Bước đầu ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng đánh giá tồn lưu tế bào ác tính tổ hợp gen TEL‐AML1 tại Bệnh viện truyền máu huyết học

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  184 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG   ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH TỔ HỢP GEN TEL‐AML1   TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC  Nguyễn Thị Minh Yên*, Phan Thị Xinh**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng (RQ‐PCR) trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT)  trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) có mang tổ hợp gen TEL‐AML1.  Đối tượng và phương pháp: 13 BN được chẩn đoán BCCDL‐B có biểu hiện TEL‐AML1 bằng RT‐PCR và  FISH được khảo sát TLTBAT lúc chẩn đoán và trong quá trình theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR sử dụng  Taqman Probe.  Kết quả nghiên cứu: Trước điều trị, hầu hết các BN đều có biểu hiện TEL‐AML1 ở mức độ cao với kỹ  thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH. Sau khi hoàn tất giai đoạn tấn công, có 5 trong 13 BN (38,46%) thì vẫn còn  biểu hiện TEL‐AML1 ở mức thấp từ 0,03% đến 0,28 % trong khi FISH và RT‐PCR đều âm tính. Đối với BN  ALL‐10, kết quả khảo sát bằng kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 trước điều  trị là 75,82%, giảm còn 0,29% (gần 3 log) sau điều trị tấn công và không còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐ AML1 sau điều trị tăng cường. BN ALL‐13 với mức độ biểu hiện TEL‐AML1 là 31,18% so với ABL, sau điều  trị xong giai đoạn tấn công, TLTBAT là 0,16% (giảm khoảng 2 log) và 0,10% sau đó 2 tháng. Tuy nhiên, tỷ lệ  TLTBAT bắt đầu tăng lên ở các lần gửi mẫu tiếp theo lần lượt là 0,36% và 2,42% cho thấy xuất hiện lại dòng tế  bào ác tính.  Kết  luận: Bước đầu sử dụng kỹ thuật RQ‐PCR đánh giá TLTBAT trong BCCDL‐B cho thấy có ý nghĩa  trong đánh giá lui bệnh và dự đoán nguy cơ tái phát trong quá trình điều trị cho BN có mang tổ hợp gen TEL‐ AML1.  Từ khóa: TEL‐AML1, tồn lưu tế bào ác tính, PCR định lượng.  ABSTRACT  DEVELOPMENT OF REAL‐TIME QUANTITATIVE PCR   TO MONITOR MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN TEL/AML1 POSITIVE PATIENTS   AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL  Nguyen Thi Minh Yen, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 184 ‐ 189  Object: Using Real Time Quatitative  ‐ PCR  (RQ‐PCR)  to  assess minimal  residual  disease  (MRD)  in  patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia (ALL).   Methods:  13  B‐ALL  patients  detected  TEL/AML1  positive  by  FISH  and  RT‐PCR  methods  before  chemotherapy are monitored MRD by RQ‐PCR with Taqman Probe.   