Bước đầu khảo sát Chimerism trên bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu bằng kỹ thuật Multiplex PCR STR

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  170 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT CHIMERISM TRÊN BỆNH NHÂN DỊ GHÉP  TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR STR  Cao Sỹ Luân*, Phan Thị Xinh*,**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) dị ghép tế bào  gốc tạo máu (TBGTM).  Đối  tượng  và  phương  pháp:  20 mẫu  tủy  xương  hoặc máu  ngoại  vi  của BN BCCDT  và  người  cho  TBGTM. Thực hiện phản ứng multiplex PCR Short Tandem Reapeat (STR) để xác định các dấu ấn STR có giá  trị theo dõi điều trị sau ghép và tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT dị ghép TBGTM.  Kết quả: Trong 18 STRs, chúng tôi đã xác định được 4 dấu ấn STR có giá trị theo dõi điều trị sau ghép trên  cặp người cho‐người nhận là CMR‐04 và 5 dấu ấn STR đối với các cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối  với cặp CMR‐03. Đồng thời, xác định được tỷ lệ chimerism của các BN sau ghép tại nhiều thời điểm khác nhau.  Ngoài ra, kết quả chimerism tương đồng với kết quả xác định giới tính bằng kỹ thuật FISH trong trường hợp  người cho‐người nhận khác giới tính.  Kết  luận: Xây dựng thành công quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR, giúp  theo dõi việc mọc mảnh ghép trên BN dị ghép TBGTM tại Bệnh viện truyền máu huyết học.  Từ  khóa: bạch cầu cấp dòng  tủy  (BCCDT),  short  tandem  repeat  (STR),  chimerism,  tế bào gốc  tạo máu  (TBGTM).  ABSTRACT  DETECTION OF CHIMERISM IN ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL  TRANSPLANTATION USING MULTIPLEX STR‐PCR  Cao Sy Luan, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 169 ‐ 174  Purpose: To detect chimerism in acute myeloid leukemia (AML) patients after allogeneic hematopoietic  stem cell transplantation (HSCT).  Material and Methods: Twenty bone marrow or peripheral blood samples of AML patients and donors  were collected. Using a commercial multiplex PCR amplification of fluorescent labeled short tandem repeat  (STR) markers to detect informative STRs and analyze chimerism after allogeneic HSTC.  Result: Among 18 STRs, we found 4 informative STRs in CMR‐04, 5 informative STRs  in CMR‐01  and CMR‐02, 6 informative STRs in CMR‐03. Simultaneously, patient/donor cell chimerism was detected  at  several  times  during  the  post‐transplant  period. Moreover,  the  result  of  chimerrism  analysis  by STR‐ PCR‐based is similar to result of FISH‐based in cases sex‐mismatched transplantation.  Conclusion: We successfully established the procedure of chimerism analysis by using multiplex STR‐ PCR  to  help  monitoring  engraftment  in  patient  after  allogeneic  HSTC  in  Blood  Transfusion  and  Hematology hospital.   Key words: acute myeloid leukemia (AML), short tandem repeat (STR), chimerism, hematopoietic stem  cell transplantation (HSCT).  * Bệnh viện Truyền máu‐Huyết học TP.HCM  ** Đại học Y Dược TP.HCM.  Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh  ĐT: 0932728115   Email: phanthixinh@yahoo.com  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  170 ĐẶT VẤN ĐỀ  Trong điều trị các bệnh lý ác tính về máu thì  dị  ghép  tế  bào  gốc  tạo máu  (TBGTM)  là một  trong những phương pháp hiệu quả và ưu tiên  được lựa chọn cho bệnh nhân (BN), đặc biệt đối  với  BN  thuộc  nhóm  tiên  lượng  trung  bình  và  xấu hoặc BN  tái phát  sau  điều  trị hóa  trị  liệu.  