Chẩn đoán nguyên nhân di truyền gây bệnh thoái hóa cơ tủy bằng kỹ thuật Multiplex Ligation‐dependent Probe Amplification

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 37 CHẨN ĐOÁN NGUYÊN NHÂN DI TRUYỀN GÂY BỆNH THOÁI HÓA   CƠ TỦY BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION‐DEPENDENT   PROBE AMPLIFICATION  Nguyễn Thị Băng Sương*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Dương Thị Huệ**, Lê Thị Khánh Vân***, Trần Diệp Tuấn*.  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Bệnh thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy: SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm  trên nhiễm sắc thể thường. Khoảng 94 % trường hợp bệnh nhân SMA bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn  6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang 1 allele SMN1 bị đột biến mất đoạn và 1 allele SMN1 bị đột biến điểm.  Mục  tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kĩ  thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen  SMN1.   Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 bệnh nhi được chẩn đoán mắc bệnh SMA dựa vào các triệu  chứng lâm sàng điển hình, DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân. Thực hiện phản ứng MLPA  sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà Lan để phát hiện đột biến mất đoạn gen SMN1.   Kết quả: Phát hiện được 33/50 (chiếm 66%) trường hợp bệnh nhi mang đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng  hợp tử, 08 trường hợp (chiếm 16%) mang đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử.   Kết luận: Áp dụng thành công phương pháp MLPA trong xác định kiểu đột biến mất đoạn exon 7, exon 8  của gen SMN1 ở bệnh nhân được chẩn đoán SMA.   Từ khóa: MLPA, thoái hóa cơ tủy SMA, đột biến gen SMN1, chẩn đoán trước sinh bệnh SMA.  ABSTRACT  DETECTION OF GENETIC MUTATION WHICH CAUSES SPINAL MUSCULAR ATROPHY DISEASE  BY MULTIPLEX LIGATION‐ DEPENDENT AMPLIFICATION PROBE METHODE  Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Duong Thi Hue, Le Thi Khanh Van, Tran Diep Tuan.  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 36 ‐ 42  Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disorder, with an  incidence of about 1 in 10000 live births and with a carrier frequency of about 1 in 50. Approximately 94% of  SMA patients have a homozygote deletion of exon 7 in the SMN1 gene. The remaining 6% of patients have a  point mutations in one allele and a deletion in the other.   Objectives: We studied the application of MLPA technique to diagnose deletion mutations in SMN1 gene  cause spinal muscular atrophy disease.   Patients  and  Methods:  Genomic  DNA  of  50  SMA  patients  were  extracted  from  peripheral  blood  leukocytes using the QiAgen kit. MLPA technique was performed to detect deletion mutation of SMN1 gene.   Results: There were 33/50 patients with deletion homozygous  on SMN1 gene deletion, 08 patients had  deletion heterozygotes.   Conclusion: Application successfully of MLPA method in identify deletion in SMN1 gene.  Keywords: MLPA, SMA, SMN1, Prenatal diagnosis of SMA  * Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh  **Khoa Sinh, Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh  ***Khoa Thần Kinh, Bệnh viện Nhi Đồng 2  Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương‐ ĐT: 0914007038‐ Email: suongnguyenmd@gmail.com.