Biểu hiện Ki-67 trong Carcinôm tuyến đại – trực tràng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 55 BIỂU HIỆN Ki-67 TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI –TRỰC TRÀNG Phan Đặng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ biểu hiện Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Phương pháp và đối tượng nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu gồm 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009. Kết quả: Tỷ lệ dương tính với Ki-67 là 100%, trong đó dương tính 1(+) 17%, dương tính 2(+) 19%, dương tính 3(+) 64%. Liên quan không có ý nghĩa thống kê với tuổi, giới, vị trí u, độ mô học, xâm nhập mạch máu, mạch limphô. Liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện Ki-67 với loại mô học. Kết luận: Biểu hiện Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng khá cao và có liên quan với loại mô học. Từ khóa: Carcinôm tuyến đại trực tràng, biểu hiện Ki-67. ABSTRACT EXPRESSION OF Ki-67 IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA Phan Dang Anh Thu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 54 - 59 Objective: To determine the expression rate of Ki-67 in colorectal adenocarcinoma. Methods: A cross-sectional study with 106 cases of colorectal adenocarcinoma diagnosed at the department of pathology, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City. The specimens were examined with H&E staining and immunohistochemical staining with monoclonal antibody Ki-67 from October 2008 to April 2009. Results: In our study, the positive expression rate of Ki-67 is totally 100%. In multivariate analysis, no correlation was found between the expression of Ki-67 and some characteristics such as age, gender, tumor site, tumor grade, and vascular or lymphatic invasion. Correlation between the expression of Ki-67 and histological types was statistically significant. Conclusion: The expression rate of Ki-67 is rather high in colorectal adenocarcinoma and significantly correlated with histological types. Key words: Colorectal adenocarcinoma, expression of Ki-67. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng có thể điều trị và tiên lượng tốt nếu được phát hiện sớm. Tiên lượng và đáp ứng điều trị phụ thuộc rất nhiều yếu tố như loại mô học, độ mô học, các đột biến gen (RAS, p53)(8,23) Mức độ tăng sinh tế bào u cũng là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng. Ki-67 là kháng nguyên căn bản để xác định hoạt động của tế bào. Kháng nguyên Ki-67 biểu hiện trong nhân tế bào ở pha G1, S, G2 và M của chu trình tế bào, trừ pha nghỉ Go. Kháng nguyên này được xác định bởi kháng thể đơn dòng cùng tên. Năm 1983, Gerdes và cộng sự đã phát hiện ra một kháng thể ở vị trí đĩa kháng thể 67 có thể đánh giá sự tăng sinh tế bào u và đặt * Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phan Đặng Anh Thư ĐT: 0905.143.418 Email: phandanganhthu@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 56 tên Ki-67 (trong đó Ki đặt theo tên thành phố Kiel, Đức, để kỷ niệm nơi kháng thể được phát hiện)(7). Kể từ ngày đó, Ki-67 đã được áp dụng trong chẩn đoán và tiên lượng nhiều loại ung thư. Nhiều nghiên cứu chứng minh Ki-67 là một yếu tố tiên lượng độc lập liên quan đến sống còn của bệnh. ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -Đối tượng nghiên cứu 106 bệnh nhân được chẩn đoán là carcinôm tuyến đại trực tràng tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh - Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 9/2008 đến tháng 5/2009. - Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Các bước tiến hành - Thu thập số liệu. - Các mẫu ung thư đại trực tràng đều được cố định bằng formol. U được lấy ít nhất hai mẫu. - Ghi nhận đầy đủ các dữ kiện lâm sàng của bệnh nhân từ phiếu trả lời kết quả giải phẫu bệnh gồm: họ tên, tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể (dạng loét, dạng sùi, dạng chít hẹp, dạng xâm nhiễm, dạng phối hợp). - Đọc kết quả trên tiêu bản nhuộm Hematoxyline Eosine: + Loại mô học: carcinôm tuyến không chế nhầy, carcinôm tuyến nhầy, carcinôm tuyến dạng tế bào mặt nhẫn. + Độ mô học: gồm biệt hóa rõ, vừa, kém theo phân loại của AFIP. + Đánh giá mức độ xâm lấn của u. - Khảo sát kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch Ki-67 dưới kính hiển vi quang học cùng với bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm về hóa mô miễn dịch. Kỹ thuật nhuộm Ki-67 bằng hóa mô miễn dịch - Sửa soạn tiêu bản vùi nến + Cắt mỏng mẫu mô 3 – 5μm và đặt vào lam sạch có tráng silan. + Ủ tiêu bản ở nhiệt độ 56oC trong 1 - 2 giờ trước khi nhuộm. - Kháng thể được sử dụng Kháng thể MIB-1 (Ki-67) của DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha loãng 1/25. - Nhuộm hóa mô miễn dịch với Ki-67 + Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 3% 5 phút. + Ủ kháng thể đơn dòng đã pha loãng 30-40 phút. + Ủ kháng thể thứ hai có gắn biotin 30 phút. + Ủ phức hợp streptavidine peroxydase 20 phút. + Ủ dung dịch DAB 5-10 phút. + Nhuộm tương phản với Hematoxyline. - Cách đánh giá Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng Đại trực tràng là mô có hoạt động tế bào mạnh, nhất là các khe tuyến, nơi tăng sản các tế bào dự trữ. Ki-67 sẽ dương tính trên tuyến đại trực tràng bình thường, ở vùng khe tuyến với tỷ lệ khoảng 5-20%(1,17,27). Do đó trong mô u, theo chúng tôi, nếu bắt màu > 20% tế bào là dương tính với Ki-67 và ngược lại là âm tính. Đánh giá biểu hiện Ki-67 dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu và cường độ bắt màu. Sự biểu hiện của Ki-67 được đánh giá tổng thể và xem xét trên các vùng khác nhau (ở độ phóng đại x 200)(8). Tỷ lệ dương tính với Ki-67 trên tế bào u được phân loại như sau(15): - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67. - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67. - Dương tính 3(+) với hơn 60% tế bào u bắt màu Ki-67. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 57 - Xử lý số liệu Số liệu trong các phiếu thu thập được tổng hợp, phân tích và xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5. Xét mối liên quan giữa các biến số bằng phép kiểm 2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Biểu hiện Ki-67 Bảng 1: Biểu hiện Ki-67 Tỷ lệ % Dương tính 1(+) 17 Dương tính 2(+) 19 Dương tính 3(+) 64 Tỷ lệ dương tính với Ki-67 trong nghiên cứu này là 100%. Tế bào u dương tính với Ki-67 dao động từ 20-90%, trung bình 61,4% tế bào. Trong đó các tỷ lệ dương tính trên tế bào u được phân loại như sau: - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67 là 17%. - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67 là 19%. - Dương tính 3(+) với hơn 60% tế bào u bắt màu Ki-67 là 64%. Phần lớn các trường hợp dương tính với Ki- 67 từ vừa đến mạnh (dương tính 2(+) và dương tính 3(+)). Chúng tôi đã khảo sát mối liên quan giữa biểu hiện Ki-67 và các đặc điểm giải phẫu bệnh ghi nhận liên quan có ý nghĩa thống kê với mức độ dương tính từ vừa đến mạnh (Ki-67 dương tính > 40%). Liên quan giữa biểu hiện Ki-67 với các đặc điểm giải phẫu bệnh Đặc điểm Ki-67 < 40% (%) Ki-67 > 40% (%) P Nam 15,2 84,8 Giới Nữ 18,5 81,5 0,66 </= 50 25,9 74,1 Tuổi >50 13,7 86,3 0,14 Đặc điểm Ki-67 < 40% (%) Ki-67 > 40% (%) P Đại tràng 18 82 Vị trí Trực tràng 15,4 84,6 0,73 Không chế nhầy 14 86 Loại mô học Chế nhầy 35,7 64,3 0,04 Biệt hóa rõ 22,2 77,8 Biệt hóa vừa 14,5 85,5 Độ mô học Biệt hóa kém 20,7 79,3 0,53 Mạch máu 16,7 83,3 0,96 Xâm nhập mạch máu, mạch lymphô Mạch lymphô 23,1 86,8 0,92 Bảng trên cho thấy biểu hiện Ki-67 không khác biệt theo tuổi, giới, vị trí u, độ mô học và xâm nhập mạch máu, mạch lymphô. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện Ki-67 và loại mô học. BÀN LUẬN Bình thường tế bào vùng đáy tuyến đại trực tràng có thể dương tính với Ki-67 từ 5-20%, đây là vùng tế bào dự trữ có hoạt động phân bào mạnh(1,17,27). Do đó chúng tôi đánh giá Ki-67 dương tính khi > 20% tế bào u bắt màu. Nghiên cứu của Su(25) và Visca(27) cũng đánh giá dương tính khi > 20% tế bào u bắt màu. Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ Ki-67 dương tính 100%, trong đó tỷ lệ tế bào u dương tính Ki-67 dao động từ 20%-90%. Khi so sánh với các tác giả khác, tỷ lệ dương tính với Ki-67 trong nghiên cứu của chúng tôi tương đối cao. Bảng 1: So sánh tỷ lệ biểu hiện Ki-67 với các nghiên cứu khác Tác giả Biểu hiện Ki-67 (%) Trịnh Tuấn Dũng(26) 80% Cohen và cs(8) 77,4% Hilska và cs(9) 91% Johnston và cs(13) 66,3% Nghiên cứu này 100% Phần lớn các nghiên cứu đều ghi nhận tỷ lệ dương tính với Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng rất cao (> 60%). Mỗi nghiên cứu có cách đánh giá dương tính với Ki-67 khác nhau và mang tính chủ quan cao. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 58 Hình 1. Biểu hiện Ki-67 trên caricnôm tuyến đại trực tràng A: Ki-67 dương tính 20% (MS-GPB: Y 30331/08); B: Ki-67 dương tính 40% (MS-GPB: Y 30310/08); C: Ki-67 dương tính 60% (MS-GPB: Y 30311/08); D: Ki-67 dương tính 70% (MS-GPB: Y 918/09); E: Ki-67 dương tính 80% (MS-GPB: Y 30643/08); F: Ki-67 dương tính 90% (MS-GPB: Y 2545/09) (Nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể MIB-1 (Dakocytomation)) (Độ phóng đại x 200) Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận phần lớn các tế bào u dương tính > 40% (83%), tỷ lệ tế bào u dương tính trong khoảng 20-90%, trung bình 61,4%. Kết quả này giống nghiên cứu của Johnston(13), nhưng một số nghiên cứu lại ghi nhận tỷ lệ biểu hiện trung bình không cao (Bảng 2). Bảng 2: So sánh tỷ lệ tế bào u dương tính Ki-67 với các nghiên cứu khác Tỷ lệ tế bào u dương tính với Ki-67 Tác giả Khoảng (%) Trung bình (%) Ihmann và cs(10) 10- 66,4 32,8 Johnston và cs(13) 20,2- 87,5 66,3 Kubota và cs(15) 1-99 34,6 Porschen và cs(22) 6,6 – 75,3 37,6 Nghiên cứu này 20-90 61,4 A B C D E F Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 59 Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ tế bào u dương tính với Ki-67 dao động từ 20%- 90%, phù hợp với các tác giả khác (Bảng 2). Trong đó tỷ lệ tế bào u dương tính với Ki-67 từ 40% trở lên trên khá cao (83%). Nghiên cứu của Jakob(12) và Salminen(24) cũng cho rằng tế bào u dương tính mạnh với Ki-67 khi trên 40% tế bào bắt màu. Theo tác giả Trịnh Tuấn Dũng(26), tỷ lệ Ki-67 dương tính mạnh khi >60% tế bào u bắt màu. Ki-67 còn là yếu tố tiên lượng đến khả năng sống còn của bệnh nhân. Các nghiên cứu của Chen(2), Garrity(5), Hilska(9), Kimura(16) và Palmqvist(20) trên ung thư đại trực tràng nguyên phát ghi nhận tỷ lệ dương tính với Ki-67 liên quan đến tiên lượng sống 5 năm. Ngoài ra nghiên cứu của Petrowski(21) trên ung thư đại tràng tiến triển có di căn gan cũng ghi nhận biểu hiện Ki-67 liên quan đến tiên lượng sống của bệnh nhân. Nhóm bệnh nhân dưới 50 tuổi có tỷ lệ Ki-67 dương tính trên 40% tế bào u là 86,3 % và nhóm bệnh nhân trên 50 tuổi có tỷ lệ Ki-67 dương tính trên 40% là 74,1%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p=0,14). Phù hợp với các nghiên cứu của Duchrow(4), Kubota(15), Porschen(22) và Salminen(24). Tỷ lệ dương tính Ki-67 ở nam và nữ gần giống nhau. Tỷ lệ dương tính trên 40% tế bào u ở giới nam và giới nữ không quá chênh lệch. Sự khác biệt giữa tỷ lệ dương tính với Ki-67 và giới tính không có ý nghĩa thống kê (p = 0,66). Nghiên cứu của các tác giả Duchrow(4), Kubota(15), Porschen(22) và Salminen(24) cũng ghi nhận không có mối liên quan giữa Ki-67 và giới tính. Tỷ lệ dương tính Ki-67 ở đại tràng và trực tràng gần giống nhau. Tỷ lệ trường hợp dương tính trên 40% tế bào u ở đại tràng và trực tràng không quá chênh lệch và liên quan giữa biểu hiện Ki-67 và vị trí u không có ý nghĩa thống kê (p = 0,73). Kết quả phù hợp với