Việc xác định tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ  thể người nhận hay còn gọi là chimerism để qua  đó đánh giá việc mọc mảnh ghép là thành công  hay thất bại  là một trong những bước cần  thiết  của  dị  ghép  tủy.  Để  đánh  giá  việc mọc mảnh  ghép thì có thể dựa trên cơ sở là sự khác nhau về  giới tính, nhóm máu, HLA hay các dấu ấn phân  tử như Short Tandem Reapeat  (STR) và  Single  Nucleotide Polymorphism (SNP). Hiện nay, có 3  kỹ  thuật  di  truyền  học  phân  tử  để  xác  định  chimerism là kỹ thuật FISH (yêu cầu phải có sự  khác biệt về giới  tính giữa người cho và người  nhận), PCR khuếch  đại  các  đoạn  STR và  SNP.  Trong  đó,  kỹ  thuật  PCR  khuếch  đại  các  đoạn  STR để xác định tỷ  lệ chimerism được sử dụng  ngày càng phổ biến với ưu điểm là độ nhạy cao,  khả năng ứng dụng rộng và chỉ cần một  lượng  mẫu nhỏ để phân tích(8).   STR  là  những  trình  tự  ngắn  DNA  trên  nhiễm sắc thể với chiều dài thường từ 2‐6 bp và  có  tính  lặp  lại.  Có  nhiều  loại  STR  khác  nhau:  dinucleotide,  trinucleotide,  tetranucleotide,  pentanucleotide  và  hexanucleotide.  Có  hơn  20.000  tetranucleotide  STR  được  xác  định  ở  người(2).  STR  chiếm  khoảng  3%  trong  tổng  bộ  gen người(5). Có nhiều kiểu sắp xếp các STR với  nhau, hoặc  là  lặp  lại nhiều  STR  của  cùng một  kiểu  hoặc  là  lặp  lại  của  nhiều  kiểu  STR  khác  nhau. Sự khác nhau về kích  thước của các STR  trên mỗi cá nhân khác nhau là do khác nhau về  số  đơn vị  lặp  lại. Do  đó,  các  STR  có  thể  được  xem như là dấu ấn để phân biệt giữa các cá thể  với nhau. Vì vậy, với những ưu điểm là tính đa  hình  cao,  kích  thước  nhỏ  nên  các  STR  thường  được  sử dụng  để xác  định  chimerism bằng kỹ  thuật  PCR(6).  Có  nhiều  nhóm  nghiên  cứu  sử  dụng multiplex PCR khuếch đại các STR có gắn  huỳnh quang để xác định nhanh các STR mang  thông tin, tức là các STR có sự khác nhau về kích  thước  giữa  người  cho  và  người  nhận(9).  Hiện  nay,  PCR  khuếch  đại  các  STR  có  gắn  huỳnh  quang được xem như là tiêu chuẩn vàng để xác  định  chimerism  sau ghép và kết quả  đánh giá  việc mọc mảnh ghép rất khả quan(1).  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  20 mẫu  tủy  xương  hoặc máu  ngoại  vi  của  BN bạch  cầu  cấp dòng  tủy  (BCCDT) và người  cho TBGTM tương ứng được thu thập tại Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  học  (BVTMHH)  TP.  HCM  từ  tháng 5/2013 đến  tháng 7/2013. Trong  đó,  có  4 mẫu máu  ngoại  vi  của  4 BN BCCDT  trước  ghép  và  4  mẫu  máu  của  4  người  cho  TBGTM  tương  ứng,  12  mẫu  tủy  xương  hoặc  máu ngoại vi  của người bệnh  sau ghép  tại  các  thời  điểm  khác  nhau. Các  cặp  ghép  này  được  đặt  tên  mã  nghiên  cứu  là  CMR‐01,  CMR‐02,  CMR‐03 và CMR‐04.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới.  Phương pháp tiến hành  Ly  trích DNA  từ mẫu  tủy xương hoặc máu  ngoại vi bằng GenElute blood genomic DNA kit  (Sigma, Mỹ). Sản phẩm DNA sau  ly  trích được  kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo  quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm.  Thực hiện phản  ứng multiplex PCR với  18  cặp mồi (bảng 1) bằng PowerPlex 18D system kit  (Promega,  Mỹ).  Lượng  DNA  dùng  cho  phản  ứng multiplex PCR là 10ng và chương trình luân  nhiệt gồm 96oC trong 2 phút, 26 chu kỳ của 94oC  trong 10 giây và 60oC trong 1 phút, hoàn thành ở  60oC  trong  20  phút  trên máy  GeneAmp  PCR  System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ).  