Results: Before chemotherapy, most of patients express TEL‐AML1 at high  levels by RQ‐PCR, RT‐PCR  and FISH. At the end of the induction therapy, 5 in13 cases (38.46%) are still detected MRD at the very low  levels, from 0.03% to 0.28 %; while both FISH and RT‐PCR indicate the negative result. To patient ALL‐10, the  result of RQ‐PCR shows the TEL‐AML1 high positive  level at diagnosis time, standing at 75.82%, declining  * Khoa Di Truyền Học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh  ** Bộ môn Huyết Học ‐ Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 093.2728.115   Email: phanthixinh@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  185 sharply to 0.29% (approximately 3 logs) after induction therapy and then vanishing after intensification therapy.  Patient ALL‐13 shows positive TEL‐AML1/ABL level at 31.18%; after induction therapy, MRD occupies 0.16%  (decrease over 2 logs) and declining to 0.10% after 2 months. However, there is a significant increasing in MRD  levels of the next 2 times, 0.36% and 2.42%, respectively.  Conclusions: The first step applying RQ‐PCR method to assess MRD in TEL‐AML1 positive ALL patients  shows the important value of monitoring remission and predicts a relapse risk in treatment duration.  Key words: TEL‐AML1, minimal residual disease, Real Time Quatitative PCR.    ĐẶT VẤN ĐỀ  Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) là  một yếu  tố dự đoán nguy cơ  tái phát  rất quan  trọng ở bệnh nhân (BN) bệnh bạch cầu cấp dòng  lympho (BCCDL)(1,6,9). Trong hầu hết các nghiên  cứu, tỷ lệ TLTBAT lớn hơn 0,01% là tỷ lệ thuận  với nguy cơ  tái phát(2). Hiện nay, việc đánh giá  TLTBAT  trong BCCDL  có  thể  sử dụng  các  kỹ  thuật  như  Flow  Cytometry  (FCM),  PCR  định  lượng  (RQ‐PCR)  các  tái  sắp  xếp  gen  imunoglobullin  và  T‐cell  receptor  và  RQ‐PCR  các tổ hợp gen thường gặp(9,2,7). Trong đó, hai kỹ  thuật đầu tiên có khả năng là theo dõi khoảng 80  ‐ 95% các BN(8,9). Đối với những BN BCCDL‐B có  biểu hiện tổ hợp gen như TEL/AML1, BCR/ABL,  E2A/PBX1 và MLL/AF4 thì RQ‐PCR khảo sát các  tổ hợp  gen  trên  được  lựa  chọn  ưu  tiên  vì  đặc  hiệu cho dòng tế bào ung thư(2,3,6,8) và có thể theo  dõi được khoảng 30 ‐35% trường hợp.  Tổ  hợp  gen  TEL/AML1  được  tạo  thành do  chuyển  vị  t(12;21)(p13;q22)  gặp  trong  khoảng  20–25% BN BCCDL‐B và là yếu tố tiên lượng tốt  (8). Theo báo cáo của một số nghiên cứu, sau đợt  điều trị tấn công, kết quả đánh giá TLTBAT cho  thấy có khoảng 40‐50% bệnh nhân vẫn còn biểu  hiện  tổ  hợp  gen  TEL‐AML1(2,5).  TLTBAT  được  chứng minh  là  liên quan  đến nguy  cơ  tái phát  sau  này.  Trong  những  nghiên  cứu  về  vấn  đề  này,  các  tác giả  đã  đưa  ra kết quả  chung  rằng  những BN không phát hiện TLTBAT vẫn chưa  thấy bị  tái phát,  tuy nhiên,  đối  với những BN  vẫn  còn TLTBAT, một  số  trường hợp  đã bị  tái  phát(4,8,11).  