Đánh giá hiệu quả của dung dịch acit Formic – Formalin (AFF) trong xử lý mô tủy xương sinh thiết

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  119 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA DUNG DỊCH ACIT FORMIC – FORMALIN   (AFF) TRONG XỬ LÝ MÔ TỦY XƯƠNG SINH THIẾT  Lê Văn Hùng*, Phan Đặng Anh Thư**, Chu Lê Ngọc Hiếu*, Võ Thị Thúy Quyên*, Lê Thanh Tú*  TÓM TẮT  Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá hiệu quả của dung dịch AFF so với dung dịch acit Nitric trong quá trình  xử lý mô tủy xương sinh thiết trên  tiêu bản nhuộm H&E và nhuộm HMMD.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu thống kê mô tả 56 mẫu tủy xương sinh thiết được  gửi về Khoa Giải phẫu bệnh – BV. Truyền Máu Huyết Học.  Kết  quả:  thời gian  trả kết quả được rút ngắn 0,92 ngày  (khi nhuộm H&E), 0,7 ngày  (Nhuộm H&E +  HMMD), 0,6 ngày (nhuộm H&E + Reticulin, hóa tế bào). Tiêu bản nhuộm H&E sử dụng AFF đạt trung bình  8,53 điểm (phương sai 0.14) so với acit Nitric 7,42 điểm (Phương sai 1.2). Hai dung dịch có tác động như nhau  khi nhuộm HMMD trên các marker trên màng, nguyên sinh chất tế bào. Acit Nitric làm giảm độ nhạy (16,7%),  âm tính giả (32,3%) đối với các marker trong nhân tế bào.  Kết luận: Khử Canxi mô tủy xương sinh thiết bằng dung dịch AFF cho chất lượng tiêu bản nhuộm H&E  tốt hơn so với dung dịch acit Nitric 5%.  AFF rút ngắn thời gian trả kết quả với các xét nghiệm tủy xương sinh  thiết. Acit Nitric 5% có tác động làm biến đổi các kháng nguyên trên nhân tế bào có thể gây âm tính giả làm sai  lệch kết quả giải phẫu bệnh. Thay thế dung dịch acit Nitric 5% bằng dung dịch AFF trong quá trình khử canxi  tại Khoa Giải phẫu bệnh.   Từ khóa: Khử canxi mô tủy xương sinh thiết, Phương pháp khử canxi,   ABSTRACT  TO COMPARE THE VALUE OF FORMIC ACID – FORMALIN  (AFF) AND NITRIC ACID IN THE  PROCESS OF BONE MARROW BIOPSY  Le Van Hung, Phan Đang Anh Thu, Chu Le Ngoc Hieu, Vo Thi Thuy Quyen, Le Thanh Tu   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 119 ‐ 125  Objectives: to compare the value of AFF and nitric acid in the process of bone marrow biopsy through H&E  staining and immunohistochemistry section.  Materials and Methods: A descriptive study of 56  bone marrow biopsy at Blood transfution hematology  Hospital ‐ Ho Chi Minh city  Results: Timing of interpretation was earlier 0.92 day (for H&E staining), 0.7 day (for H&E staining and  immunohistochemistry), 0.6 day  (for H&E staining, reticulin staining and other special stains). H&E section  (using AFF) gets 8.53 scores (variance 0.14); H&E section (using Nitric acid) gets 7.42 scores (variance 1.2).   Two kinds of decalcification methods have no effect on membrane receptor. Nitric acid reduces sensitivity (16.7%)  and ratio of false negative  (32.3%) for nucleus receptor.   