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  38 ĐẶT VẤN ĐỀ  Thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy:  SMA)  là  bệnh  di  truyền  do  gen  lặn  nằm  trên  nhiễm sắc thể thường, bệnh được mô tả đầu tiên  bởi  nhà  thần  kinh  học  Guido  Wernig  (người  Australia)  vào  năm  1891(9).  Đây  là  một  trong  những  bệnh  thần  kinh  cơ  di  truyền  hay  gặp  nhất. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 và tần  suất  người  bình  thường  mang  gen  bệnh  là  1/50(2,5,6). Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng  như sau: giảm khả năng vận động tiến triển với  các đặc trưng là yếu cơ đối xứng gốc chi, trương  lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất,  lưỡi  rung, biến dạng  lồng ngực và  cứng khớp.  Trường  hợp  nặng,  bệnh  nhi  chết  trong  vòng  năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm  phổi và suy hô hấp(4,9).  Nguyên nhân chính gây bệnh SMA là do đột  biến  gen  SMN  (survival motor  neuron).    gen  SMN nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 5  (5q13),  gồm  hai  bản  sao  SMN1  và  SMN2,  hai  gen  này  có  trình  tự  gần  như  giống  nhau,  chỉ  khác nhau ở 5 nucleotide (Hình 1.B)(9).  Hình 1: Sơ đồ vị trí của gen SMN và sự khác nhau giữa hai  gen SMN1 và SMN2 A. Cấu trúc vùng  gen SMA  gồm 4  gen: H4F5, SMN, NAIP và p44c. B. Năm vị trí nucleotide khác nhau giữa hai  gen SMN1 và SMN2.  Gen SMN quy định  tổng hợp protein SMN  biểu  hiện  chủ  yếu  ở  các  tế  bào  thần  kinh  vận  động tủy sống (spinal motor neuron). Cả hai gen  SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương  ứng,  tuy  nhiên  do  sự  khác  nhau  ở  một  vài  nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có  chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng  hợp có chức năng rất hạn chế. Do đó, đột biến  gen SMN1 là nguyên nhân chính gây nên bệnh  SMA.  Các  kết  quả  nghiên  cứu  cho  thấy  94%  bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị mất cả hai bản sao  của gen SMN1 còn 6% bệnh nhân rơi vào trường  hợp mang 1 allele SMN1 bị đột biến mất đoạn  và 1 allele SMN1 bị  đột biến  điểm(1,4,8). Nghiên  cứu của Ogino S. kết luận 94% bệnh nhân thoái  hóa cơ tủy bị đột biến mất cả hai exon 7 của gen  SMN1 và đa số có kèm theo mất cả exon 8 của  gen SMN1(5). Mức độ nguy hiểm của bệnh SMA  được xếp thứ hai trong các bệnh lí thần kinh ‐ cơ  di truyền chỉ sau bênh loạn dưỡng cơ Duchenne  và chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, cuối  cùng bệnh nhân  sẽ  tử vong. Trẻ em mắc bệnh  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 39 SMA  là một gánh nặng cho gia đình, xã hội và  chính bản thân bệnh nhân. Do vậy hiện nay các  nhà khoa học  chọn  lựa phương pháp  sàng  lọc  trước sinh với mục đích hạn chế sinh ra các em  bé mắc bệnh thoái hóa cơ tủy.   Hiện nay ở Việt Nam, một số  tác giả đã sử  dụng kỹ  thuật PCR và enzyme cắt giới hạn để  chẩn  đoán  bệnh  thoái  hóa  cơ  tủy,  tuy  nhiên  phương pháp này chỉ phát hiện được các bệnh  nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp  tử  mà không phát hiện được kiểu gen dị hợp tử, do  vậy đã bỏ sót tổn thương(3). Hiện nay, Multiplex  Ligation‐dependent Probe Amplification  (MLPA)  là  phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn  đoán  đột  biến mất  đoạn  ngắn,  lặp  đoạn  cũng  như phát hiện kiểu gen dị hợp  tử với độ chính  xác cao và cho kết quả nhanh chóng(7). Xuất phát  từ thực tiễn đó, nghiên cứu được thực hiện với  mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật MLPA  để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8  của gen SMN1.