các nghiên cứu của Cohen(8), Ihmann(10), Jong(13), Kubota(15) và Porschen(22). Đối với nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy, tỷ lệ Ki-67 dương tính > 40% cao hơn so với nhóm carcinôm tuyến chế nhầy (86% so với 64,3%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,04). Trong khi đó, tác giả Nabi(19) và Georgescu(6) cho rằng tỷ lệ Ki-67 dương tính vượt trội ở nhóm carcinôm tuyến chế nhầy so với nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy. Kết quả ghi nhận tỷ lệ Ki-67 dương tính mạnh ở nhóm biệt hóa vừa và biệt hóa kém (85,5% và 79,3% so với 77,8%) cao hơn ở nhóm biệt hóa rõ. Ki-67 dương tính vừa và dương tính yếu ở nhóm biệt hóa rõ với tỷ lệ cao hơn nhóm biệt hóa vừa và biệt hóa kém. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,53). Theo Trịnh Tuấn Dũng(26), tỷ lệ Ki-67 dương tính mạnh ở nhóm biệt hóa kém cao hơn hẳn nhóm biệt hóa rõ, nhưng cũng ghi nhận không có mối liên quan giữa Ki-67 và mức độ biệt hóa. Các nghiên cứu của Duchrow(4), Ihmann(10), Jong(13), Kubota(15), Porschen(22) và Salminen(24) ghi nhận không có mối liên quan giữa Ki-67 và độ mô học của u. Ki-67 dương tính > 40% ở nhóm u không xâm nhập mạch máu 82,9% và nhóm u có xâm nhập mạch máu 83,3%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,96). Kết quả phù hợp với các nghiên cứu của Cohen(8) và Ishida(11). Tuy nhiên tác giả Kawazoe(15) cho rằng tỷ lệ Ki-67 cao hơn nhiều ở nhóm có xâm nhập mạch máu so với nhóm không có xâm nhập. Ki-67 dương tính > 40% ở nhóm u không xâm nhập mạch lymphô 89,6% và nhóm u có xâm nhập mạch lymphô 86,8%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,92). Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Ishida(11). Theo tác giả Kawazoe(15), có sự liên quan giữa Ki-67 và sự xâm nhập mạch lymphô. Tác giả trên cho rằng tỷ lệ Ki-67 cao hơn nhiều ở nhóm có xâm nhập mạch lymphô so với nhóm không xâm nhập mạch lymphô. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Backus HHJ, Groeningen CJV, et al., “Differential expression of cell cycle and apoptosis related proteins in colorectal mucosa, primary colon tumours, and liver metastases”, J Clin Pathol 2002, 55: 206-211. 2. Chen YT, Henk MJ, Carney KJ, et al., “Prognostic significance of tumor markers in colorectal cancer patients: DNA index, S-phase fraction, p53 expression, and Ki-67 index”, J Gastrointest Surg 1997, 1:266-73. 3. Cohen T, Prus D, Shia J, Abu-Wasel B, Pinto MG, Freund HR, Stojadinovic A, Grakov A, Peretz T, Nissan A, “Expression of p53, p27 and Ki-67 in colorectal cancer patients of various ethnic origins: clinical and tissue microarray based analysis”, J Surg Oncol 2008, 97: 416-422, Wiley- Liss, Inc. 4. Duchrow M, Ziemann T, Windhovel U, Bruch HP, Broll R, “Colorectal carcinomas with high MIB-1 labelling indices but low pKi-67 mRNA levels correlate with better prognosis outcome”, Histopathology 2003, 42: 566-574. 5. Garrity MM, Burgart LJ, Mahoney MR, Windschitl HE, et al., “Prognostic value of proliferation, apoptosis, defective DNA mismatch repair, and p53 overexpression in patients with resected Dukes’ B2, or C colon cancer: a North Central Cancer Treatment Group Study”, J Clin Oncol 2004, 22:1572-82. 6. Georgescu CV, Georgescu CC, Ciurea R, Ciurea T, “Correlations of proliferation markers, p53 expression and histological findings in colorectal carcinoma”, J Gastrointestin Liver Dis 2007, 16: 133- 139. 7. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H, “Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation”, Int J Cancer 1983, 31: 13-20. 8. Hamilton SR, “Pathology and genetics of tumours of the Digestive system”, World Health Organisation Classification of Tumours, 2000. 9. Hilska M, Collan YU, O'Laine VJ, et al. “The significance of tumor markers for proliferation and apoptosis in predicting survival in colorectal cancer”, Diseases of the Colon & Rectum 2005, 48: 2197-2208. 