Huyết học (BVTMHH) TP. HCM, sau khi đã  thiết lập thành công điều kiện của kỹ thuật RQ‐ PCR cho tổ hợp gen TEL/AML1(12), chúng tôi tiến  hành  khảo  sát  TLTBAT  trên  BN  có  biểu  hiện  TEL/AML1 ở các giai đoạn sau điều trị, đặc biệt  sau giai đoạn tấn công.  ĐỐI   TƯỢNG  – PHƯƠNG   PHÁP   NGHIÊN   CỨU  Đối tượng  BN được chẩn đoán BCCDL‐B dựa vào  tủy  đồ  và  dấu  ấn  bề mặt  tế  bào  tại  BVTMHH  từ  tháng 06/2010 đến tháng 03/2013. Các BN này có  kết quả RT‐PCR dương tính với tổ hợp gen TEL‐ AML1 trước khi bắt đầu điều trị và có gửi mẫu  theo dõi sau điều trị.   Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca.  Phương pháp tiến hành  Xử lý mẫu và ly trích RNA  Lấy  2  mL  mẫu  tủy  trong  chống  đông  EDTA, ly giải hồng cầu bằng dung dịch ly giải  chứa  1M  MgCl2,  5M  NaCl  và  1M  Tris‐HCl.  Rửa tế bào bằng dung dịch đệm PBS và lấy 1 x  107  tế  bào  trộn  đều  với  1  mL  Trizol  (Life  Technologies, Mỹ).   RNA được ly trích từ mẫu tế bào lưu trữ với  Trizol  theo qui  trình kỹ  thuật do  công  ty  cung  cấp.  Sau  đó,  đo  nồng  độ  RNA  bằng  máy  Ultrospec  5300  pro  (GE Heathcare, Anh). Mẫu  đạt chất lượng khi có tỉ lệ OD260/OD280 = 1,8 –  2,0.  Lấy  đúng  1g  RNA  để  tổng  hợp  cDNA  nhằm  đảm bảo  sự đồng nhất  đầu vào  của  các  mẫu cần định  lượng. Lượng RNA còn  lại được  lưu trữ ở nhiệt độ ‐80oC.  Tổng hợp cDNA  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  186 Tổng hợp cDNA sử dụng bộ kít Transcriptor  First  Strand  cDNA  Synthesis Kit  (Roche, Thụy  Sĩ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp  RNA và men sao chép ngược trên được ủ bằng  máy  luân  nhiệt  iCycler  (Biorad, Mỹ)  theo  chu  trình  luân  nhiệt  là  25oC  trong  10  phút,  55oC  trong 30 phút, và 85oC trong 5 phút. Mẫu cDNA  được  pha  loãng  để  điều  chỉnh  về  nồng  độ  50  ng/3L và được lưu trữ ở ‐20oC đến khi sử dụng.  Thực hiện RQ‐PCR  Tiến  hành  chạy  RQ‐PCR  đồng  thời  mẫu  bệnh nhân, mẫu chuẩn và chứng nội tại ở cùng  điều kiện theo mô tả Thanh TTT và cộng sự(12) trên  máy CFX 96 của (Biorad, Mỹ). Mẫu chuẩn trong  nghiên cứu này  được  chuẩn bị  theo mô  tả  của  Thanh TTT  và  cộng  sự(12)  với  Taqman  Probe  có  đầu  5’  được  đánh  dấu  bằng  FAM,  và  đầu  3’  được đánh dấu bằng TAMRA và chứng nội  tại  được  lựa  chọn  sử dụng  là gen ABL. Chu  trình  luân nhiệt cho phản ứng RQ‐PCR như sau: 50oC  trong 2 phút; 95oC trong 10 phút; 50 chu kỳ với  95oC trong 10 giây, 60oC trong 30 giây. Phân tích  kết  quả  trực  tiếp  trên máy mà  không  cần  qua  bước điện di.  Phân tích kết quả  ‐ Kiểm  tra  các  thông  số  của  đường khuếch  đại và đường chuẩn để đánh giá tính chính xác,  hiệu suất phản ứng, và độ tin cậy của phản ứng.   ‐ Tính tỉ  lệ phần trăm tổ hợp gen quan tâm  so với chứng nội tại, thể hiện kết quả dưới dạng  biểu đồ để dễ dàng đánh giá được mức độ tồn  lưu tế bào ác tính.  