Biểu hiện EGFR và mối tương quan với Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 61 BIỂU HIỆN EGFR VÀ MỐI TƯƠNG QUAN VỚI Ki-67 TRÊN CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG Phan Đặng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ biểu hiện EGFR và mối tương quan với biểu hiện Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Phương pháp và đối tượng nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu gồm 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009. Kết quả: Tỷ lệ dương tính với EGFR là 61,3%. Liên quan không có ý nghĩa thống kê với tuổi, giới, vị trí u, kích thước u, hình ảnh đại thể, loại mô học, độ mô học, xâm nhập mạch máu. Liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện EGFR với đặc điểm xâm lấn, xâm nhập mạch lymphô. Liên quan không có ý nghĩa thống kê với biểu hiện Ki-67. Kết luận: Biểu hiện EGFR trên carcinôm tuyến đại trực tràng khá cao và có liên quan với đặc điểm xâm lấn và xâm nhập mạch lymphô. Không liên quan với biểu hiện Ki-67. Từ khóa: Carcinom tuyến đại trực tràng, biểu hiện EGFR, biểu hiện Ki-67. ABSTRACT EXPRESSION OF EGFR AND CORRELATION WITH Ki-67 EXPRESSTION IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA Phan Dang Anh Thu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 60 - 65 Objective: To determine the expression rate of EGFR and its correlation with expression of Ki-67 in colorectal adenocarcinoma. Methods: A cross-sectional study with 106 cases of colorectal adenocarcinoma diagnosed at the department of pathology, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City. The specimens were examined with H&E staining and immunohistochemical staining with monoclonal antibody EGFR and Ki-67. Results: In our study, the positive expression rate of EGFR is 61.3%. In multivariate analysis, no correlation was found between expression of EGFR and some characteristics such as age, gender, tumor site, macroscopic findings, tumor grade, histological types and vascular invasion and expression of Ki-67. Correlation between expression of EGFR and depth of invasion and lymphatic invasion was statistically significant. Conclusion: The expression rate of EGFR is rather high in colorectal adenocarcinoma and significantly correlated with depth of invasion and lymphatic invasion. Key words: Colorectal adenocarcinoma, expression of EGFR, expression of Ki-67. ĐẶT VẤN ĐỀ Liệu pháp trúng đích trong ung thư là một phương pháp điều trị tiên tiến. Đối với một số ung thư, liệu pháp trúng đích làm giảm tỷ lệ tái phát và tử vong. Trong ung thư đại trực tràng, áp dụng liệu pháp trúng đích trên các thụ thể các yếu tố tăng trưởng thượng bì đã được thế * Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phan Đặng Anh Thư ĐT: Email: phandanganhthu@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 62 giới công nhận năm 2004(20). Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì gồm bốn thành viên HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 và HER-4. EGFR hay HER-1, c-ErbB-1 là thụ thể tyrosine kinase nằm trên bề mặt tế bào, một protein xuyên màng có trọng lượng phân tử 170 kDa, được kích hoạt khi gắn kết với các ligand đặc hiệu như yếu tố tăng trưởng (EGF) hay yếu tố chuyển dạng tăng trưởng anpha (TGF). EGFR có thể bắt cặp với các thành viên khác trong gia đình (bắt cặp khác loại) hoặc bắt cặp với chính nó (bắt cặp cùng loại). Sau khi bắt cặp, miền nội bào sẽ được phosphoryl hóa, kích hoạt hàng loạt dòng thác tín hiệu nội bào thông qua hai con đường tín hiệu chính PLC/PKC và RAS/RAF/MEK/ERK(4,6) Theo nhiều nghiên cứu, EGFR dương tính trong ung thư đại trực tràng với tỷ lệ 25- 77%(10,14,17), tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về điều trị trúng đích đối với EGFR. Mendelsohn và cộng sự đã phát triển các kháng thể kháng EGFR gồm mAb225 (C225, Cetuximab) và mAb528 và ghi nhận tác dụng của mAb225 