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  ‐  Nhóm  chứng:  30  người  bình  thường  (15  nam  và  15  nữ).  Được  dùng  để  hiệu  chỉnh  tín  hiệu  khuếch  đại  các  đoạn dò  và  làm mẫu  đối  chứng.  ‐ Nhóm nghiên cứu: 50 bệnh nhân được chẩn  đoán mắc  bệnh  thoái  hóa  cơ  tủy dựa  trên  các  triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình  (tại Bệnh viện Nhi đồng I, Nhi đồng II).  Phương pháp nghiên cứu  Quy trình lấy mẫu  Bệnh  nhân  được  lấy  2 ml máu  tĩnh mạch  chống đông EDTA (1,5 mg/ml). Quy trình được  đảm bảo tuyệt đối vô trùng.  Tách chiết DNA  Dùng phương pháp kết  tủa và  ly  tâm  qua  cột  lọc để  tách chiết DNA  từ mẫu, kit sử dụng  của hãng QiAgen.  Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA  Sản phẩm  được  kiểm  tra  bằng máy Nano‐ drop để đánh giá độ tinh sạch và xác định nồng  độ DNA. Các mẫu DNA có nồng độ  từ 50 đến  250ng/μl và đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch được  sử dụng để chạy phản ứng MLPA.  Tiến hành phản ứng MLPA  Sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà  Lan. Sản phẩm sau khuếch đại được phân tách  đoạn  trên  hệ  thống  điện  di  mao  quản  GenomeLab GeXP  (Beckman Coulter). Kết quả  sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động  để tìm đột biến nhờ vào phần mềm GeneMarker  version 1.6 (Softgenetics).   Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng bảng và  dạng biểu đồ sóng. Mỗi đỉnh  tín hiệu  (peak)  là  sản phẩm  của một probe. Kích  thước  của mỗi  peak được xác định nhờ so sánh với thang kích  thước  và mẫu  đối  chứng  để  tính  ra  tỉ  lệ DQ  (Dosage quotients). Từ đó tính được số bản sao  của  gen  SMN1  và  SMN2  (theo  protocol  của  MRC‐Holland).  KẾT QUẢ  Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của  các đoạn dò đặc hiệu của kit SALSA MLPA  P021‐A2  Beckman  Coulter  Genomelab  GeXP  Tiến hành phân tích 30 mẫu DNA tách chiết  từ  30  người  bình  thường  khỏe mạnh  với  hỗn  hợp  probe  P021‐A2,  sau  đó  thu  thập  tín  hiệu  khuếch đại của các đoạn dò  tương ứng với các  exon  để  tính giá  trị  trung bình,  từ đó  thiết  lập  nên  thang  chuẩn  phù  hợp  cho  hệ  thống  GenomeLab GeXP (Beckman Coulter).  Bảng 1: Tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu exon  SALSA MLPA probe ( gen) Exon Hiệu chỉnh tín hiệu của các đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh Q - fragments 64 – 70 – 76 – 82 64-70-76-82 X 100 100 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  40 SALSA MLPA probe ( gen) Exon Hiệu chỉnh tín hiệu của các đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh Y 105 105 Reference probe 01061– 0L0727 12q15 140 140 Reference probe 01254– L00815 5p13 148 148 Reference probe 01112– L00549 3q12 157 157 Reference probe 01448– L00932 17p11 166 166 Reference probe 00808– L00638 18q21 175 175 GTF2H2 probe 01256– L00972 C>G 185 185 Reference probe 01115– L00005 7q21 193 193 RAD17 probe 01257– L00184 RAD17 202 202 Reference probe 01220– L00689 10p15 210 210 GTF2H2 probe 01813– L00818 G>A 218 218 Reference probe 01120– L00060 11q13 229 229 