KẾT QUẢ   Trong thời gian thực hiện nghiên cứu, chúng  tôi đã thu thập được 13 BN chẩn đoán BCCDL‐ B, thỏa mãn tiêu chuẩn chọn mẫu và được khảo  sát biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 qua các giai  đoạn điều  trị bằng kỹ  thuật RQ‐PCR,  trong đó  có 12 BN (ALL‐01 đến ALL‐12) là mới chẩn đoán  và 1 BN (ALL‐13) là tái phát tủy lần 2. Ở lần gửi  mẫu đầu tiên trước điều trị, hầu hết các BN đều  có  biểu  hiện  TEL‐AML1  ở mức  độ  cao  với  kỹ  thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH (Bảng 1), ngoại  trừ ALL‐11 và ALL‐13.   Bảng 1: Kết quả TEL‐AML1 với kỹ thuật RQ‐PCR,  RT‐PCR và FISH lúc chẩn đoán.  STT MÃ BN RQ-PCR TEL- AML1/ ABL (%) RT-PCR TEL-AML1 (%) FISH t(12;21) (%) 1 ALL-01 116,90 (+) 89,00 2 ALL-02 158,69 (+) 96,05 3 ALL-03 105,01 (+) 91,50 4 ALL-04 114,20 (+) 98,00 5 ALL-05 422,01 (+) 98,00 6 ALL-06 71,78 (+) 97,00 7 ALL-07 234,15 (+) 97,50 8 ALL-08 115,38 (+) 97,00 9 ALL-09 204,32 (+) 81,50 10 ALL-10 75,82 (+) 90,00 11 ALL-11 0,35 (+) 15,00 12 ALL-12 56,92 (+) 78,05 13 ALL-13 31,18 (+) 64,45 Đến  lần  gửi mẫu  thứ  hai  sau  khi  hoàn  tất  giai đoạn  tấn công, những BN này không phát  hiện  thấy  TLTBAT  bằng  kỹ  thuật  RT‐PCR  và  FISH. Tuy nhiên, 5 trong 13 BN (38,46%) vẫn còn  biểu hiện TEL‐AML1 ở mức  thấp  từ 0,03% đến  0,28 % với kỹ thuật RQ‐PCR (Bảng 2).   Bảng  2: Kết  quả  của  BN  còn  biểu  hiện  TEL‐ AML1 sau hoàn tất giai đoạn tấn công.  STT MÃ BN RQ-PCR TEL- AML1/ABL (%) RT-PCR TEL-AML1 (%) FISH t(12;21) (%) 1 ALL-05 0,28 (-) 0,00 2 ALL-07 0,03 (-) 0,00 3 ALL-09 0,04 (-) 0,00 4 ALL-10 0,29 (-) Không làm 5 ALL-13 0,16 (-) 0,00 Trong 13 BN  trên,  có 2 BN  đã  tiếp  tục gửi  mẫu để khảo sát TEL/AML1 sau các đợt hóa trị  liệu. Kết quả mức độ biểu hiện TEL‐AML1 qua  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  187 các giai đoạn điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR của  từng BN được mô tả như sau:  BN Châu Ngọc K.  L.  là BN  nữ,  sinh  năm  2004, mã ALL‐10. Kết quả RQ‐PCR của 3 lần gởi  mẫu theo dõi điều trị của BN ALL‐10 được tóm  tắt theo biểu đồ 1.  Biểu đồ 1: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN  ALL‐10   Dựa vào biểu đồ 1, ở  lần gửi mẫu đầu  tiên  (ALL‐10‐1) trước điều trị, kết quả khảo sát bằng  kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ  hợp  gen TEL‐AML1  là  75,82%.  Ở  lần  gửi mẫu  thứ hai (ALL‐10‐2) sau khi hoàn tất giai đoạn tấn  công  thì  tỉ  lệ  này  giảm  gần  3  log  và  vẫn  còn  0,29%. Đến  lần gửi mẫu  thứ ba  (ALL‐10‐3), khi  hoàn  tất  tăng  cường  1  bằng  phát  đồ  FRALLE  2000 nhóm A1, kết quả RQ‐PCR cho thấy không  còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐AML1. Kết  quả  RQ‐PCR  so  với  kết  quả  RT‐PCR  và  FISH  theo Bảng 3.  