Conclusion: AFF  is a decalcification method which produces better quality on H&E staining than Nitric  acid 5%. Using AFF, we have earlier timing of interpretation. Nitric acid may change the nucleus receptor which  * Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Truyền Máu ‐ Huyết học Tp Hồ Chí Minh  ** Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: BS.CKI. Lê Thanh Tú. ĐT: 0918 101 472  Email: tu.lethanhdr@yahoo.com  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  120 produces false negative and wrong result. Therefore, we have used AFF as decalcification solution in the process  of bone marrow biopsy instead of Nitric acid.  Key words: decalcification of bone marrow, decalcification methods    ĐẶT VẤN ĐỀ  Giải phẫu bệnh mô  tủy xương sinh  thiết  là  xét nghiệm quan trọng trong chẩn đoán bệnh lý  huyết  học.  Tuy  nhiên,  để  thực  hiện  tốt  xét  nghiệm, mô  tủy xương sinh  thiết cần phải khử  canxi. Nếu  khử  canxi  không  tốt,  rất  khó  thực  hiện tiêu bản giải phẫu bệnh do mô  tủy xương  sinh thiết rất cứng(1,2).   Khử canxi bằng dung dịch acit Nitric 5% làm  mềm mô  rất  tốt  tuy nhiên dung dịch này  làm  giảm chất lượng tiêu bản H&E, làm thay đổi các  kháng nguyên  trong  tế bào dẫn  tới sai  lệch kết  quả nhuộm Hóa mô miễn dịch. Những tác động  xấu tới mô của dung dịch khử canxi có thể dẫn  đến chẩn đoán sai kết quả giải phẫu bệnh, dẫn  đến quá  trình chẩn đoán và điều  trị gặp nhiều  khó khăn(6).   Dung dịch AFF (formalin 10% + acit formic  5%) là một dung dịch có thể thay thế cho dung  dịch acit nitric  5%. Dung dịch AFF  làm mềm  mô  rất  tốt,  và  bảo  vệ  tốt  tế  bào,  các  dấu  ấn  kháng nguyên  trong  tế bào. Thời gian  trả kết  quả  được  rút ngắn,  đảm  bảo  kết  quả nhuộm  hóa mô miễn dịch  là chính xác, Cải thiện chất  lượng tiêu bản H&E.  Hiện nay,  tại Việt Nam  chưa  có  công  trình  nghiên cứu nào về các dung dịch khử canxi. Vì  vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu để tìm hiểu  về vấn đề này.  Mục tiêu nghiên cứu  Mục tiêu tổng quát  Đánh giá hiệu quả của dung dịch AFF so với  dung dịch acit Nitric  trong quá  trình xử  lý mô  tủy xương sinh thiết trên  tiêu bản nhuộm H&E  và nhuộm HMMD.   Mục tiêu chuyên biệt  Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm H&E  khi  sử dụng dung dịch khử  canxi Acit Nitric  hoặc AFF.  Đánh  giá  chất  lượng  tiêu  bản  nhuộm Hóa  mô  miễn  dịch  trên  mô  tủy  xương  khử  canxi  bằng dung dịch Acit Nitric hoặc AFF.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Các mẫu  tủy xương  sinh  thiết  được gửi về  Khoa Giải phẫu bệnh – BV. Truyền Máu Huyết  Học từ 01 ‐ 8 ‐ 2012 tới 31‐ 07 ‐ 2013.  Phương pháp nghiên cứu  Thống kê mô tả loạt ca.  Phương pháp chọn mẫu  Tất  cả  các mẫu  tủy  xương  sinh  thiết  được  gửi về Khoa Giải phẫu bệnh – BV. Truyền Máu  Huyết Học từ 01 ‐ 8 ‐ 2012 tới 31‐ 07 ‐ 2013.  Đường  kính  từ  1‐2  mm.  Một  đoạn  dài  khoảng > 2,5 cm.  Mẫu phải được ngâm hoàn toàn trong dung  dịch formalin buffer 10%.  Hũ  đựng mẫu phải  riêng  biệt,  ghi  rõ  ràng  thông tin bệnh nhân, giờ lấy mẫu.  