NAIP probe 01259– L00811 NAIP1 238 238 Reference probe 00816– L00334 21q11 247 247 Reference probe 00807– L00325 18q23 255 255 SMN1 probe 01260– L00966 Exon 7 270 270 SMN2 probe 01260– L00967 Exon 7 276 276 Reference probe 00824– L00970 3q25 285 285 SMN1 probe 01812– L01373 Exon 8 294 294 SMN2 probe 01812– L01372 Exon 8 300 300 Reference probe 00871– L00461 13q34 310 310 Reference probe 01042– L00791 8q24 319 319 GTF2H2 probe 01262– L00971 GTF2H2 328 328 Reference probe 00812– L00330 21q21 337 337 NAIP probe 01263–L00812 NAIP2 346 346 Reference probe 00965–L00552 2p13 355 355 SMN1/2 probe 01814–L00807 SMN1/2 364 364 Reference probe 01046–L00624 8p11 373 373 SMN1/2 probe 01265–L00808 SMN1/2 382 382 Reference probe 01160–L00716 3p25 391 391 SMN1/2 probe 01816–L00809 SMN1/2 400 400 Reference probe 00963–L09340 2p16 409 409 SMN1/2 probe 01815–L00810 SMN1/2 419 419 Reference probe 01108–L00679 8q23 427 427 Reference probe 01057– L00630 17q12 433 433 Reference probe 00802–L00320 13q34 445 445 SERF1B 01269–L00813 SERF1B 454 454 Reference probe 00846–L00377 12q24 463 463 Nhận xét: Thang chuẩn phù hợp với hệ thống  tín hiệu theo protocol của hãng cho thấy tín hiệu  của các đoạn dò là ổn định.  Kết quả  xác  định  đột biến mất  đoạn  gen  SMN1 đồng hợp tử của bệnh nhi   Các mẫu DNA  của bệnh nhi  sau khi  được  khuếch  đại  và  chạy  điện  di  mao  quản  được  phân  tích  tự  động  nhờ  vào  phần  mềm  GeneMarker version 1.6 sau đó đối chiếu với giá  trị DQ  thu  được kết quả  các  trường hợp bệnh  nhi như hình 1, 2, bảng 2.  Ở người bình thường xuất hiện hai đỉnh ở vị  trí probe 270nt (biểu hiện sản phẩm của exon 7)  và 294nt (biểu hiện sản phẩm của exon 8), trong  khi đó ở bệnh nhân lại không xuất hiện hai đỉnh  này (tương ứng với giá trị DQ=0), chứng tỏ các  probe  đặc  hiệu  không  được  gắn  vào  hai  exon  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 41 này, do đó kết luận gen SMN1 bị mất hai exon 7  và 8 trên cả hai allele, tức kiểu gen đồng hợp tử.  Hình 2: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA57. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân SMA57.  Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử của bệnh nhi   Hình 3: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA61. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân SMA57.  Nhận xét: Bệnh nhân có kích thước đỉnh exon  7  (270nt) và exon 8  (294nt) bằng ½ so với mẫu  đối  chứng,  tương  ứng với  giá  trị DQ=0,484  và  0,597. Điều này chứng  tỏ  lượng probe đặc hiệu  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  42 bắt  tại  hai  exon  này  chỉ  bằng một  nửa  so  với  người bình thường, do đó kết luận gen SMN1 bị  mất hai exon 7 và 8 chỉ trên một allele, tức kiểu  gen dị hợp tử.  Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1  Bảng 2: Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1 ở bệnh  nhân SMA  Kết quả phân tích Số lượng (người) Tỷ lệ (%) Mất đoạn đồng hợp tử 33 66 Mất đoạn dị hợp tử 08 16 Không phát hiện mất đoạn 09 18 Tổng số 50 100 Nhận  xét: Kết  quả  phân  tích  đã  phát  hiện  được  33/50  (chiếm  66%)  trường  hợp  bệnh  nhi  mang  đột biến mất  đoạn gen SMN1  đồng hợp  tử, phát hiện  được 08  trường hợp  (16%) mang  đột  biến mất  đoạn  dị  hợp  tử.  18%  bệnh  nhân  không bị đột biến mất đoạn SMN1.  