trên chuột thực nghiệm(16). Cetuximab được chỉ định đối với các trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng có biểu hiện quá mức EGFR (phát hiện bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch). Theo một số nghiên cứu, bản thân EGFR cũng là một yếu tố tiên lượng độc lập. Ngoài ra, mức độ tăng sinh tế bào u cũng là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng. Ki-67 là kháng nguyên căn bản để xác định hoạt động của tế bào. Kháng nguyên Ki-67 biểu hiện trong nhân tế bào ở pha G1, S, G2 và M của chu trình tế bào, trừ pha nghỉ Go. Vì thế chúng tôi thực hiện đề tài này với mục đích xác định tỷ lệ biểu hiện EGFR trên carcinôm tuyến đại trực tràng, góp phần nghiên cứu áp dụng điều trị nhắm trúng đích với EGFR đồng thời xác định mối tương quan với biểu hiện Ki-67 trên ung thư này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu 106 bệnh nhân được chẩn đoán là carcinôm tuyến đại trực tràng tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh - Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 9/2008 đến tháng 5/2009. - Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang. - Các bước tiến hành - Thu thập số liệu. - Các mẫu ung thư đại trực tràng đều được cố định bằng formol. U được lấy ít nhất hai mẫu. - Ghi nhận đầy đủ các dữ kiện lâm sàng của bệnh nhân từ phiếu trả lời kết quả giải phẫu bệnh gồm: họ tên, tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể (dạng loét, dạng sùi, dạng chít hẹp, dạng xâm nhiễm, dạng phối hợp). - Đọc kết quả trên tiêu bản nhuộm Hematoxyline Eosine + Loại mô học: Carcinôm tuyến không chế nhầy, carcinôm tuyến nhầy, carcinôm tuyến dạng tế bào mặt nhẫn. + Độ mô học: Gồm biệt hóa rõ, vừa, kém theo phân loại của AFIP + Đánh giá mức độ xâm lấn của u - Khảo sát kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch EGFR, Ki-67 dưới kính hiển vi quang học cùng với bác sỹ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm về hóa mô miễn dịch. - Kỹ thuật nhuộm EGFR bằng hóa mô miễn dịch - Sửa soạn tiêu bản vùi nến + Cắt mỏng mẫu mô 3 – 5μm và đặt vào lam sạch có tráng silan. + Ủ tiêu bản ở nhiệt độ 56oC trong 1 - 2 giờ trước khi nhuộm. - Kháng thể được sử dụng Kháng thể EGFR (clone 111.6) của Neomarker, Mỹ, là kháng thể đơn dòng pha sẵn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 63 - Nhuộm hóa mô miễn dịch với EGFR - Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 3% 5 phút. - Ủ dung dịch Proteinase K 5 phút. - Ủ với kháng thể thứ nhất 30 phút. - Ủ polymer khuếch đại tín hiệu 30 phút. - Ủ dung dịch phát hiện tín hiệu 30 phút. - Ủ dung dịch DAB 10 phút. - Nhuộm tương phản với Hematoxylin. - Đánh giá EGFR trên carcinôm tuyến đại trực tràng Dựa vào tỷ lệ % tế bào u bắt màu trên màng bào tương và cường độ bắt màu (ở độ phóng đại x 200)(9). Âm tính Không bắt màu trên màng bào tương hoặc bắt màu trong bào tương. Dương tính 1(+): màng bào tương bắt màu nhạt > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn hoặc một phần màng bào tương. 2(+): màng bào tương bắt màu trung bình > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn hoặc một phần màng bào tương. 3(+): màng bào tương bắt màu đậm > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn màng bào tương tạo hình ảnh mạng lưới. Kỹ thuật nhuộm Ki-67 bằng hóa mô miễn dịch - Sửa soạn tiêu bản vùi nến + Cắt mỏng mẫu mô 3 – 5μm và đặt vào lam sạch có tráng silan. + Ủ tiêu bản ở nhiệt độ 56oC trong 1 - 2 giờ trước khi nhuộm. - Kháng thể được sử dụng Kháng thể MIB-1 (Ki-67) của DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha loãng 1/25. - Nhuộm hóa mô miễn dịch với Ki-67 - Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 3% 5 phút. - Ủ kháng thể đơn dòng đã pha loãng 30-40 phút. - Ủ kháng thể thứ hai có gắn biotin 30 phút. - Ủ phức hợp streptavidine peroxydase 20 phút. - Ủ dung dịch DAB 5-10 phút. - Nhuộm tương phản với Hematoxyline. - Cách đánh