Thời gian từ thời điểm lấy mẫu tới khi nhận  mẫu không quá 72 giờ.  Tiêu chuẩn loại mẫu  Mẫu ngắn không đủ chiều dài <  2,5 cm.  Mẫu không ngâm hoàn toàn trong Formalin  buffer 10%.  Mẫu không ghi rõ thông tin bệnh nhân, giờ  lấy mẫu.  Mẫu sinh thiết trước đó nhiều hơn 72 giờ.  Phân tích số liệu  Sử  dụng  phần mềm Microsoft  office  Excel  2007 ‐ T test, Z test.  Thiết kế nghiên cứu  Mẫu mô  được  cắt  làm 2 phần  có  chiều dài  tương đương nhau.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  121 Thực hiện khử canxi  Cassette với số lưu A ngâm trong Acit Nitric  5% trong    2‐ 4  giờ.    Cassette với số lưu B ngâm trong dung dịch  AFF trong  4‐6  giờ.    Xử lý mô cùng một quy trình chuẩn.  Đúc mô  thành 02 block khác nhau có đánh  số lưu theo số lưu trên cassette.   Chuẩn bị tiêu bản và nhuộm (H&E, HMMD)  theo quy trình chuẩn.  Khảo sát trên kính hiển vi quang học bởi bác  sỹ giải phẫu bệnh, nhận xét hai mô  trên và ghi  vào bảng đánh giá và thu thập dữ liệu, đánh giá  điểm theo thang điểm:  Phần tình trạng lát cắt  Bể nát: Không: 1  điểm;  Ít(< 50%): 0,5  điểm;   Nhiều(>50%): 0 điểm  Sọc:  Không:  1  điểm:  Ít  (<  50%):  0,5  điểm;   Nhiều (>50%): 0 điểm  Mô  bị  gấp: Không:  1  điểm;  Ít  (<  50%):  0,5  điểm; Nhiều(>50%): 0 điểm  Mô  bị  trôi:  Không:  1  điểm;  Ít  (<  50%):  0,5  điểm;  Nhiều(>50%): 0 điểm  Phần cấu trúc tiêu bản  Bè xương: Nguyên vẹn:  Có:  0,5  điểm;    Không: 0 điểm  Bè xương có bắt màu Eosin hay không: Có:  0,5 điểm; Không: 0 điểm   Tế bào mỡ nguyên vẹn hay không: Có: 0,5  điểm;  Không: 0 điểm  Bề  dày  tiêu  bản  “đều,  không  xếp  chồng  nhiều lớp”: 0,5 điểm,   “Không đều, xếp chồng nhiều lớp”: 0 điểm.  Phần hình thái tế bào  Xét 3 yếu tố với mỗi dòng tế bào ( HC, BC,  MTC, tế bào ác tính).  Phân biệt tốt nhân và nguyên sinh chất.  Nhận diện tốt chất nhiễm sắc.  Nhận diện tốt hạt nhân  Với mỗi dòng tế bào được 1 điểm nếu cả ba  yếu tố đều tốt.  0.5 điểm nếu có 1 yếu tố không tốt.  0 điểm nếu có 2 ‐3 yếu tố không tốt.  KẾT QUẢ  Đặc điểm của mẫu nghiên cứu  56 mẫu  tủy  xương  sinh  thiết  trong  nghiên  cứu  là các mẫu  thỏa mãn  tiêu  chuẩn  trong  các  mẫu  bệnh phẩm  được  gửi  tới  khoa Giải phẫu  bệnh BV.TMHH từ ngày 01/08/2012‐31/07/2013.  Trong 56 mẫu nghiên cứu có 56 mẫu nhuộm  H&E (100%), 17 mẫu mật độ tế bào < 20% (chiếm  30,4%), 8 mẫu có chỉ định nhuộm Hóa mô miễn  dịch  (14,3%)  với  38  dấu  ấn  kháng  nguyên  (marker)(26 marker  trên màng  tế bào và  trong  nguyên  sinh  chất  của  tế  bào,  12  marker  trên  màng nhân, nhân tế bào).  Thời gian trả kết quả  Bảng 1: Thời gian trả kết quả  AFF (Ngày) Nitric (Ngày) Thời gian rút ngắn (Ngày) H&E 2,31 3,23 0,92 H&E, Hóa mô miễn dịch 3,81 4,51 0,7 H&E, Reticulin, hóa tế bào 2,85 3,45 0,6 Tổng kết điểm tiêu bản H&E  Điểm trung bình của các mẫu khi khử canxi  bằng  dung  dịch  Acit  Nitric  là  7,42  điểm  với  phương  sai  bằng  1,2. Còn  với  dung  dịch AFF  điểm trung bình 8,53 điểm với phương sai 0,14.  