Bảng 3: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca  ALL‐10 qua các lần gửi mẫu  Mã BN RQ-PCR TEL-AML1/ABL (%) RT-PCR TEL-AML1 FISH t(12;21) (%) ALL-10-1 75,82 (+) 90,00 ALL-10-2 0,29 (-) Không làm ALL-10-3 0,00 (-) 0,00 BN Phan Chí U là BN nam, sinh năm 2000,  mã ALL‐13, tình trạng bệnh là tái phát tủy lần 2.  Kết quả RQ‐PCR các lần gởi mẫu theo dõi điều  trị của BN ALL‐13 được tóm tắt theo biểu đồ 2.  BN ALL‐13 được chẩn đoán  là BCCDL  tái  phát và điều trị theo phác đồ COPRALL 2005.  Theo biểu đồ 2, ở  lần gửi mẫu đầu  tiên  trước  điều  trị (ALL‐13‐1), kết quả RQ‐PCR cho  thấy  mức độ biểu hiện TEL‐AML1  là 31,18% so với  ABL. Sau hơn 3  tháng điều  trị xong giai đoạn  tấn  công,  kết  quả  RQ‐PCR  cho  thấy mức  độ  biểu hiện TEL‐AML1 giảm khoảng 2 log và vẫn  còn 0,16%.  Biểu đồ 2: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN  ALL‐12  Sau đó 2 tháng, sau khi hoàn tất BLOCK R1  R2,  RQ‐PCR  cho  thấy  TLTBAT  chỉ  còn  0,10%  (Bảng 4). Đến  lần gửi mẫu  thứ 4  (ALL‐13‐4) và  thứ 5 (ALL‐13‐5), tỷ lệ TLTBAT đã bắt đầu tăng  lên  lần  lượt  là 0,36% và 2,42%. RT‐PCR cho kết  quả dương tính với cả 5 lần gửi mẫu (Bảng 4).  Bảng 4: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca  ALL‐12  Mã BN RQ-PCR TEL-AML1/ABL (%) RT-PCR TEL-AML1 FISH t(12;21 (%) ALL-13-1 31,18 (+) 64,5 ALL-13-2 0,16 (+) 0,00 ALL-13-3 0,1 (+) Không làm XN ALL-13-4 0,36 (+) Không làm XN ALL-13-5 2,42 (+) Không làm XN BÀN LUẬN   Trong  13  BN  khảo  sát  biểu  hiện  TEL‐ AML1/ABL bằng RQ‐PCR trước điều trị, có 2 BN  ALL‐11 và ALL‐13 cho kết quả lần lượt là 0,35%  và 31,18%,  thấp hơn nhiều  so với các BN khác  (Bảng 1). Đối với  trường hợp ALL‐11, kỹ  thuật  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  188 FISH  cho  kết  quả  dương  tính  t(12;21)  ở mức  thấp với  15%, ngoài  ra  còn  có  thêm  1 dòng  tế  bào khác chiếm 80% biểu hiện 4 tín hiệu nhiễm  sắc thể 21. Trường hợp ALL‐13 đã được điều trị  bằng phát đồ đặc hiệu và tái phát lần 1, sau đó  được  điều  trị  bằng phát  đồ  FRALLE  93  và  tái  phát tủy lần 2, nên TEL‐AML1 không biểu hiện ở  mức  cao.  Những  trường  hợp mới  được  chẩn  đoán,  chưa  trải  qua  quá  trình  điều  trị  thì  tỉ  lệ  TEL‐AML1/ABL rất cao như ALL‐2, ALL‐5, ALL‐ 7, ALL‐9,.. với  tỉ  lệ >100%  (Bảng 1), cao hơn so  với tỉ lệ tế bào có t(12;21) khảo sát bằng kỹ thuật  FISH, cho  thấy dòng  tế bào ung  thư có  t(12;21)  biểu hiện bản sao TEL‐AML1 rất mạnh.   Tổ hợp gen TEL‐AML1 xuất hiện ở  trẻ em  mắc bệnh BCCDL‐B cho tiên lượng tốt (5, 8). Sau  khi hoàn tất điều trị tấn công, kết quả kiểm tra  bằng FISH và RT‐PCR  là âm  tính hay kết quả  RQ‐PCR cho TLTBAT ở mức thấp hoặc không  phát hiện đã  thể hiện khả năng đáp ứng điều  trị tốt của các BN BCCDL‐B dương tính tổ hợp  gen TEL‐AML1. Tuy nhiên, 38,46% BN vẫn còn  TLTBAT ở mức rất thấp (<1%), tương đồng với  các  nghiên  cứu  của  tác  giả  Gabert  J  (2)  và  Drunat S  (4) và cộng sự. Kết quả này đã phản  ánh độ nhạy cao, độ đặc hiệu theo dòng tế bào  ung  thư  của  kỹ  thuật RQ‐PCR,  và  đây  là  ưu  điểm  của kỹ  thuật RQ‐PCR như một  công  cụ  hiệu  quả  trong  đánh  giá  TLTBAT  với  BN  dương tính với tổ hợp gen.  