Bảng 3: Vị trí đột biến mất đoạn trên gen SMN1  Vị trí đột biến mất đoạn Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Đột biến mất exon 7 và 8 29 87,9 Đột biến mất exon 7, không mất exon 8 4 12,1 Tổng 33 100 Nhận xét: Trong số 26 bệnh nhân bị đột biến  mất  đoạn  đồng hợp  tử gen SMN1,  có 25 bệnh  nhân mang đột biến mất đoạn cả hai exon 7 và 8  (chiếm 89,3%), chỉ có 3/28 bệnh nhân mất đoạn  riêng lẽ exon 7 mà không mất đoạn exon 8.   BÀN LUẬN  Bệnh thoái hóa cơ tủy có tần suất mắc bệnh  khoảng 1/10.000 đến 1/25.000, trong khi đó tỷ lệ  người  lành mang  gen  bệnh  khá  cao  1/50  đến  1/40. Nguyên nhân đã được xác định  là do đột  biến gen SMN1. Xác suất của cặp vợ chồng cùng  mang gen dị hợp tử sinh con mắc bệnh là 25%,  sinh con mang gen dị hợp tử là 50% và chỉ 25%  số con của họ có kiểu gen SMN1 bình thường(2, 6).  Ở các nước phát triển, bệnh đã được kiểm soát  từ giai  đoạn  chẩn  đoán người  lành mang gen,  sau đó thực hiện kỹ thuật PGD (Preimplantation  Genetics  Diagnosis)  để  chọn  ra  các  phôi  bình  thường và  cấy vào  tử  cung  của người mẹ. Do  vậy  tỷ  lệ mắc bệnh SMA được khống chế hiệu  quả. Ở Việt Nam, các bệnh lý di truyền vẫn còn  là vấn đề khó khăn của ngành y tế, một số bệnh  lý  như  thalassemia  đã  được  đưa  vào  chương  trình quốc gia để kiểm soát do tỷ  lệ bệnh nhân  và người lành mang gen tăng rất cao trong cộng  đồng(9). Bệnh SMA chỉ mới được quan tâm trong  2 năm trở lại đây, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử  đã giúp  chẩn  đoán  xác  định  bệnh,  từ  đó  giúp  phân biệt nguyên nhân khó thở ở trẻ sơ sinh là  do  sự yếu  cơ  trong bệnh SMA hay do nguyên  nhân  khác. Chính  việc  xác  định  nguyên  nhân  này giúp cho bác sĩ  lâm sàng định hướng điều  trị và theo dõi hiệu quả, chính xác hơn.  Có nhiều kỹ thuật chẩn đoán bệnh SMA. Ở  Việt Nam  chỉ một  số  labo  di  truyền  thiết  lập  được quy  trình  chẩn  đoán bệnh này,  trong  đó  phương  pháp  PCR‐RFLP  được  sử  dụng  nhiều  do dễ thực hiện và giá thành hợp lý(3). Tuy nhiên  phương pháp PCR‐RFLP chỉ phát hiện các bệnh  nhân mất đoạn SMN1 ở dạng đồng hợp tử chứ  không  thể phát hiện được các đối  tượng mang  kiểu gen dị hợp tử(5). Để khắc phục nhược điểm  này  các  nhà  khoa  học  đã  nghiên  cứu  và  phát  hiện tính ưu việt của phương pháp MLPA trong  chẩn đoán SMA. Do tính nhạy cao, lượng probe  bắt lên DNA đích phụ thuộc vào sự có mặt của  số  lượng bản  sao DNA  đích, qua  điện di mao  quản đã phát hiện chính xác tỷ lệ số lượng bản  sao  của  gen  SMN1.  Dạng  đột  biến mất  đoạn  đồng  hợp  tử  trên  gen  SMN1sẽ  làm  sản  phẩm  khuếch đại không có hai đỉnh probe tương ứng  với  kích  thước  270nt  và  294nt,  trong  khi  đó  ở  người bình thường vẫn xuất hiện hai đỉnh này.  Các  bệnh  nhân  mất  đoạn  dị  hợp  tử  có  đỉnh  270nt  và  294nt  chỉ  bằng ½  so  với  người  bình  thường(4). Trong nghiên  cứu này,  chúng  tôi  đã  phát hiện 33/50 bệnh nhân  (chiếm  66%) bị  đột  biến mất đoạn gen SMN1 trên cả hai allele. Bên  cạnh đó phát hiện 08/50 bệnh nhân (chiếm 16%)  mang  đột  biến  dị  hợp  tử,  chỉ  mất  đoạn  gen  SMN1 trên 1 allele, 18% bệnh nhân không bị đột  biến mất  đoạn.  