Biệt hóa ba dòng tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu ở người

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 18 BIỆT HÓA BA DÒNG TẾ BÀO MÁU TỪ TẾ BÀO GỐC DÒNG TẠO MÁU Ở NGƯỜI Nguyễn Thụy Loan Chi*, Miri Nezhad Ayda**, Fichelson Serge** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Máu cuống rốn là một trong những nguồn cung cấp chính của tế bào gốc dòng tạo máu. Ngày nay, liệu pháp sử dụng tế bào gốc dòng tạo máu đang được ứng dụng để điều trị những bệnh lý huyết học. Những tế bào này vốn là tế bào gốc đa năng nên chúng có khả năng biệt hóa thành hầu hết các dòng tế bào máu khi được nuôi trong môi trường có bổ sung những tác nhân biệt hóa thích hợp. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm sử dụng ba hỗn hợp cytokine để biệt hóa tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào tủy (myeloid linages): dòng hồng cầu (erythrocytic), dòng bạch cầu hạt (granulocytic) và dòng tiểu cầu (megakaryocytic). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đây là nghiên cứu thực nghiệm. Những tế bào gốc dòng tạo máu được thu nhận nhờ biểu hiện kháng nguyên CD34+ trên bề mặt tế bào. Sau đó, chúng được nuôi cấy trong môi trường IMDM, 15% BIT có bổ sung những cytokine thích hợp. Kết quả: Quần thể tế bào phân lập được từ máu cuống rốn có mật độ tế bào CD34+ tối thiểu là 85%. Cuối quá trình biệt hóa thực nghiệm, sự biến mất của CD34 và đồng thời tăng rõ rệt những kháng nguyên bề mặt đặc hiệu đã chứng minh các tế bào CD34+ đều được biệt hóa thành công. Kết luận: Công trình này mở ra hướng ứng dụng trong tương lai cho ngành huyết học và truyền máu cụ thể như việc sản xuất máu ngoài cơ thể nhằm cung cấp nguồn máu “sạch” và ổn định cho bệnh nhân. Từ khóa: tế bào gốc dòng tạo máu, tế bào CD34+, biệt hóa tế bào. ABSTRACT DIFFERENTIATE HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS INTO THREE LINAGES OF BLOOD CELLS Nguyen Thi Loan Chi, Miri Nezhad Ayda, Fichelson Serge * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 18 - 23 Background: One of the important sources of hematopoietic stem cells (HSCs) is umbilical cord blood. Nowadays, HSC cell-based therapies are applied in treatment of hematological disorders. HSCs are multipotent, so these cells have ability to differentiate into all hematopoietic linages very effectively in culture under different combinations of cytokines. Therefore, in this study, we aimed to apply three mixtures of cytokines to differentiate HSCs into three myeloid linages of blood cells: erythrocytic, granulocytic and megakaryocytic linage. Material and method: This is an experimental study. HSCs were isolated by CD34+ antigenes expressed on their surfaces. Then, they were cultured in IMDM plus 15% BIT and supplied by suitable cytokines. Results: We collected a CD34+ population with more than 85% of purification from cord blood. At the end of the differentiation experiments, all of the cultured cells were matured into three linages of blood cells because CD34+ antigenes disappeared and the differentiation markers strongly increased. Conclusion: This study opened future applications for medicine of Hematology and Blood transfusion , especially, the ex-vivo production of blood cells will supply a non-infected, stable and donorless source of blood. Key words: Hematopoietic stem cells, HSC, CD34+ cells, differentiaion. * Bộ môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử - ĐHYK Phạm Ngọc Thạch; ** Khoa Huyết Học - Viện Cochin -Paris, Pháp Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Thụy Loan Chi Email: ngloanchi@gmail.com ** Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 19 ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc dòng tạo máu (Hematopoietic stem cell- HSC) là một quần thể rất ít những tế bào, mang đặc tính của tế bào gốc, nghĩa là chúng có khả năng tự nhân lên và biệt hóa thành mọi dòng tế bào máu trong suốt đời sống con người. Do đó, chúng hoàn toàn có khả năng được sử dụng trong ghép tủy để điều trị những bệnh ác tính về