Chúng  tôi kiểm định mức  tin cậy α = 0,05  để  so  sánh hai giá  trị  trung bình này. Chúng  tôi nhận thấy điểm trung bình của các tiêu bản  từ mô được khử canxi bằng dung dịch AFF cao  hơn  các  tiêu  bản  dùng  dung  dịch  acit Nitric  (với α = 0,05) (Hình 1).  Kết quả nhuộm Hóa mô miễn dịch  Trên những Dấu ấn kháng nguyên  trên màng  tế bào và trong nguyên sinh chất của tế bào  Trong 26 marker: 11 marker âm  tính với cả  hai dung dịch,  các marker  còn  lại  tỷ  lệ  tế  bào  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  122 dương  tính  với  cả  hai  dung  dịch  đều  tương  đương nhau.  Sự khác biệt về  cường  độ bắt màu,  tỉ  lệ  tế  bào bắt màu là không lớn, Cả hai dung dịch khử  canxi  đều  có  tác  động  tương  tự  nhau  với  các  Dấu ấn kháng nguyên loại này.  Hình 1: Tiêu bản nhuộm H&E khi khử canxi bằng Nitric, AFF  Trên những dấu  ấn kháng nguyên  trên màng  nhân, nhân tế bào  Trong 12 Marker trong nhân: có 6 marker cả  hai  dung  dịch  cùng  âm  tính  (50%),  2 marker  dung  dịch  acit  Nitric  làm  giảm  tỷ  lệ  tế  bào  dương tính(16,7 %), 4 marker acit Nitric gây âm  tính giả (32,3 %) (Bảng 4).  Dung dịch Acit Nitric 5% có tác động xấu tới  cường  độ  bắt màu,  tỷ  lệ  tế  bào  bắt màu Dab  chromogen  thấp  hơn  rất  nhiều  so  với mẫu  sử  dụng dung dịch AFF. Dung dịch Acit Nitric còn  gây âm tính giả. Hai miếng mô được cắt từ một  miếng  ban  đầu  của  bệnh  nhân  có  mã  số  263/2013,  nhuộm  hóa  mô  miễn  dịch  marker  Ki67. Mảnh mô xử lý bằng acit nitric cho kết quả  âm  tính còn mảnh mô xử  lý bằng AFF cho kết  quả  dương  tính  với  tỷ  lệ  tế  bào  dương  tính  khoảng 40% (Hình 2).  139\2013 (AFF) (100X)139\2013 (AFF) (10X)  139\2013 (Nitric) (100X)139\2013 (Nitric) (10X)  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  123 Hình 2 :Nhuộm Hóa mô miễn dịch các dấu ấn kháng nguyên hiện diện trong nhân tế bào.  BÀN LUẬN  So sánh chất lượng tiêu bản nhuộm H&E  Phân tích tiêu bản giải phẫu bệnh (GPB) đến  hiện  tại vẫn  rất phụ  thuộc nhiều vào kỹ năng,  kinh nghiệm của Bác sĩ GPB. Sự chuẩn hóa, cải  thiện chất lượng tiêu bản cũng là một hướng để  giảm tỷ lệ sai sót trong phân tích tiêu bản GPB.  Với 8,53  điểm  (> 7,42)  chúng  tôi nhận  thấy  tiêu bản H&E khi thay thế dung dịch khử canxi  đã cải thiện được chất lượng. Với phương sai chỉ  còn 0.14 chúng tôi nhận thấy cả tác dụng chuẩn  hóa chất lượng tiêu bản nhuộm.  Chúng  tôi  có  thể nhận  định  sử dụng dung  dịch AFF để thay thế cho dung dịch acit Nitric là  cải  thiện,  chuẩn hóa  chất  lượng  tiêu bản H&E,  góp phần hạn chế thiếu sót chuyên môn của kết  quả Giải phẫu bệnh tủy xương sinh thiết. Ý kiến  này  cũng  tương  tự như  các nghiên  cứu Emina  Emilia  Torlakovic  và  cộng  sự  (2008)  (10),  hay  Zappa J (2005) (11).   So sánh kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch  Với  các  dấu  ấn  trên màng  tế  bào,  nguyên  sinh chất (MPO, CD03, CD20, Bcl2, CD45, CD68,  ).  