giá Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng Đánh giá biểu hiện Ki-67 dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu và cường độ bắt màu. Sự biểu hiện của Ki-67 được đánh giá tổng thể và xem xét trên các vùng khác nhau (ở độ phóng đại x 200)(8). Tỷ lệ dương tính với Ki-67 trên tế bào u được phân loại như sau(15): - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67. - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67. - Dương tính 3(+) với hơn 60% tế bào u bắt màu Ki-67. - Xử lý số liệu Số liệu trong các phiếu thu thập được tổng hợp, phân tích và xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Biểu hiện EGFR Biểu hiện EGFR Tỷ lệ % Âm tính 38,7 Dương tính 1(+) 15,1 Dương tính 2(+) 24,5 Dương tính 3(+) 21,7 Khảo sát 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng ghi nhận, tỷ lệ dương tính với EGFR là 61,3%, trong đó dương tính 3(+) chiếm 21,7% (23 trường hợp), dương tính 2(+) 24,5% (26 trường hợp), dương tính 1(+) 15,1% (16 trường hợp). Những trường hợp âm tính (không bắt màu trên màng bào tương, hoặc bắt màu trong bào tương) chiếm 38,7% (41 trường hợp). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 64 Biểu hiện Ki-67 Bảng 2: Biểu hiện Ki-67 Tỷ lệ % Dương tính 1(+) 17 Dương tính 2(+) 19 Dương tính 3(+) 64 Tỷ lệ dương tính với Ki-67 trong nghiên cứu này là 100%. Tế bào u dương tính với Ki-67 dao động từ 20-90%, trung bình 61,4% tế bào. Trong đó các tỷ lệ dương tính trên tế bào u được phân loại như sau: - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67 là 17%. - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67 là 19%. - Dương tính 3(+) với hơn 60% tế bào u bắt màu Ki-67 là 64%. Liên quan giữa biểu hiện EGFR với các đặc điểm giải phẫu bệnh và biểu hiện Ki-67 Đặc điểm EGFR (+) EGFR (-) P Nam 59,2% 40,8% Giới Nữ 63,2% 36,8% 0,67 </= 50 63,3% 36,7% Tuổi >50 60,5% 39,5% 0,78 Đại tràng 63,5% 36,5% Vị trí Trực tràng 58,1% 41,9% 0,57 Loét 62% 38% Chồi sùi 62,8% 37,2% Vòng siết 80% 20% Xơ chai 50% 50% Dạng đại thể Phối hợp 0% 100% 0,79 Không chế nhầy 60,9% 39,1% Loại mô học Chế nhầy 64,3% 35,7% 0,8 Biệt hóa rõ 50% 50% Biệt hóa vừa 60,6% 39,4% Độ mô học Biệt hóa kém 66,7% 33,3% 0,47 Tại chỗ 0% 100% Lớp cơ 45% 55% Độ xâm lấn Thanh mạc 72,3% 27,7% 0,03 Mạch máu 70% 30% 0,37 Xâm nhập mạch máu, mạch lymphô Mạch lymphô 74,5% 47,1% 0,04 >40% 78,1 91,7 Biểu hiện Ki-67 <40% 21,9 8,3 0,08 Bảng trên cho thấy biểu hiện EGFR không khác biệt theo tuổi, giới, vị trí u, dạng đại thể, độ mô học và xâm nhập mạch máu và biểu hiện Ki-67. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện EGFR và độ xâm lấn và xâm nhập mạch lymphô. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ EGFR dương tính 61,3%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trên thể giới với tỷ lệ EGFR dương tính khoảng 50-70%(10,14,17). Tỷ lệ biểu hiện EGFR thay đổi tùy thuộc vào loại kháng thể sử dụng, hệ thống phát hiện tín hiệu và tiêu chuẩn đánh giá dương tính trên carcinôm tuyến đại trực tràng(2,5). Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận nữ có tỷ lệ EGFR dương tính 63,2%, trong khi nam có tỷ lệ EGFR dương tính 59,2%. Tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,67). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Antonacopoulou(1), Azria(3), Cheirsilpa(7), Kang(14), Rego(18) và Spano(19). Nhóm nghiên cứu ghi nhận nhóm bệnh nhân dưới 50 tuổi có tỷ lệ EGFR dương tính là 63,3%, trong khi nhóm bệnh nhân trên 50 tuổi có tỷ lệ EGFR dương tính là 60,5%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,78). Kết quả phù hợp với các nghiên cứu khác Antonacopoulou(1), Azria(3), Cheirsilpa(7), Kang(14), Rego(18) và Spano(19). EGFR dương tính ở đại tràng là 63,5%, dương tính ở trực tràng là 58,1%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,57). Kết quả phù hợp với một số nghiên cứu của Antonacopoulou(1), Azria(3), Cheirsilpa(7), Rego(18) và Spano(19). Tỷ lệ EGFR dương tính ở dạng loét, dạng sùi, dạng vòng siết, dạng xơ chai và dạng hỗn hợp lần lượt là 62%, 62,8%, 80%, 50% và 0%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thông kê (p = 0,79). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kang và cộng sự(14). Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm carcinôm tuyến chế nhầy có tỷ lệ EGFR dương tính (64,3%) và tỷ lệ EGFR dương tính ở nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy (60,9%). Liên Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 65 quan không có ý nghĩa thống kê (p = 0,8). Nghiên cứu của Kang(14) và Theodoropoulos(21) cũng ghi nhận không có liên quan giữa biểu hiện EGFR và loại mô học. Carcinôm tuyến biệt hóa rõ có tỷ lệ EGFR dương tính thấp (50%). Nhóm carcinôm tuyến biệt hóa vừa có tỷ lệ EGFR dương tính (60,6%) và nhóm carcinôm tuyến biệt hóa kém (bao gồm carcinôm tuyến không biệt hóa) có tỷ lệ EGFR dương tính cao nhất 66,7%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,47). Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu của Antonacopoulou(1), Azria(3), Kang(14) và Spano(19). Đối với nhóm u còn khu trú trong niêm mạc (tại chỗ) có 1 trường hợp, âm tính với EGFR. Nhóm u xâm nhập tới lớp cơ (tương đương T2 theo TNM), EGFR dương tính là 45%. Nhóm u xâm nhập tới thanh mạc (tương đương T3 theo TNM), EGFR dương tính là 72,3%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,03). Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Cheirsilpa(7), Rego(18), Spano(19) và Theodoropoulos(21). Nghiên cứu của Italiano(12) và Kang(14) ghi nhận không có mối liên quan giữa hai yếu tố này. EGFR dương tính ở nhóm u không xâm nhập mạch máu là 59,3% và nhóm u có xâm nhập mạch máu là 70%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,37). Kết quả phù hợp các nghiên cứu của Kang(14), Spano(19), Theodoropoulos(21). EGFR dương tính ở nhóm u không xâm nhập mạch lymphô là 47,1% và nhóm u có xâm nhập mạch lymphô là 74,5%. Tỷ lệ biểu hiện EGFR ở nhóm u có xâm nhập mạch lymphô cao hơn hẳn nhóm không xâm nhập mạch lymphô. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,04). Nghiên cứu của Hemming và cs(11) trên 62 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng lại ghi nhận tình trạng xâm nhập mạch lymphô thường gặp ở nhóm u âm tính với EGFR. Theo Kang(14) và Theodoropoulos(21) không có mối liên hệ giữa EGFR và hiện tượng xâm nhập mạch lymphô. Tỷ lệ Ki-67 dương tính > 40% ở nhóm u dương tính với EGFR là 78,1% và nhóm u âm tính với EGFR là 91,7%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,08). Kết quả phù hợp các nghiên cứu của Hemming(11), Jong(13). Nghiên cứu của Rego(18) lại cho thấy có mối liên quan giữa biểu hiện EGFR và Ki-67. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu biểu hiện EGFR trên 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng chúng tôi rút ra kết luận sau: - Tỷ lệ dương tính với EGFR 61,3%. Trong đó dương tính 3(+) 21,7%, dương tính 2(+) 24,5%, dương tính 1(+) 15,1%, âm tính 38,7%. - Không có mối liên quan giữa biểu hiện EGFR với tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể, loại mô học, độ mô học, xâm nhập mạch máu. - Liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện EGFR với đặc điểm xâm lấn, xâm nhập mạch lymphô. - Không có mối liên quan giữa biểu hiện EGFR với biểu hiện Ki-67. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Antonacopoulou AG, Tsamandas AC, Petsas T, Liava A, Scopa CD, Papavassiliou AG, Kalofonos HP (2008). “EGFR, HER-2 and COX levels in colorectal cancer”, Histopathology 53:698-706. 2. Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS, Stokel S (2004). “Immunohistochemical Detection of EGFR in Paraffin-embeddedTumor Tissues: Variation in Staining Intensity Due to Choice of Fixative and Storage Time of Tissue Sections”, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 52(7): 893–901, 3. Azria D, Bibeau F, Barbier N, Zouhair A, Lemanski C, Rouanet P, Ychou M, Senesse P, Ozsahin M, Dubois JB, Thezenas S (2005). “Prognostic impact of epidermal growth factor receptor (EGFR) expression on loco - regional recurrence after preoperative radiotherapy in rectal cancer”, BMC Cancer 5:62. 