Kết  quả  này  khác  biệt  so  với  nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, theo các  nghiên cứu  tỷ  lệ đột biến mất đoạn gen SMN1  đồng hợp tử ở bệnh nhân SMA là 94%. Cuvin C  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 43 và  cộng  sự đã nghiên  cứu  trên 193 bệnh nhân  SMA và phát hiện 95,5% bệnh nhân bị đột biến  mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử(2). Năm 2008,  Song  F  và  cộng  sự  đã  phân  tích  gen  của  267  bệnh nhân SMA và phát hiện 68,5% bệnh nhân  mất đoạn đồng hợp tử exon 7 và exon 8, ngoài  ra 12,7% bệnh nhân mất đoạn đồng hợp  tử chỉ  exon 7, bên cạnh đó 12,4% bệnh nhân đột biến  mất đoạn dị hợp tử exon 7 và 8, tỷ lệ bệnh nhân  không  bị  đột  biến mất  đoạn  là  6,4%(8).  Ở Việt  Nam,  nghiên  cứu  của  Lê  Thị Hương  Lan  cho  thấy có 52/60 bệnh nhân SMA ở miền Bắc Việt  Nam bị đột biến mất đoạn gen SMN1, chiếm tỷ  lệ 81%. Như vậy kết quả phát hiện đột biến mất  đoạn exon 7 và 8 ở bệnh nhân SMA của chúng  tôi thấp hơn nhiều so với các tác giả khác. Điều  này được giải thích do số lượng mẫu nghiên cứu  của  chúng  tôi  còn  hạn  chế. Một  nguyên  nhân  khác được phân tích là do trẻ sơ sinh SMA type  1  thường  bị  suy  hô  hấp  sớm,  khó  chẩn  đoán  phân biệt với các nguyên nhân khó thở khác nên  các  chuyên  gia  lâm  sàng  thường mong muốn  chẩn  đoán xác  định  sớm  để  có hướng  điều  trị  hiệu quả cho bệnh nhân, do vậy bác sĩ chỉ định  xét nghiệm  rộng  rãi,  trong  khi  chưa  thực hiện  xét  nghiệm  đặc  hiệu  để  chẩn  đoán  phân  biệt  bệnh SMA với các bệnh lý cơ khác như sinh thiết  cơ, điện cơ đồ, Nghiên cứu của chúng tôi cho  thấy  có  4/33 bệnh nhân  (chiếm  12,1%)  chỉ mất  đoạn  exon  7 mà  không mất  exon  8,  điều  này  cũng tương tự nghiên cứu của các tác giả khác,  nhiều nghiên cứu đã khẳng định, đột biến exon  7 là yếu tố quyết định gây bệnh SMA cho dù có  kèm đột biến exon 8 hay không(5). Bên cạnh đó,  nghiên cứu chúng tôi còn phát hiện 08/50 bệnh  nhân (chiếm 16%) bị đột biến mất đoạn dị hợp  tử,  tỷ  lệ  này  tương  tự  như  nghiên  cứu  của  Song F. Các bệnh nhân này cần được giải trình  tự để xác định đột biến điểm trên allele còn lại  vì  theo các nghiên cứu, có khoảng 6‐7% bệnh  nhân SMA có mang đột biến điểm(8).  KẾT LUẬN  Nghiên cứu đã áp dụng thành công phương  pháp MLPA  trong xác  định kiểu  đột biến mất  đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân  được  chẩn  đoán  SMA  và  xác  định  tỷ  lệ mang  đột  biến mất  đoạn  ở  bệnh  nhân  SMA  tại Việt  Nam. Nghiên cứu sẽ  tiếp  tục  thực hiện  trên cỡ  mẫu lớn hơn và xây dựng quy trình giải trình tự  để  xác  định  đột  biến  điểm  ở  các  bệnh  nhân  mang kiểu gen dị hợp tử, từ đó lập nên bản đồ  đột biến gen SMN1 tại Việt Nam  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Clermont O, Burlet P, Benit P, Chanterau D, Saugier‐Veber P,  Munnich A, et al (2004). Molecular analysis of SMA patients  without homozygous SMN1 deletions using a new  strategy  for identification of SMN1 subtle mutations. Hum Mutat, 24:  417‐427.   2. Cusin  V,  Clermont  O,  Chantereau  D,  Elion  J  (2003).  Prevalence of SMN1 deletion and duplication  in carrier and  normal populations: implication for genetic counselling. JMed  Genet, 40, e39.  3. Hoàng  thị Huyền,  Đỗ  Thị  Thanh  Thủy, Nguyễn  Thị  Thu  Tâm, Nguyễn Kiến Minh, Trần Diệp Tuấn, Nguyễn Thị Băng  Sương  (2012).  Ứng  dụng  kỹ  thuật  PCR‐RFLP  (Restriction  fragment length polymorphism) xác định đột biến gen SMN1  gây bệnh thoái hóa cơ tủy. Y học Thành phố Hồ Chí Minh,  Tập 16: tr.79‐85.  4. Nguyễn Thị Băng Sương  (2013)