Bảng 1: Danh sách 18 kiểu dấu ấn STR của kit  PowerPlex 18D system  Loại STR Màu huỳnh quang Kích thước sản phẩm PCR Số kiểu đơn vị lặp lại Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  171 Loại STR Màu huỳnh quang Kích thước sản phẩm PCR Số kiểu đơn vị lặp lại Penta E FL 379-474 5-24. D18S51 FL 286-366 7-10, 10.2, 11-13, 13.2, 14-27 D21S11 FL 203-259 24, 24.2, 25, 25.2, 26- 28, 28.2, 29, 29.2,30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36-38 TH01 FL 152-195 3-9, 9.3, 10-11,13.3 D3S1358 FL 103-147 9-20 FGA TMR-ET 314-460 14-18, 18.2, 19, 19.2, 20, 20.2, 21, 21.2, 22, 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2, 25, 25.2, 26-30, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 48.2, 50.2 TPOX TMR-ET 265-293 6-13 D8S1179 TMR-ET 203-251 7-19 vWA TMR-ET 127-183 10-24 Amelogeni n TMR-ET 109, 115 X, Y Penta D JOE 376-449 2.2, 3.2, 5-17 CSF1PO JOE 321-357 6-15 D16S539 JOE 264-304 5, 8-15 D7S820 JOE 218-250 6-14 D13S317 JOE 176-208 7-15 D5S818 JOE 122-158 7-16 D2S1138 CXR-ET 223-295 10, 12, 14-28 D19S443 CXR-ET 163-215 5.2, 6.2, 8-12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2 Hỗn hợp dung dịch điện di gồm 10μl Hi‐Di,  1μl ILS500 và 1μl sản phẩm PCR được biến tính  ở 960C  trong 3 phút và sốc nhiệt  ở 00C  trong 3  phút trước khi tiến hành điện di mao quản bằng  máy  ABI  3130  Genetic  Analyzer,  với  POP‐4  polymer  và  capillary  36  cm  (Applied  Biosystems).  Kết  quả  điện  di  được  phân  tích  bằng phần mềm GeneMapper.  Kết  quả  điện  di mẫu DNA  của  người  cho  TBGTM và BN trước ghép sẽ được phân tích để  chọn ra các kiểu dấu ấn STR mang thông tin, có  giá trị theo dõi điều trị sau ghép, còn đối với kết  quả điện di mẫu DNA của BN sau ghép  thì sử  dụng diện  tích vùng  đỉnh  của  các dấu  ấn STR  này để xác định  tỷ  lệ chimerism. Mỗi một dấu  ấn STR mang thông tin sẽ được sử dụng để tính  một tỷ lệ chimerism tương ứng. Tỷ lệ chimerism  của BN sau ghép  là  trung bình  tỷ  lệ chimerism  từng dấu ấn STR.  Các dấu ấn STR được sử dụng để phân tích  chimerism phải thỏa mãn các tiêu chuẩn là phải  có  ít  nhất một  allele  khác  nhau  về  kích  thước  giữa  người  cho  và  người  nhận,  khoảng  cách  giữa 2 allel tối thiểu  là hai đơn vị  lặp  lại. Đồng  thời, chiều cao các đỉnh của các STR khi điện di  phải  >50  RFU  và  không  vượt  quá  thang  đo  RFU(7).  Tỷ  lệ  chimerism  được  tính  theo  công  thức  sau:  Trong đó: ‐ ∑D: tổng diện tích vùng đỉnh của  các dấu ấn STR mang thông tin ở người cho   ‐ ∑R: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu  ấn STR mang thông tin ở người nhận   KẾT QUẢ  Với lượng mẫu DNA sử dụng cho phản ứng  multiplex PCR là 10ng cho kết quả  là chiều cao  các  đỉnh  của  người  cho  và  người  nhận  trước  ghép  cũng như  của người nhận  sau  ghép  đều  trong  tiêu  chuẩn  cho  phép,  thỏa  điều  kiện  là  chiều cao tối thiểu >50 RFU và không vượt quá  thang  đo RFU. Đối với mẫu  trước ghép  chúng  tôi xác định được 4 dấu ấn STR mang thông tin  trên  cặp  người  cho‐người  nhận  có  mã  số  là  CMR‐04, 5 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐01 và  CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03.  Đối với mẫu  sau ghép,  chúng  tôi  xác  định  được tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT sau ghép  ở những thời điểm khác nhau (bảng 2). Trong 4  cặp  người  cho‐người  nhận  thì  cặp CMR‐02  và  CMR‐04  là  dị  ghép  TBGTM  nửa  thuận  hợp  HLA,  còn  cặp CMR‐03  và CMR‐01  là  dị  ghép  TBGTM thuận hợp HLA hoàn toàn.