Việc phát hiện TLTBAT  trong  các BN  sau  khi hoàn  tất  điều  trị  tấn  công  cho dự hậu về  nguy cơ  tái phát,  tương đồng với báo cáo của  tác giả de Haas V và  cộng  sự  (4). Nghiên  cứu  này đã so sánh  trên 2 nhóm BN  là chẩn đoán  mới  và  đã  tái  phát  với mức  độ  TLTBAT  sau  điều trị tấn công lần lượt là 0,02% ‐ 0,001% và  0,24%  ‐  1,2%,  và  từ  đó  đã  cho  thấy  được  ý  nghĩa  quan  trọng  của  TLTBAT  trong  tiên  lượng  cho BN. Theo báo  cáo  của Madzo  J và  cộng  sự  (8),  nghiên  cứu  đã  sử  dụng  kỹ  thuật  RQ‐PCR và  cho kết quả  là  có 75% BN không  còn phát hiện TLTBAT  tại  thời  điểm kết  thúc  điều trị tấn công và chưa có BN nào bị tái phát  sau 45 tháng điều trị. Tuy nhiên, đối với nhóm  BN  vẫn  còn  phát  hiện  TLTBAT,  có  3  BN  có  TLTBAT  là  >  0,01%  và  4  BN  có  TLTBAT  <0,01% đã bị tái phát. Một báo cáo khác của tác  giả Seeger K và cộng sự (11) cũng thống kê trên  94 BN  và  cho  kết  quả  là  78% BN  không  còn  biểu hiện TEL‐AML1  sau  điều  trị  tấn công và  cũng chưa phát hiện BN nào bị  tái phát  trong  thời gian nghiên cứu; trong tổng số những BN  còn dương tính thì có 2 BN đã tái phát sau 57,8  tháng điều trị.   Khả  năng  sống  không  sự  kiện  của  các BN  mắc  BCCDL‐B  dương  tổ  hợp  gen  TEL‐AML1  trong 4 năm là 90% ‐ 100% (10). Chính vì vậy, sau  hơn 3 năm điều trị từ 6 ‐ 2010 đến 4 ‐ 2013, các  BN này vẫn  còn  trong  tình  trạng  lâm  sàng  ổn  định  và  đang  trong  giai  đoạn  điều  trị duy  trì.  Tuy nhiên, tình trạng lâm sàng ổn định hiện tại  không  có nghĩa  loại  trừ  nguy  cơ  tái phát,  nên  việc đánh giá TLTBAT trong suốt quá trình điều  trị là cần thiết. Do đó, chúng tôi đã sử dụng RQ‐ PCR  để  theo dõi  2 BN  có  gửi mẫu những  lần  tiếp theo. Kết quả đánh giá TLTBAT ở BN Châu  Ngọc K. L. (ALL‐10) với tình trạng là bệnh chẩn  đoán mới và có gửi mẫu theo dõi 2  lần sau đó.  Từ lúc chẩn đoán đến lúc hoàn tất giai đoạn tấn  công  và  tiếp  theo  đó  là  giai  đoạn  tăng  cường,  TLTBAT đã thuyên giảm đáng kể từ mức cao là  75,82% xuống mức 0,29% và cuối cùng là 0,00%.   Đối với BN Phan Chí U (ALL‐13), trong tình  trạng  là tái phát tủy  lần 2  lúc khảo sát, kết quả  RQ‐PCR  trong  biểu  đồ  biểu  diễn  mức  độ  TLTBAT từ thuyên giảm đến sự gia tăng trở lại  qua các giai đoạn điều trị. Sau 5 tháng điều trị,  TLTBAT giảm từ 31,18% xuống mức rất thấp là  0,16% và tiếp tục giảm chỉ còn 0,10% ở lần thứ 3,  tương đồng với các kết quả khác như tình trạng  hồi phục  tốt về huyết  đồ,  lui bệnh  trên  tủy  đồ  cũng  như  dấu  ấn miễn  dịch  sau  điều  trị  tấn  công.  