máu(4). Đồng thời, trong tương lai, giới khoa học mong muốn có thể sản xuất máu nhân tạo với số lượng lớn, hứa hẹn một cuộc cách mạng cho ngành y tế, bởi nó mang lại một nguồn cung máu ổn định và giảm nguy cơ truyền nhiễm do truyền máu. Những tế bào gốc này thường lưu trú trong tủy xương- nơi diễn ra quá trình tạo máu, tuy nhiên chúng ta cũng có thể phân lập chúng trong máu cuống rốn. Một số dấu ấn trên màng (như CD34+, CD133+) giúp chúng ta có thể phân lập những tế bào này. Sự tạo máu là quá trình sản xuất ra các loại tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu đa chức năng. Một tế bào này có thể đi theo hai hướng biệt hóa: hướng dòng tủy và hướng dòng lympho để hình thành những tế bào đầu dòng tủy (common myeloid progenitor cell- CMP) và những tế bào đầu dòng lympho (common lymphoid progenitor cell- CLP). Những CMP sẽ biệt hóa tiếp tục thành bạch cầu hạt, hồng cầu và tiểu cầu. Trong khi đó, những CLP sẽ hình thành nên tế bào lympho T, B và tế bào NK (Natural killer cell) (Hình 1). Hình 1: Quá trình tạo máu và vai trò của các cytokine trong sự biệt hóa in-vivo(5). SCF= Stem Cell Factor, IL= Interleukin, GM-CSF= Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor, G-CSF=Granulocyte-Colony Stimulating Factor, M-CSF= Monocyte-macrophage-Colony Stimulating Factor, EPO= Erythropoietin, TPO= Thrombopoietin). HSC= Hematopoietic stem cell: tế bào gốc dòng tạo máu, Multipotent stem cell: tế bào gốc đa năng, CMP= common myeloid progenitor cell: tế bào đầu dòng của dòng tủy, CLP= common lymphoid progenitor: tế bào đầu dòng của dòng lympho, BCP= B-cell progenitor: tế bào đầu dòng B, EP= erythroid progenitor: tế bào đầu dòng hồng cầu, GMP= granulocyte–macrophage progenitor: tế bào đầu dòng bạch cầu hạt- đại thực bào; MEP= megakaryocyte erythroid progenitor= tế bào đầu dòng hồng cầu- tiểu cầu, MkP= megakaryocyte progenitor: tế bào đầu dòng tiểu cầu, TNK= T-cell natural killer cell progenitor: tế bào đầu dòng NK và lympho T; Primitive progenitor cell: tế bào đầu dòng nguyên thủy; Commited precursor cell: tế bào đầu dòng tiền phân hóa; Lineage commited cell: tế bào đã biệt hóa theo dòng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 20 Sự tăng trưởng của những tế bào gốc dòng tạo máu theo hướng dòng tủy (myeloid linages) đã được chứng minh nhờ vào một số cytokine chính yếu sau (Hình 1): - Yếu tố tế bào gốc (stem cell factor- SCF): điều hòa giai đoạn đầu của quá trình tạo máu. - Yếu tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt: Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). - Interleukin 3 (IL-3): liên quan đến sự tăng sinh và biệt hóa của nhiều tế bào đầu dòng trong quá trình tạo máu. - Interleukin 6 (IL-6): kích thích những tế bào vẫn còn khả năng biệt hóa thành dòng tủy, ức chế hướng biệt hóa dòng lympho(2). - Ngoài ra, Erythropoietin (EPO) cần thiết để những CMP biệt hóa thành hồng cầu và Thrombopoietin giúp những CMP biệt hóa thành mẫu tiểu cầu (megakaryocyte). Cũng theo y văn, trong những phương pháp nuôi cấy in vitro tế bào gốc dòng tạo máu, việc sử dụng hỗn hợp những cytokine tỏ ra hữu hiệu và an toàn. Đồng thời, chúng cũng thúc đẩy sự biệt hóa của những tế bào gốc và tế bào tạo máu đầu dòng (hematopoietic precusors). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng những tổ hợp cytokine để nuôi cấy và biệt hóa các tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào: hồng cầu, bạch cầu hạt và tiểu cầu. ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV ở khoa sản Viện Cochin (Paris). Sau khi thai nhi vừa được sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng và cắt trên vị trí kẹp 1 cm. Dùng kim tiêm của túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đông máu) đưa vào cuống rốn ở vị trí gần nhau thai. Máu cuống rốn sẽ theo kim và ống dẫn chảy vào túi thu máu. Khi máu hết chảy, rút kim ra và mang túi chứa máu về phòng thí nghiệm. Nuôi cấy và biệt hóa tế bào Những tế bào CD34+ phân lập từ máu cuống rốn được nuôi cấy trong môi trường IMDM, bổ sung BIT 15% (StemCell Technologies) vốn là hỗn hợp gồm huyết thanh bò (Bovine serum albumin- BSA), Insulin và Transferrin. Đồng thời, các tế bào gốc này trưởng thành và biệt hóa với sự hiện diện của những cytokine tái tổ hợp: SCF; IL-3, EPO, IL-6 (cho dòng hồng cầu)(3); IL-3, G-CSF, Flt-3 (cho dòng bạch cầu hạt)(1,7); TPO (cho dòng tiểu cầu)(6). Hàng ngày, các tế bào được đếm số lượng, bổ sung môi trường và cytokine khi cần thiết. Môi trường nuôi cấy cũng được bổ sung Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) và L- Glutamine (2 mM). Những tế bào được nuôi và biệt hóa ở điều kiện 370C, 5% CO2. Hàng ngày, các tế bào đều được đếm số lượng với buồng đếm và dưới kính hiển vi quang học để theo dõi sự tăng trưởng của chúng. Phân lập tế bào CD34+ từ máu cuống rốn Về nguyên tắc, máu trong cuống rốn luôn chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu (HSC), tế bào máu trưởng thành và tế bào gốc trung mô. Các tế bào gốc trung mô và tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể các tế bào đơn nhân. Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll (Lymphoprep®, Thụy Điển) ở tốc độ 1.700 vòng/phút, trong 30 phút. Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll và lớp huyết tương bên trên. Rửa tế bào với PBS và ủ 30 phút ở 4oC với FcR blocking solution và kháng thể kháng CD34. Phân lập các tế bào CD34+ nhờ hệ thống cột lọc MACS LS (Miltenyi Biotech, Đức). Phân tích tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow cytometry) Kỹ thuật tế bào dòng chảy được thực hiện trên máy FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson) với phần mềm Cell Quest. Kỹ thuật này cho phép đánh giá mật độ tế bào CD34+ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 21 phân lập từ máu cuống rốn và theo dõi động học của những dấu ấn miễn dịch CD34, CD36, GPA, CD14, CD15, CD11b, CD41a và CD42b tại ngày thứ 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa tế bào gốc dòng tạo máu. Mỗi mẫu khảo sát gồm khoảng 20.000 tế bào nuôi cấy được rửa sạch với PBS-BSA. Ủ các tế bào cần khảo sát với kháng thể đặc hiệu cho từng dòng tế bào (hồng cầu, bạch cầu hạt, tiểu cầu) trong 20 phút, ở 4oC trước khi phân tích qua máy. KẾT QUẢ- BÀN LUẬN Hiệu quả của kỹ thuật phân lập tế bào CD34+ từ màu cuống rốn Để đánh giá tỷ lệ tế bào CD34+ trong quần thể tế bào phân lập được từ máu cuống rốn, 20.000 tế bào sau phân lập từ máu cuống rốn được ủ trực tiếp với kháng thể kháng CD34 có gắn allophycocyanine (APC). Kết quả phân tích qua máy FACS cho biết tỷ lệ tế bào CD34+ thực sự trong quần thể tế bào sau phân lập thường dao động trong khoảng 80%-95%. Chỉ những quần thể có tỷ lệ tế bào CD34+ trên 85% mới được tiến hành nuôi cấy và biệt hóa. Hình 2: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ tế bào CD34+ phân lập từ máu cuống rốn. Biệt hóa thành dòng hồng cầu Những tế bào CD34+ trên được nuôi cấy trong môi trường IMDM, BIT 15%. Chúng nhân lên và biệt hóa dưới sự tác dụng của những cytokines tái tổ hợp: SCF, IL3, IL6. Vào ngày thứ 7 của quá trình biệt hóa, EPO được bổ sung vào môi trường nuôi giúp hoàn chỉnh sự biệt hóa dòng hồng cầu. Số lượng tế bào được đếm hằng ngày cho thấy có sự tăng khoảng gấp đôi dân số tế bào sau 24 giờ nuôi cấy. Kết quả phân tích những dấu ấn trên bề mặt tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy cho thấy hàm lượng dấu ấn tế bào gốc là CD34 giảm dần và biến mất vào ngày thứ 11. Trong khi đó, GPA (dấu ấn đặc trưng cho dòng hồng cầu) và CD36 (protein trên màng hồng cầu) lại dần tăng lên; bắt đầu tăng mạnh từ ngày thứ 7 và 11; cuối cùng, đạt tương ứng 88% và 100% ở ngày 14 của quá trình biệt hóa. Điều đó chứng minh rằng, tế bào đã mất dần tính năng tế bào gốc và biệt hóa hoàn toàn thành dòng hồng cầu sau 14 ngày nuôi cấy. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 22 Hình 3: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ phần trăm của các dấu ấn CD34, GPA, CD36 trên bề mặt tế bào được biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng hồng cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa. Biệt hóa thành dòng bạch cầu hạt Chúng tôi sử dụng môi trường IMDM và bổ sung tổ hợp cytokine SCF, IL3, Flt-3 và G-CFS để hướng các tế bào CD34+ biệt hóa thành dòng bạch cầu hạt. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy khi đếm quần thể tế bào được biệt hóa thành dòng bạch cầu: số lượng tế bào nhân lên gấp đôi sau 24 giờ. Tuy nhiên, đến ngày 24-26 của quá trình biệt hóa, các tế bào không thể tiếp tục phát triển hay biệt hóa thêm. Phân tích động học các kháng thể trên màng những tế bào này trong suốt quá trình biệt hóa cho thấy: CD34 giảm dần và biến mất vào ngày 11; ngược lại, những dấu ấn chính của dòng bạch cầu hạt như: CD14, CD15, CD11b tăng chậm trong 7 ngày đầu tiên, sau đó tăng rõ rệt tiến đến 50%. Như vậy, quần thể tế bào gốc ban đầu đã được biệt hóa thành công thành những tế bào đầu dòng của dòng bạch cầu hạt. Hình 4: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ phần trăm của các dấu ấn CD34, CD15, CD14, CD11b trên bề mặt tế bào được biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng bạch cầu hạt vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa. Biệt hóa thành dòng tiểu cầu Hỗn hợp cytokine bổ sung vào môi trường nuôi cấy để biệt hóa tế bào CD34+ thành dòng tiểu cầu bao gồm SCF và TPO. Số lượng tế bào cũng tăng lên gấp đôi sau 24 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, đến ngày 14-15, các tế bào có dấu hiệu ngừng tăng trưởng và chết. Chúng tôi theo dõi sự biệt hóa của các tế bào thành dòng megakaryocyte bằng nhóm kháng nguyên: CD41a, CD42b. Phân tích các dấu ấn bề mặt cho thấy: CD34 giảm rất nhanh trong quá trình biệt hóa nhưng đến ngày 14 vẫn còn hiện diện 4,6%; trong khi đó, CD41a và CD42b tăng chậm trong 7 ngày đầu và cuối cùng đạt CD41a 74%, CD42b 40% ở ngày 14 của quá trình biệt hóa. Như vậy, những tế bào này đã được biệt hóa hướng về dòng tiểu cầu. pe rc en ta ge pe rc en ta ge Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 23 Hình 5: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ phần trăm của các dấu ấn CD34, CD42b, CD42a trên bề mặt tế bào được biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng tiểu cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa. KẾT LUẬN Chúng tôi đã thu nhận tế bào CD34+ với mật độ cao (>80%). Các tế bào gốc dòng tạo máu này đã được biệt hóa thành công thành ba dòng tế bào: hồng cầu, bạch cầu hạt, tiểu cầu khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung những cytokine thích hợp để kích thích sự biệt hóa đặc điệu cho từng dòng. Công trình này mở ra hướng ứng dụng trong tương lai cho ngành huyết học và truyền máu cụ thể như việc sản xuất máu ngoài cơ thể nhằm cung cấp nguồn máu “sạch” và ổn định cho bệnh nhân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Haylock DN, To LB et al. (1992). "Ex vivo expansion and maturation of peripheral blood CD34+ cells into the myeloid lineage." Blood 80(6): 1405-1412. 2. Maeda K, Malykhin A, et al. (2009). "Interleukin-6 aborts lymphopoiesis and elevates production of myeloid cells in systemic lupus erythematosus-prone B6.Sle1.Yaa animals." Blood 113(19): 4534-4540. 3. Migliaccio G, Di Pietro R, et al. (2002). "In vitro mass production of human erythroid cells from the blood of normal donors and of thalassemic patients." Blood Cells Mol Dis 28(2): 169-180. 4. Mimeault M, Hauke R, et al. (2007). "Stem cells: a revolution in therapeutics-recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies." Clin Pharmacol Ther 82(3): 252-264. 5. Robb L. (2007). "Cytokine receptors and hematopoietic differentiation." Oncogene 26(47): 6715-6723. 6. Shaw PH, D Gilligan, et al. (2003). "Ex vivo expansion of megakaryocyte precursors from umbilical cord blood CD34 cells in a closed liquid culture system." Biol Blood Marrow Transplant 9(3): 151-156. 7. Tura O, GR Barclay, et al. (2007). "Optimal ex vivo expansion of neutrophils from PBSC CD34+ cells by a combination of SCF, Flt3-L and G-CSF and its inhibition by further addition of TPO." J Transl Med 5: 53. pe rc en ta ge