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  172 Bảng 2: Kết quả chimerism của BN BCCDT sau  ghép TBGTM  Mã BN Ngày sau ghép CMR-02 (%) CMR-04 (%) CMR-03 (%) CMR-01 (%) Ngày 7 58,45 60,43 Ngày 14 95,50 100,00 Ngày 21 100,00 98,10 99,59 Ngày 28 98,09 100,00 Ngày 35 100,00 100,00 100,00 Đối với BN CMR‐02  sau ghép 7 ngày, dựa  trên diện tích vùng đỉnh của 5 kiểu dấu ấn STR  mang  thông  tin  chúng  tôi  tính  được  tỷ  lệ  chimerism  của  từng  kiểu dấu  ấn  STR  và  tỷ  lệ  chimerism trung bình là 58,45% (bảng 3).  Bảng 3: Kết quả chimerism của BN CMR‐02 sau  ghép 7 ngày  Hệ thống STR Allele (D) Allele (R) Diện tích peak CMR (%) Penta E 5 3609 51.40 11 3080 Hệ thống STR Allele (D) Allele (R) Diện tích peak CMR (%) 12 3792 16 3283 CSF1PO 10 8777 61.4711 11 14060 12 5501 D8S1179 12 2264 55.49 14 1816 15 15 3575 TPOX 8 8 12094 59.019 6430 11 4467 FGA 18 4848 64.8622 22 6901 23 2626 Tỷ lệ CMR trung bình (%): 58.45 Da1 Da1 Ra1 Ra1 Ra1 Da1 Ra1 Da1 Người cho Người nhận Người nhận sau ghép D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E   Hình 1: Kết quả diện di một số dấu ấn STR của người cho, người nhận trước và sau ghép ngày 7 trên BN  CMR‐02  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  172 Trong hình 1 là kết quả của 5 trên 18 dấu ấn  STR  của  người  cho,  người  nhận  trước  và  sau  ghép ngày 7  trên BN CMR‐02. Chúng  ta có  thể  thấy  trong  5  dấu  ấn  STR  (D3S1358,  TH01,  D21S11, D18S51 và Penta E) thì chỉ có Penta E là  dấu ấn mang thông tin và đủ  tiêu chuẩn để sử  dụng  cho mục  đích  phân  tích  chimerism.  Kết  quả cũng cho thấy ở người bệnh sau ghép ngày  7  thì vừa xuất hiện những  đỉnh  đặc  trưng  của  người cho và người nhận.  BÀN LUẬN  Lượng  DNA  sử  dụng  cho  phản  ứng  multiplex PCR là 10 ng, với kết quả chiều cao các  đỉnh thu được của người cho, người nhận trước  và  sau  ghép  đều  đạt  tiêu  chuẩn. Kết  quả  này  chứng tỏ 10 ng là lượng DNA phù hợp để thực  hiện phản ứng multiplex PCR STR cho mục đích  xác  định  tỷ  lệ  chimerism  trên  BN  dị  ghép  TBGTM.  Kết quả chimerism trong bảng 2 cho thấy tỷ  lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận  tăng dần  theo  thời gian  đối với  trường hợp dị  ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA. Chẳng hạn,  đối  với  CMR‐02  sau  ghép  7  ngày  thì  tỷ  lệ  chimerism là 58,45%, tới ngày 14 thì tỷ lệ này là  95,5% và  đến ngày 21  thì  đạt 100%. Trong khi  đó,  đối với  trường hợp dị ghép TBGTM  thuận  hợp HLA hoàn toàn thì tỷ lệ này là gần 100% ở  các thời điểm khác nhau sau ghép. Theo nghiên  cứu của Dodero A và cộng sự thì tỷ lệ chimerism  trong máu ngoại vi sau ghép 30 ngày  trên hầu  hết BN  (92%)  đạt >95%(3). Tương  tự,  trong một  nghiên cứu khác của Doney KC và cộng sự khi  đánh  giá  chimerism  tại  ngày  28  sau  ghép  thì  45/47 BN có tỷ lệ chimerism trong tủy là > 90%(4).  Do đó, Từ các kết quả chimerism sau ghép trên 4  BN có thể đưa ra nhận định  là bước đầu mảnh  ghép đã mọc tốt trong cơ thể BN sau ghép.  Đồng thời, kết quả chimerism dựa trên PCR  các dấu ấn STR và FISH trong bảng 4 cũng cho  thấy có sự tương đồng về tỷ lệ tế bào của người  cho trong cơ thể người nhận sau ghép giữa hai  kỹ thuật. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, đối với ca  CMR‐02  sau ghép ngày  14  thì  tỷ  lệ  chimerism  được xác định bởi kỹ thuật multiplex PCR STR  là  95,5%  tương  ứng  với  kết  quả  FISH  cũng  là  95,5% hay sau ghép ngày 21 thì cả hai kỹ thuật  cũng đều cho kết quả là 100%. Tương tự, kết quả  chimerism  đối  với  ca  CMR‐04  được  xác  định  bằng kỹ  thuật multiplex PCR STR và FISH sau  ghép ngày 14  lần  lượt  là 100% và 98% hay sau  ghép ngày 21 là 98,1% và 97,5%. Điều này chứng  tỏ việc xác định  tỷ  lệ chimerism