Tuy  nhiên,  TLTBAT  vẫn  còn  được  phát  hiện ở mức thấp có thể dự đoán về nguy cơ tái  phát sau này cho bệnh nhân  (4,8,11). Điều này đã  được thể hiện rõ ràng hơn khi BN tiếp tục được  theo dõi lần 4 và 5, TLTBAT bắt đầu tăng lên trở  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  189 lại, từ 0,10% lên 2,42%. Kêt quả của nghiên cứu  cho  thấy việc đánh giá TLTBAT  là quan  trọng,  dự đoán nguy cơ tái phát của BN.  KẾT LUẬN  Kết quả bước  đầu  ứng dụng kỹ  thuật RQ‐ PCR để đánh giá TLTBAT  trên các BN BCCDL  dương tính TEL‐AML1 cho thấy sự thay đổi mức  độ biểu hiện trong suốt quá trình điều trị. Điều  này  có ý nghĩa  trong  đánh giá  lui bệnh và dự  đoán nguy cơ  tái phát cho BN có mang  tổ hợp  gen TEL‐AML1.  TÀI LIỆU THAM KHẢO   1. Borowitz  MJ, Devidas  M, Hunger  SP  (2008).  Clinical  significance of minimal  residual disease  in  childhood  acute  lymphoblastic  leukemia  and  its  relationship  to  other  prognostic  factors:  a  Childrenʹs  Oncology  Group  study.  Blood;111(12):5477‐85.  2. Campana  D  (2010).  Minimal  residual  disease in acute  lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ  Program.;7‐12.  3. de Haas V, Breunis WB, Dee R, et al  (2002). The TEL‐AML1  real‐time quantitative polymerase chain reaction (PCR) might  replace  the  antigen  receptor‐based  genomic PCR  in  clinical  minimal  residual  disease  studies  in  children  with  acute  lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol.;116(1):87‐93.  4. de Haas V, Oosten L, Dee R,  et  al  (2000). Minimal  residual  disease studies are beneficial  in the follow‐up of TEL/AML1  patients with B‐precursor acute lymphoblastic leukaemia. Br J  Haematol. ;111(4):1080‐6.  5. Drunat  S, Olivi M, Brunie G,  et  al  (2001). Quantification  of  TEL‐AML1  transcript  for  minimal  residual  disease  assessment in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J  Haematol;114(2):281‐289.  6. Gabert  J,  Beilaird,  et  al  (2003).  Standardization  and  quality  control  studies  of  “real‐time”  quantitative  reverse  transcriptase  polymerase  chain  reaction  of  fusion  giene  transcripts  for  residual  disease  detection  in  leukemia  –  A  Europe Against Cancer Program. Leukemia;17:2318–2357.  7. Gaipa  G, Cazzaniga  G, Valsecchi  MG  (2012).  Time  point‐ dependent  concordance  of  flow  cytometry  and  real‐time  quantitative  polymerase  chain  reaction  forminimal  residual  disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia.  Haematologica;97(10):1582‐93.   8. Madzo J, Zuna J, Muzikova K, et al (2003). Slower Molecular  Response  to  Treatment  Predicts  Poor Outcome  in  Patients  with  TEL/AML1  Positive  Acute  Lymphoblastic  Leukemia.  Cancer;97:105–113.  9. Schrappe  M  (2012).  Minimal  residual  disease:  optimal  methods,  timing,  and  clinical  relevance  for  an  individual