Các  tế bào dương  tính bắt màu rõ ràng, dễ  dàng phân biệt  tế bào dương và  tế bào không  dương, hiệu ứng nền không đáng kể.  Tỷ lệ tế bào dương tính/tế bào bình thường ở  các mô có cùng mã số tương đương nhau.  Sự khác biệt của các tiêu bản không đáng kể,   263\2013 ‐ Ki67 (Nitric) (10X)  263\2013 ‐ Ki67 (Nitric) (100X)  263\2013 ‐ Ki67 (AFF) (10X)  263\2013 ‐ Ki67 (AFF) (100X)  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  124 không  ảnh  hưởng  tới  chất  lượng  tiêu  bản  HMMD.  Chúng  tôi  nhận  định,  trong  phương  pháp nhuộm HMMD các dấu ấn kháng nguyên  trên màng,  trong  nguyên  sinh  chất  của  tế  bào  phương  pháp  khử  canxi  bằng  acit  Nitric  hay  dung dịch AFF có tác động tương tự nhau.  Với các Dấu ấn trong nhân tế bào (Ki67, Tdt,  Bcl6, cyclin D1, ).  Khi  sử  dụng  dung  dịch  AFF  các  tế  bào  dương tính bắt màu rõ ràng, dễ phân biệt tế bào  dương và tế bào không dương.   Với các mẫu sử dụng dung dịch acit Nitric  5%, không có hiệu ứng nền, các tế bào dương  tính vẫn có  thể phân biệt được với  tế bào âm  tính.   Với sự hiện diện của mẫu chứng âm, chứng  dương chúng tôi có thể kết luận được các tế bào  dương tính ở đây là các tế bào có mang dấu ấn  kháng nguyên đã nhuộm.  Căn  cứ  trên  sự  biểu  hiện  của mẫu  chứng  chúng  tôi  có  thể  kết  luận  hóa  chất,  quy  trình  nhuộm  không  có  vấn  đề. Nhưng  nếu  so  sánh  từng  cặp  riêng  biệt  từ  cùng  một  bệnh  nhân,  nhuộm  cùng một dấu  ấn kháng nguyên  thì  rõ  ràng  các mẫu  được khử  canxi bằng dung dịch  acit nitric 5% có  tỷ  lệ  tế bào dương  tính  trên  tế  bào âm tính giảm rõ rệt so với các mẫu sử dụng  dung dịch AFF.  Sử dụng dung dịch acit nitric 5% trong khử  canxi mô  tủy xương  sinh  thiết  làm biến  đổi  số  lượng  kháng  nguyên  dẫn  tới  sai  lệch  kết  quả  nhuộm Hóa mô miễn dịch,  có  thể gây  sai  lệch  kết quả giải phẫu bệnh. Kết  luận này  cũng  rất  tương đồng với các nghiên cứu của Kremer M,  Quintanilla và cộng sự(4), Machado‐Silveiro   LH  và cộng sự(5).  Thời gian trả kết quả  Qúa trình thực hiện xét nghiệm dù đơn giản,  hay phức  tạp  đều  cần  chính  xác  với  thời  gian  ngắn nhất có thể. Việc rút ngắn thời gian trả kết  quả nhưng vẫn đảm bảo mức độ chính xác của  xét nghiệm luôn được đánh giá cao.  Trong  thực  tế khi  thực hiện  thay  thế dung  dịch  acit nitric  bằng dung dịch AFF  chúng  tôi  nhận  thấy  rõ sự  rút ngắn  thời gian  trả kết quả  xét nghiệm Giải phẫu bệnh. Sử dụng acit nitric  thời gian khử canxi nhanh hơn. Nhưng trước đó  mẫu  tủy  xương  phải  được  cố  định  trong  formalin  tối  thiểu 8 giờ, còn dung dịch AFF có  tác  dụng  cố  định mô  nên mẫu  tủy  xương  sẽ  được khử canxi ngay sau khi nhận mẫu.  Với những mẫu thường quy thời gian trả kết  quả được rút ngắn trung bình 0,96 ngày làm việc  chỉ còn  trung bình 2,31 ngày (tiệm cận với  thời  gian trả kết quả các mô mềm không khử canxi ở  Việt Nam cũng như trên thế giới(9)). Với các mẫu  có  thực  hiện  nhuộm  thêm  các  phương  pháp  nhuộm khác thời gian trả kết quả cũng được rút  ngắn 0.6, 0.7 ngày làm việc.  