (Yang và cộng sự, 2016) Kết quả phân tích western blot (hình 4B) của hàm lượng protein trong CMV giảm nhiều đối với những mẫu có xử lý α-MMC so với những mẫu được xử lý với nước. Từ đó cho thấy được α-MMC đóng vai trò quan trọng trong việc kháng lại virus CMV. Hiện nay, cơ 76 Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 chế kháng virus của α-MMC có liên quan đến hormon jasmonic acid (JA), α-MMC kích thích tăng hàm lượng JA dẫn đến việc ức chế sự phát triển của virus. Ngoài ra, cơ chế kháng virus của α-MMC còn liên quan đến con đường khác như Reactive oxygen species (ROS), tuy nhiên cơ chế này chưa được rõ ràng (Yang và cộng sự, 2016; Zhu và cộng sự, 2018). Việc kháng lại virus CMV mang ý nghĩa thực tiễn cao trong việc sử dụng protein α-MMC như một chế phẩm sinh học trong việc đề kháng lại bệnh của cây gây ra bởi virus. Hormon jasmonic acid (JA) và salicylic acid (SA) đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng tác nhân gây bệnh như virus hay nấm của cây trồng (Oka, Kobayashi, Mitsuhara, & Seo, 2013; Ryu, Murphy, Mysore, & Kloepper, 2004; Sun và cộng sự, 2017). Kết quả nghiên cứu về mối tương quan giữa hàm lượng hormon JA, SA với protein α-MMC cho thấy hàm lượng JA tăng lên khi cây trồng bị nhiễm Cucumber Mosaic virus (CVM) được xử lý với α-MMC, trong khi hàm lượng SA không thay đổi (Hình 5) (Yang và cộng sự, 2016). Hình 5. Ảnh hưởng củaα-MMC lên hàm lượng JA và SA. Hàm lượng của JA (A) và SA (B) trong lá cây khi xử lý với virus CMV hay cả CMV và α-MMC. (Yang và cộng sự, 2016) Kết quả của hình 5A cho thấy hàm lượng của JA trong lá cây không thay đổi khi ủ lá cây với nước, virus CMV hay α-MMC so với đối chứng. Nhưng khi ủ lá cây với cả virus CMV và α-MMC hàm lượng JA tăng lên đáng kể. Điều này cho thấy được sự ảnh hưởng của α-MMC lên sự tăng hàm lượng JA đối với mẫu lá nhiễm virus CMV. Tuy nhiên không có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng SA khi xử lý lá cây với cả CMV và α-MMC. 5. Sử dụng α-MMC như một chế phẩm sinh học cho việc kháng lại nấm và virus gây hại cho cây trồng Protein α-MMC thuộc nhóm ribosome- inactivating proteins được tìm thấy trong hạt cây khổ qua, có khả năng kháng nấm và virus gây bệnh cho cây trồng. Tận dụng nguồn tự nhiên từ hạt khổ qua hoặc sinh tổng hợp trong vi khuẩn E.coli có thể tạo nên chế phẩm vi sinh cho cây trồng kháng lại tác nhân gây bệnh của nấm hay virus. Ngoài ra, phương pháp chuyển gen mã hóa cho α-MMC vào trong cây trồng, có thể giúp cây trực tiếp đề kháng lại những tác nhân gây hại này. Hiện nay, nhóm chúng tôi dựa vào α-MMC để phát triển những protein chế phẩm sinh học mới có thể kháng đặc hiệu những nấm hay virus với hoạt tính cao (kết quả chưa công bố). Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 77 6. Kết luận Alpha-momorcharin cho thấy được khả năng kháng lại virus và nấm gây hại cho cây trồng. Do đó, α-MMC được xem là protein mục tiêu tiềm năng cho việc phát triển và tối ưu hóa chức năng cũng như sản xuất chế phẩm sinh học trong việc kháng bệnh của cây trồng trong nông nghiệp Tài liệu tham khảo Dean, R., Van Kan, J. A., Pretorius, Z. A., Hammond-Kosack, K. E., Di Pietro, A., Spanu, P. D., . . . Foster, G. D. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol, 13(4), 414-430. doi:10.1111/j.1364-3703.2011.00783.x Deng, N. H., Wang, L., He, Q. C., Zheng, J. C., Meng, Y., Meng, Y. F., . . . Shen, F. B. (2016). PEGylation alleviates the non-specific toxicities of Alpha-Momorcharin and preserves its antitumor efficacy in vivo. Drug Deliv, 23(1), 95-100. doi:10.3109/10717544.2014.905652 Doehlemann, G., Okmen, B., Zhu, W., & Sharon, A. (2017). Plant Pathogenic Fungi. Microbiol Spectr, 5(1). doi:10.1128/microbiolspec.FUNK-0023-2016 Fabbrini, M. S., Katayama, M., Nakase, I., & Vago, R. (2017). Plant Ribosome-Inactivating Proteins: Progesses, Challenges and Biotechnological Applications (and a Few Digressions). Toxins (Basel), 9(10). doi:10.3390/toxins9100314 Marche, S., Roth, C., Manohar, S. K., Dollet, M., & Baltz, T. (1993). RNA virus-like particles in pathogenic plant trypanosomatids. Mol Biochem Parasitol, 57(2), 261-267. Ng, T. B., Liu, W. K., Sze, S. F., & Yeung, H. W. (1994). Action of alpha-momorcharin, a ribosome inactivating protein, on cultured tumor cell lines. Gen Pharmacol, 25(1), 75-77. Oka, K., Kobayashi, M., Mitsuhara, I., & Seo, S. (2013). Jasmonic acid negatively regulates resistance to Tobacco mosaic virus in tobacco. Plant Cell Physiol, 54(12), 1999-2010. doi:10.1093/pcp/pct137 Ren, J., Wang, Y., Dong, Y., & Stuart, D. I. (1994). The N-glycosidase mechanism of ribosome- inactivating proteins implied by crystal structures of alpha-momorcharin. Structure, 2(1), 7-16. Ryu, C. M., Murphy, J. F., Mysore, K. S., & Kloepper, J. W. (2004). Plant growth-promoting rhizobacteria systemically protect Arabidopsis thaliana against Cucumber mosaic virus by a salicylic acid and NPR1-independent and jasmonic acid-dependent signaling pathway. Plant J, 39(3), 381-392. doi:10.1111/j.1365-313X.2004.02142.x Scholthof, K. B., Adkins, S., Czosnek, H., Palukaitis, P., Jacquot, E., Hohn, T., . . . Foster, G. D. (2011). Top 10 plant viruses in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol, 12(9), 938- 954. doi:10.1111/j.1364-3703.2011.00752.x Sun, Y. C., Pan, L. L., Ying, F. Z., Li, P., Wang, X. W., & Liu, S. S. (2017). Jasmonic acid- related resistance in tomato mediates interactions between whitefly and whitefly- transmitted virus. Sci Rep, 7(1), 566. doi:10.1038/s41598-017-00692-w Termorshuizen, A. J. (2016). Ecology of Fungal Plant Pathogens. Microbiol Spectr, 4(6). doi:10.1128/microbiolspec.FUNK-0013-2016 78 Nguyễn T. T. Thảo và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 72-78 Yang, T., Meng, Y., Chen, L. J., Lin, H. H., & Xi, D. H. (2016). The Roles of Alpha- Momorcharin and Jasmonic Acid in Modulating the Response of Momordica charantia to Cucumber Mosaic Virus. Front Microbiol, 7, 1796. doi:10.3389/fmicb.2016.01796 Zheng, Y. T., Ben, K. L., & Jin, S. W. (1999). Alpha-momorcharin inhibits HIV-1 replication in acutely but not chronically infected T-lymphocytes. Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20(3), 239-243. Zhu, F., Zhang, P., Meng, Y. F., Xu, F., Zhang, D. W., Cheng, J., . . . Xi, D. H. (2013). Alpha- momorcharin, a RIP produced by bitter melon, enhances defense response in tobacco plants against diverse plant viruses and shows antifungal activity in vitro. Planta, 237(1), 77-88. doi:10.1007/s00425-012-1746-3 Zhu, F., Zhou, Y. K., Ji, Z. L., & Chen, X. R. (2018). The Plant Ribosome-Inactivating Proteins Play Important Roles in Defense against Pathogens and Insect Pest Attacks. Front Plant Sci, 9, 146. doi:10.3389/fpls.2018.00146