10. Ihmann T, Liu J, Schwabe W, Hausler P, Behnke D, Bruch HP, Broll R, Windhovel U, Duchrow M, “High-level mRNA quantification of proliferation marker pKi-67 is correlated with favorable prognosis in colorectal carcinoma”, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 2004, 30: 749-756. 11. Ishida H, Miwa H, Tatsuta M, et al., “Ki-67 and CEA expression as prognostic markers in Dukes’ C colorectal cancer”, Cancer Letters 2004, 207, 209-225. 12. Jakob C, Liersch T, Meyer W, Becker H, Baretton GB, Aust DE, “Predictive value of Ki-67 and p53 in locally advanced rectal cancer: correlation with thymidylate synthase and histopathological tumor regression after neoadjuvant 5-FU- based chemoradiotherapy”, World J Gastroenterol 2008, 14: 1060- 1066. 13. Johnston PG, Dervan PA, Carney DN, “Immunohistochemical analysis of cell kinetic parameters in colonic adenocarcinomas, adenomas and normal mucosa”, Human Pathology 1989, 20: 696- 700 14. Jong KPD, Stellema R, Karrenbeld A, Koudstaal J, Annette S et al., “Clinical relevance of transforming growth factor, epidermal growth factor receptor, p53, and Ki-67 in colorectal liver metastases and corresponding primary tumors”, Hepatology 1998, 28: 971-979. 15. Kawazoe N, “Assessment of malignant potential and prognostic correlation in colorectal carcinomas using monoclonal antibody Ki-67”, Acta Med. Nagasaki 38: 9-14. 16. Kimura T, Tanaka S, Haruma K, Sumii K, Kajiyama G, Shimamoto F, Kohno N, “Clinical significance of MUC1 and E- cadherin expression, cellular proliferation, and angiogenesis at the deepest invasive portion of colorectal cancer”, Int J Oncol 2000, 16:55-64. 17. Kristt Don, Winston GJ, et al., “Patterns of proliferative changes in crypts bordering colonic tumors: Zonal histology and cell cycle marker expression”, Pathology Oncology Research, Vol 5, No 4, 1999. 18. Kubota Y, Petras R, Easley K, et al., “Ki-67 – determined growth fraction versus standard staging and grading parameters in colorectal carcinoma”, Cancer, 1992, Vol 70, No.11. 19. Nabi U, Nagi AH, Sami W, “Ki-67 proliferating insex and histological grade type and stage of colorectal carcinoma”, J Ayub Med Coll Abbottabad 2008, 20 (4). 20. Palmqvist R, Sellberg P, Oberg A, et al., “Low tumor proliferation at the invasive margin is associated with poor prognosis in Dukes’ stage B colorectal cancers”, Br J Cancer 1999, 79:577-81. 21. Petrowsky H, Sturm I, Graubitz O, Kooby DA, Staib-Sebler E, Gog C, Kưhne CH, Hillebrand T, Daniel PT, Fong Y, Lorenz M, “Relevance of Ki-67 antigen expression and K-ras mutation in colorectal liver metastases”, Eur. J. Surg.Oncol., 27 (2001): 80–87. 22. Porschen R, Kriegel A, Langen C, Classen S, Hilse M, Lohe B, Hengels KJ, Borchard F, “Assessment of proliferative activity in carcinomas of the human alimentary tract by Ki-67 immunostaining”, Int. J. Cancer (1991): 47, 686-691. 23. Preiser CMF, “Gastrointestinal pathology: An atlas and text”, Lippincott Williams & Wilkins, 3rd edition, 2008. 24. Salminen E, Palmu S, Vahlberg T, et al., “Increased proliferation activity measured by immunoreactive Ki-67 is associated with survival improvement in rectal/recto sigmoid cancer”, World J Gastroenterol 2005, 11:3245-3249. 25. Su Y, Shrubsole MJ, Ness RM, Cai Q, Kataoka N, Washington K, Zheng W, “Immunohistochemical expression of Li-67. Cyclin D1, -catenin, cyclooxytgenase-2, and epidermal growth factor receptor in human colorectal adenoma: A validation study of Tissue microarrays”, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006, 15 (9):1719-1726. 26. Trịnh Tuấn Dũng (2007), “Nghiên cứu sự biểu hiện của các kháng nguyên p53, Ki-67 và HER-2 trong ung thư đại trực tràng bằng hóa mô miễn dịch”, Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 11, phụ bản số 3, chuyên đề giải phẫu bệnh-tế