4. Box C, Peak J, Rogers S, Eccles S, “EGFR signaling in invasion angiogenesis and metastasis”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp 257- 276. 5. Buffet W, Geboes KP, Dehertogh G, Geboes K (2008). “EGFR- immunohistochemistry in colorectal cancer and non- small cell lung cancer: comparison of 3 commercially available EGFR- antibodies”, Acta Gastroenterol Belg 71: 213-8. 6. Burgess AW, Garrett TPJ, “EGF receptor family extracellular domain structures and functions”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp3-14. 7. Cheirsilpa A, Ruangvejvorachai P, Karalak A, Sangprakarn S, Pummai S, Sangrajrang S (2007). “Determination of epidermal growth factor receptor (EGFR) in patients with colorectal cancer (institutional series)”, Cancer Therapy, 5:137-142 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 66 8. Cohen T, Prus D, Shia J, Abu-Wasel B, Pinto MG, Freund HR, Stojadinovic A, Grakov A, Peretz T, Nissan A (2008). “Expression of p53, p27 and Ki-67 in colorectal cancer patients of various ethnic origins: clinical and tissue microarray based analysis”, J Surg Oncol, 97: 416-422, Wiley- Liss, Inc. 9. Dako, “The EGFR pharmDx TM Interpretation Manual”, 2007. 10. El-Rayes BF, LoRusso PM (2004). “Targeting the epidermal growth factor receptor”, British Journal of Cancer, 91, 418-424. 11. Hemming AW, Davis NL, Kluftinger A, Robinson B, Quenville NF, Liseman B, LeRiche J (1992). “Prognostic markers of colorectal cancer: An evaluation of DNA content, epidermal growth factor receptor, and Ki-67”, Journal of Surgical Oncology 51: 147-152. 12. Italiano A, Saint-Paul MC, Caroli-Bosc FX, François E, et al. (2005). “Epidermal growth factor receptor (EGFR) status in primary colorectal tumors correlates with EGFR expression in related metastasis sites: Biological and clinical implications”, Annals of Oncology 16: 1503-1507. 13. Jong KPD, Stellema R, Karrenbeld A, Koudstaal J, Annette S et al. (1998). “Clinical relevance of transforming growth factor á, epidermal growth factor receptor, p53, and Ki-67 in colorectal liver metastases and corresponding primary tumors”, Hepatology 28: 971-979. 14. Kang YJ, Jung CK, Choi YJ, Lee KY, Kim HJ, Kang WK (2010). “Clinicopathologic significances of EGFR expression at invasive front of colorectal cancer”, The Korean Journal of Pathology 44: 16- 21. 15. Kubota Y, Petras R, Easley K, et al. (1992). “Ki-67 – determined growth fraction versus standard staging and grading parameters in colorectal carcinoma”, Cancer Vol 70, No.11. 16. Mendelsohn J (2001). “The epidermal frowth factor receptor as a target for cancer therapy”, Endocrine-related Cancer 8:3-9. 17. Normanno N, Bianco C, De Luca A, Strizzi L, Gallo M, Mancino M, Salomon DS “Expression and prognostic significance of the EGFR in solid tumors”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp 221-234. 18. Rego RL, Foster NR, Smyrk TC, Le M, O'Connell MJ, Sargent DJ, Windschitl H, Sinicrope FA (2010). “Prognostic effect of activated EGFR expression in human colon carcinomas: comparison with EGFR status”, Bristish Journal of Cancer, 102, 165-172. 19. Spano JP, Lagorce C, Atlan D, Milano G, Domont J, Benamouzig R, Attar A, Benichou J, Martin A, Morere JF, Raphael M, Penault-Llorca F, Breau JL, Fagard R, Khayat D, Wind P (2005). “Impact of EGFR expression on colorectal cancer patient prognosis and survival”, Annals of Oncology 16: 102-108. 20. Stintzing S, Heinemann V, Jung A, Moosmann N, Hiddemann W, Kirchner T (2009). “The treatment of colorectal carcinoma with monoclonal antibodies”, Deutsches Arzteblatt