bằng kỹ  thuật  PCR STR  là một kỹ  thuật đáng  tin cậy để  theo  dõi tiến triển của việc mọc mảnh ghép trên BN  BCCDT sau dị ghép TBGTM. Ngoài ra,  trong 4  cặp BN di ghép TBGTM  thì chỉ có 2 cặp có  thể  sử  dụng  kỹ  thuật  FISH  để  đánh  giá  việc mọc  mảnh  ghép,  là  2  cặp mà  người  cho  và  người  nhận có sự khác biệt về giới tính. Trong khi đó,  kỹ thuật multiplex PCR STR thì có thể đánh giá  được trên cả 4 cặp BN mà cần không quan tâm  người cho và người nhận có cùng giới tính hay  không. Điều này cho  thấy khả năng ứng dụng  rộng của dấu ấn STR và một lần nữa khẳng định  giá  trị  của  kỹ  thuật multiplex  PCR  STR  trong  việc xác định chimerism.  Bảng 4: Kết quả chimerism và FISH của BN BCCDT  sau ghép TBGTM  Mã BN Ngày sau ghép CMR-02 CMR-04 CMR(%) FISH(%) CMR(%) FISH(%) Ngày 7 58,45 60,43 Ngày 14 95,50 95,50 100,00 98,00 Ngày 21 100,00 100,00 98,10 97,50 Ngày 28 98,09 Ngày 35 100,00 100,00 100,00 KẾT LUẬN  Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình  xác  định  chimerism  bằng  kỹ  thuật  multiplex  PCR STR. Kết quả nghiên cứu giúp xác định tỷ  lệ  chimerism  trên  BN  sau  ghép. Qua  đó,  góp  phần  hỗ  trợ  đánh  giá  tiến  triển  của  việc mọc  mảnh  ghép  cũng như dự  đoán  sự  thành  công  hay khả năng thải ghép trên BN BCCDT dị ghép  TBGTM được hiệu quả hơn.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  173 TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bader P, Niethammer D, Willasch A,  et al  (2005). How and  when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell  transplantation. Bone Marrow Transplantation; 35, 107–119.  2. Collins JR, Stephens RM, Gold B, et al  (2003). An exhaustive  DNA micro‐satellite map of  the human genome using high  performance computing. Genomics; 82, 10‐19.  3. Dodero A, Carniti C, Raganato A, et al (2009). Haploidentical  stem  cell  transplantation  after  a  reduced‐intensity  conditioning  regimen  for  the  treatment  of  advanced  hematologic malignancies: posttransplantation CD8‐depleted  donor  lymphocyte  infusions  contribute  to  improve  T‐cell  recovery. Blood ; 113, 4771‐4779.  4. Doney KC, Loken MR, Bryant EM, et al (2008). Lack of utility  of  chimerism  studies  obtained  two  to  three  months  after  myeloablative  haematopoietic  cell  transplantation  for  acute  lymphocytic  leukaemia.  Bone Marrow  Transplant; 42,  271– 274.  5. Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and  analysis of the human genome. Nature 2001; 409, 860‐921.  6. Lawler M, Humphries P, McCann  SR  (2009). Evaluation of  mixed  chimerism  by  in  vitro  amplification  of  dinucleotide  repeat sequences using the polymerase chain reaction. Blood;  77,2504–2514.  7. Lion  T,  Watzinger  F,  Preuner  S,  et  al  (2012).  The  EuroChimerism  concept  for  a  standardized  approach  to  chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation.  Leukemia; 26, 1821 – 1828.  8. Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G  (2004). Evaluation  of  STR  informativity  for  chimerism  testing  ‐  comparative  analysis  of  27  STR  systems  in  203 matched  related  donor  recipient pairs. Leukemia; 18, 248–254.  9. Thiede  C,  Florek  M,  Bornhauser  M,  et  al  (1999).  Rapid  quantification  of  mixed  chimerism  using  multiplex  amplification  of  short  tandem  repeat  dấu  ấns  and  fluorescence  detection.  Bone Marrow  Transplant  ;  23,  1055– 1060.  Ngày nhận bài báo: Ngày 30 tháng 7 năm 2013  Ngày phản biện: ngày 09 tháng 9 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013