Tóm  lại,  thay  thế dung dịch AFF cho dung  dịch acit Nitric rút ngắn thời gian trả kết quả giải  phẫu bệnh với mô tủy xương sinh thiết .  KẾT LUẬN  Khử  Canxi mô  tủy  xương  sinh  thiết  bằng  dung dịch AFF cho chất  lượng tiêu bản nhuộm  H&E tốt hơn so với dung dịch acit Nitric 5%:  Dung  dịch AFF  rút  ngắn  thời  gian  trả  kết  quả với các xét nghiệm tủy xương sinh thiết.  Khử  canxi  mô  tủy  xương  sinh  thiết  bằng  dung dịch acit Nitric 5%  có  tác  động  làm biến  đổi  các kháng nguyên  trên nhân  tế bào  có  thể  gây âm  tính giả  làm sai  lệch kết quả giải phẫu  bệnh.  Thay thế dung dịch acit Nitric 5% bằng dung  dịch AFF  trong  quá  trình  khử  canxi  tại  Khoa  Giải phẫu bệnh.   TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Brown  RS,  Edwards  J,  Bartlett  JW et  al  (2002). Routine  acid  decalcification of bone marrow  samples  can preserve DNA  for  FISH  and  CGH  studies  in metastatic  prostate  cancer. J  Histochem Cytochem. 50(1):113‐5.  2. Fend F, Bock O, Kremer M   et al. (2005) Ancillary techniques  in  bone marrow  pathology: molecular  diagnostics  on  bone  marrow trephine biopsies. Virchows Arch.447(6):909‐19.  3. Gala JL, Chenut F, Hong KB et al (1997). A panel of antibodies  for  the  immunostaining  of  Bouinʹs  fixed  bone  marrow  trephine biopsies. J Clin Pathol. 50521–50524.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học  125 4. Kremer  M,  Quintanilla,  Martinez  L,  Nahrig  J. et  al  (2005).. Immunohistochemistry in bone marrow pathology: a  useful  adjunct  for  morphologic  diagnosis. Virchows  Arch. 447(6):920‐937.   5. Machado‐Silveiro    LH,  Gonzalez‐Lopez  S,  Gonzalez  ‐  Rodriguez MP (2004). Decalcification of  root canal dentin by  citric acid,  EDTA  and  sodium  citrate.  Int Endod J. 37(6):365‐ 369.  6. Mawhinney WH, Richardson E, Malcolm AJ  (1984). Control  of rapid nitric acid decalcification. J Clin Patholl. 37:1409‐1413.   7. McCluggage  WG,  Roddy  S,  Whiteside  C   et  al  (1995). Immunohistochemical  staining  of  plastic  embedded  bone  marrow  trephine  biopsy  specimens  after  microwave  heating. J Clin Pathol. 48(9):840‐4.  8. Milan L, Trachtenberg MC  (1981). Ultrasonic decalcification  of bone. Am J Surg Pathol. 5(6):573‐579.  9. Naresh KN,  Lampert  I,  Hasserjian R. et al  (2006).  Optimal  processing  of  bone  marrow  trephine  biopsy:  the  Hammersmith Protocol. J Clin Pathol. 59(9):903‐11.  10. Torlakovic  EE,  Naresh  KN,  Brunning  RD  (2008).  Bone  Marrow  Immunohistochemistry.  American  Society  for  Clinical pathology.  11. Zappa  J, Cieslik‐Bielecka A, Adwent M, Cieslik T,  Sabat D  (2005).  Comparison  of  different  decalcification methods  to  hard  teeth  tissues morphological  analysis. Dent Med Probl  ;  42:21‐26.  Ngày nhận bài báo: Ngày 15 tháng 8 năm 2013  Ngày phản biện: ngày 29 tháng 8 năm 2013  Ngày bài báo được đăng: