Đánh giá tồn lưu ác tính ở bệnh nhân bạch cầu cấp sau điều trị tấn công bằng dấu ấn miễn dịch tế bào

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 314 ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU ÁC TÍNH Ở BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP SAU ĐIỀU TRỊ TẤN CÔNG BẰNG DẤU ẤN MIỄN DỊCH TẾ BÀO Nguyễn Phương Liên*, Nguyễn Tấn Bỉnh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Theo dõi mức độ tồn lưu ác tính ở các bệnh nhân mắc các bệnh bạch cầu cấp sau hóa trị thông qua việc xác định sự tồn tại những kiểu hình DAMD bất thường trên tế bào non ác tính. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả thực nghiệm lâm sàng tiến cứu. Sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang và phương pháp nhuộm 4-5 màu, phân tích bằng hệ thống máy FACS Canto II trên phần mềm Diva. Tiến hành nghiên cứu trên những bệnh nhân được chẩn đoán bạch cầu cấp và điều trị theo các phác đồ tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học từ tháng 4/2010 đến tháng 11/2010. Kết quả: Dựa vào 4 mức độ TBTLAT, đa số bệnh nhân BCC dòng lymphô nằm trong nhóm nguy cơ trung bình (≥0,1% - <1% tế bào tủy, 48,8%) và nguy cơ thấp (≥0,01% - <0,1% tế bào tủy, 41,9%), có 3 bệnh nhân tái phát sớm sau 4-6 tháng theo dõi; đa số bệnh nhân BCC dòng tủy thuộc nhóm nguy cơ trung bình (68,8%). 2 kiểu hình DAMD bất thường gặp nhiều nhất là sự xuất hiện KN khác dòng và các KN không đồng bộ. Kết luận: Kỹ thuật DAMD giúp phân biệt rõ tế bào non ác tính và tế bào non bình thường trong tủy xương đang tái hoạt hóa sau hóa trị liệu mà bằng hình thái chúng ta không thể phân biệt được. Việc đánh giá mật độ TBTLAT trên bệnh nhân BCC bằng kỹ thuật DAMD cho chúng ta tiên lượng sớm kết quả điều trị dựa vào 4 mức độ nguy cơ. Từ khóa: kiểu hình DAMD bất thường, tế bào tồn lưu ác tính, bệnh BCC, kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang, tế bào bạch cầu non. Viết tắt: DAMD: dấu ấn miễn dịch, BCC: bạch cầu cấp, TBTLAT: tế bào tồn lưu ác tính, KN: kháng nguyên. ABSTRACT ABBERANT IMMUNOPHENOTYPES FOR OBSERVING MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LEUKEMIAS Nguyen Phuong Lien, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 314 - 318 Objective: 4 different risk categories of minimal residual disease (MRD) in acute leukemias mainly rely on the immunophenotypic aberrancies or leukemia-associated phenotypes (LAP) observed at diagnosing and following time point. Method: Cohort - descriptive research. From April to December 2010, we used many fluorescence monoclonal antibodies and 4-5 immunostaining combinations to analyse 59 samples after induction treatment on FACS Canto II with Diva software at Blood Transfusion and Hematology Hospital. Results: Based on 4 MRD levels, of 43 patients with B-ALL: 48,8% at the low risk (≥0,01%–<0,1% cells), 41,9% at the intermediate risk (≥0,1%–<1% cells) and 3 pateints relapsed after 4 follow-up months; of 16 pateints with AML: 68.8% at intermediate risk. Common LAPs are cross-lineage and asynchronous antigen expressions. * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS.BS. Nguyễn Phương Liên, ĐT: 0903.333.994, Email: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 315 Conclusion: Flow cytometry can distinguish the malignant from regeneration of the normal blasts in bone marrow samples which morphology can’t detect. Using immunophenotypical investigation, 4 levels of MRD after induction therapy provide early prognostic assessment. Keywords: minimal residual disease, leukemia-associated phenotypes, acute leukemia, immunostaining combinations, MRD levels. ABR: MRD: minimal residual disease, ALL: acute lymphononic leukemia, AML: acute myeloid leukemia, LAP: leukemia-associated phenotypes ĐẶT VẤN ĐỀ Đáp ứng sớm với điều trị là một yếu tố tiên lượng quan trọng đối với bệnh BCC. Phân tích hình thái học của tủy xương sau điều trị rất cần thiết để xác định nhóm bệnh nhân không đạt lui bệnh hoàn toàn và có tiên lượng rất xấu. Tuy nhiên, trong số những người đang lui bệnh hoàn toàn vẫn có một tần suất tái phát cao không thể tiên lượng bằng hình thái, vì thế cần phải có một phương pháp khác cho phép phát hiện TBTLAT ở mức độ thấp hơn. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đánh giá sớm mẫu tủy sau điều trị bằng kỹ thuật DAMDTB có thể xác định 4 mức độ TBTLAT(4,11). Chúng tôi sử dụng bộ những kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang đang được sử dụng tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, thành phố Hồ Chí Minh để theo dõi TBTLAT trên mẫu tủy đầu tiên lui bệnh hoàn toàn sau giai đoạn tấn công của bệnh nhân mắc bệnh BCC dòng lymphô B và BCC dòng tủy với mục đích đánh giá và tiên lượng sớm kết quả điều trị. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả kết quả lâm sàng tiến cứu. Dân số nghiên cứu Những bệnh nhân mắc bệnh BCC tại bệnh viện TMHH, TP. HCM. Tiêu chuẩn chọn bệnh Là bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh BCC dòng lymphô B hoặc BCC dòng tủy, có ghi nhận những kiểu hình DAMD bất thường lúc chẩn đoán, đã lui bệnh hoàn toàn sau điều trị tấn công, chấp nhận thực hiện xét nghiệm DAMD lần 2 để theo dõi TBTLAT. Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân mắc các bệnh khác: bạch cầu mạn dòng lymphô hoặc dòng tủy, các bệnh tăng sinh dòng lymphô hoặc lymphoma, các bệnh tăng sinh tủy hoặc loạn sinh tủy, các bệnh nhân BCC không lui bệnh hoàn toàn sau điều trị tấn công, hoặc bệnh nhân không đồng ý tham gia xét nghiệm. Kỹ thuật Sử dụng những mẫu tủy hút được giữ chống đông (bằng ACD, Heparin hoặc EDTA) đem nhuộm với các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang khoảng 10 phút, ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối. Sau đó, loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch amonium chloride và cố định mẫu bằng paraformaldehyde 1% trước khi được rửa sạch. Một số trường hợp cần thiết, mẫu tủy tiếp tục được làm tăng tính thấm bề mặt để nhuộm với các kháng thể đơn dòng trong nhân hoặc trong tế bào chất (như TdT, cyCD79a, MPO, cyCD3). Cuối cùng mẫu tủy sẽ được thu thập bằng hệ thống máy FACS CantoII và được phân tích trên phần mềm FACSDiva verson 2.1 của hãng Becton Dickinson (Mỹ). Các mẫu tủy trước và sau điều trị đều được nhuộm với cùng một bộ thuốc thử (gồm 21 CD kết hợp 4-5 màu huỳnh quang): CD19-FITC, CD19-PE, CD22-PE, CD20-Per.CP, CD34-APC, CD34-FITC, TdT- FITC, CD10-PE, CD45-Per.CP, CD45-PE.Cy5, CD3-FITC, CD5-FITC, CD7-FITC, HLA.DR- FITC, CD14-FITC, CD4-PE, CD33-PE, CD13- PE, CD13-APC, CD2-PE, CD56-APC, CD8- APC, CD15-APC, CD36-APC, CD117-PE. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 316 KẾT QUẢ Bảng 1: Đặc điểm của các mẫu tủy Thông số B-ALL AML TỔNG Số lượng bệnh nhân (n) 43 16 59 Số lượng nam/ số lượng nữ 19/24 9/7 28/31 Tuổi trung bình (dãy) <15 tuổi >15 tuổi 5,65 ±5,35 (1 – 29) 41 2 30,19 ±18,52 (2 – 62) 5 11 12,31 ± 15,18 (1 – 62) 46 13 Tỉ lệ trung bình tế bào non sau tấn công lui bệnh (%) 4,3 ± 2,98 (0,8 – 12) 4,26 ± 1,7 (2,4 – 8,4) 4,3 ± 2,67 (0,8 – 12) Tỉ lệ trung bình tế bào non với LAP+ lúc chẩn đoán (%) 42,06 ± 14,78 (12 – 89) 31,,64 ± 10,45 (10 – 47) 39,23 ± 14,43 (10 – 89) Tỉ lệ trung bình tế bào non với LAP+ sau tấn công (%) 0,174 ± 0,195 (0,01 – 0,779) 0,22 ± 0,25 (0,006 – 0,970) 0,186 ± 0,209 (0,001 – 0,970) Thời gian theo dõi bệnh nhân (tháng) 3,9 ±1,55 (1 – 6) 3,56 ± 1,63 (1 – 6) 3,81 ± 1,57 (1 – 6) Tỉ lệ sống không bệnh sau 4 tháng(%) 88,89% (n=27) 100% (n=10) 91,89% (n=37) Số bệnh nhân tái phát 3 0 3 Số bệnh nhân tử vong 0 0 0 Tỉ lệ trung bình tế bào lymphô B tái hoạt hóa (%) 2,08 ± 1,77 (0,043 – 9,07) 1,634 ± 0,763 (0,68 – 3,95) 1,95 ± 1,567 (0,043 – 9,07) Tỉ lệ trung bình tế bào dòng tủy tái hoạt hoá (%) 2,12 ± 1,55 (0,345 – 7,44) 2,419 ± 1,28 (0,8 – 5,838) 2,2 ± 1,48 (0,345 – 7,44) Ghi chú: B-ALL: BCC dòng lymphô B, AML: BCC dòng tủy, LAP+: dương tính với kiểu hình DAMD bất thường liên quan đến bệnh BCC. Bảng 2: Các chiến lược phân tích TBTLAT: Chiến lược xác định các kiểu hình DAMD bất thường(1, 7) B-ALL (n=43) AML (n=16) Sự xuất hiện KN Khác dòng 40 13 Sự xuất hiện các KN không đồng bộ 29 14 Mất một KN đặc hiệu của dòng 0 0 Sự tăng cao bất thường của một KN 0 0 Chiến lược CD45– Æ yếu 2 0 Ghi chú: B-ALL: BCC dòng lymphô B, AML; BCC dòng tủy, KN: kháng nguyên. Bảng 3: Phân nhóm yếu tố nguy cơ theo tỉ lệ TBTLAT: Nhóm nguy cơ(4,11) B-ALL n=43 (%) AML n=16 (%) < 0,01% 4 (9,3) 2 (12,5) ≥0,01% - <0,1% 21 (48,8) 3 (18,8) ≥0,1% - <1% 18 (41,9) 11 (68,8) ≥1% 0 0 0 0 Bảng 4: Mô tả đặc điểm 3 ca tái phát Đặc điểm Ca 1 Ca 2 Ca 3 Thời gian tái phát (tháng) 4 5 6 Tuổi 7 1 9 Tỉ lệ blast dương tính với LAP lúc chẩn đoán (%) 38 42 23 Tỉ lệ blast dương tính với LAP sau tấn công (%) 0,05 0,17 0,35 Tỉ lệ tế bào non sau điều trị (%) 0,8 6,5 5 Tỉ lệ trung bình tế bào lymphô B tái hoạt hóa (%) 0,45 3,9 2,215 Tỉ lệ trung bình tế bào dòng tủy tái hoạt hoá (%) 0,3 2,43 2,435 BÀN LUẬN BCC dòng lymphô B Trong nghiên cứu của chúng tôi có tổng cộng 43 bệnh nhân BCC dòng lympho B, 95,35% là trẻ em dưới 15 tuổi, và tuổi trung bình là 5,5 tuổi, được điều trị bằng phác đồ FRALLE 2000 và còn lại là 2 bệnh nhân (5,65%) từ 15-29 tuổi, được điều trị bằng phác đồ CALGB. Sau giai đoạn tấn công, tất cả đều lui bệnh bằng hình thái học (số lượng tế bào non <5% tế bào tủy)(3). Kết quả này phù hợp với y văn, bệnh BCC dòng lympho B thường gặp ở trẻ em hơn người lớn(5). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 317 Bằng kỹ thuật DAMD, chúng tôi ghi nhận tỉ lệ trung bình tế bào non trong tủy xương sau tấn công lui bệnh là 4,3 ± 2,98% tế bào tủy (từ 0,8 – 12%). Trong đó, tỉ lệ trung bình tế bào non dương tính với những kiểu hình DAMD bất thường, chính là mật độ TBTLAT, là 0,01 ± 0,779% (từ 0,174 – 0,195%). Như vậy không phải toàn bộ tế bào non trong tủy xương sau hoá trị liệu đều là những tế bào ác tính còn sót lại, đa phần chúng là các tế bào non bình thường tăng sinh vì sự tái hoạt hóa của tủy sau dùng các thuốc chống ung thư (6). Chúng tôi ghi nhận có hai quần thể tế bào non tái sinh được thấy nhiều nhất thuộc dòng lympho B (2,08 ± 1,77%, từ 0,043 – 9,07% tế bào tủy) và dòng tủy (2,12 ± 1,55%, từ 0,345 – 7,44%). Bằng hình thái học chúng ta không thể đánh giá được tỉ lệ chính xác của các quần thể tế bào non như trên. Lập lại các chiến lược xác định các kiểu hình DAMD bất thường vào lúc chẩn đoán, chúng tôi nhận thấy những TBTLAT quan sát được sau điều trị lui bệnh thường mang các kiểu hình liên quan đến sự xuất hiện các KN khác dòng (93%) hoặc sự xuất hiện các KN không đồng bộ (67,44%), hoàn toàn không ghi nhận được các kiểu hình liên quan đến chiến lược tăng cao bất thường của một KN hay mất đi một KN đặc hiệu của dòng. Việc sử dụng kết hợp 4-5 màu giúp dễ dàng nhận định các kiểu hình DAMD bất thường liên quan đến sự xuất hiện của các KN khác dòng và KN không đồng bộ(8,9). Dựa vào 4 mức độ nguy cơ, chúng tôi ghi nhận 48,8% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp (≥0,01% - <0,1%) và 41,9% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ trung bình (≥0,1% - <1%), chỉ có 9,3% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ rất thấp (<0,01%) tương đương với TLTBAT âm tính (4). Các nhà khoa học trên thế giới cũng đã chứng minh rằng vào giai đoạn lui bệnh hoàn toàn dựa vào hình thái học, bệnh nhân BCC vẫn còn tồn lưu khoảng 1010 tế bào ác tính trong tủy xương (3). Trong 27 bệnh nhân đã trải qua ít nhất 4 tháng theo dõi, có 3 bệnh nhân bị tái phát sớm gồm: 2 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ trung bình, và 1 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp, không phụ thuộc các yếu tố: tuổi, giới, tỉ lệ tế bào non trong tủy sau tấn công, tỉ lệ tế bào tái hoạt hóa, BCC dòng tủy Số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu đánh giá TBTLAT của nhóm BCC dòng tủy gồm 16 bệnh nhân, trong đó 68,75% là bệnh nhân > 15 tuổi, tuổi trung bình là 30,2, đã đạt được lui bệnh hoàn toàn về hình thái sau điều trị bằng phác đồ tấn công 7 ngày Daunorubicin và 3 ngày cytosine arabinoside (ARA-C). Tương tự các thống kê khác, nhóm bệnh BCC dòng tủy thường gặp ở những bệnh nhân lớn tuổi hơn(10). Bằng kỹ thuật DAMD, chúng tôi xác định được tỉ lệ trung bình tế bào non trong tủy xương sau tấn công lui bệnh là 4,26 ± 1,7% (2,4 – 8,4%); tỉ lệ trung bình TBTLAT sau hóa trị là 0,22 ± 0,25% (0,006 – 0,970%). Hầu hết TBTLAT quan sát được sau điều trị lui bệnh thường mang các kiểu hình liên quan đến sự xuất hiện các KN khác dòng (81,25%) hoặc sự xuất hiện các KN không đồng bộ (87,5%), hoàn toàn không ghi nhận được các kiểu hình liên quan đến chiến lược tăng cao bất thường của một KN hay mất đi một KN đặc hiệu của dòng. Kết quả này cũng được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu khác(2). Sau điều trị tấn công, ở bệnh nhân BCC dòng tủy cũng nhận thấy tình trạng tái hoạt hóa của tế bào non dòng lympho B (1,634 ± 0,763% tế bào tủy) và dòng tủy (2,419 ± 1,28%). Điều này khiến việc phân biệt tế bào non ác tính và tế bào non bình thường trở nên phức tạp, đòi hỏi phải bổ sung những kết hợp 4-5 màu huỳnh quang(1). Dựa vào 4 mức độ nguy cơ, chúng tôi ghi nhận gần 70% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ trung bình (≥0,1% - <1%), 18% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp (≥0,01% - <0,1%) và 12% bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ rất thấp (<0,01%). Tuy nhiên, không ghi nhận hiện tượng tái phát sớm (trong đó có 10 bệnh nhân đã được theo dõi trên 4 tháng). Chúng tôi không thể đưa ra so sánh hay phân tích sâu hơn do số lượng mẫu chưa nhiều và thời gian theo dõi ngắn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 318 KẾT LUẬN Kỹ thuật DAMD cho phép phân tích khách quan tình hình tủy tăng sinh sau hoá trị, đồng thời là công cụ giúp phân biệt rõ tế bào non ác tính và tế bào non bình thường của tủy tái hoạt hóa (mà bằng hình thái học chúng ta không thể phân biệt được). Việc đánh giá mật độ TBTLAT dựa vào DAMD giúp tiên lượng sớm kết quả điều trị của các bệnh nhân BCC theo 4 nhóm nguy cơ. Anh hưởng của các mức độ nguy cơ thấy rõ nhất là trong nhóm bệnh BCC dòng lymphô B. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu lớn hơn với thời gian đủ dài để khẳng định chắc chắn giá trị của việc đánh giá TBTLAT bằng DAMD. Qua nghiên cứu này chúng tôi cũng thống nhất với các tác giả nước ngoài rằng trong tương lai cần bổ sung thêm tiêu chuẩn lui bệnh bằng DAMD trong định nghĩa về lui bệnh hoàn toàn. Để chọn được những kiểu DAMD bất thường có độ đặc hiệu cao, nhóm nghiên cứu đã thực hiện kiểm tra đối chứng trên một số mẫu máu và mẫu tủy bình thường. Do đó, các kiểu hình DAMD bất thường sử dụng trong nghiên này là những kiểu hình với độ nhạy cao, có thể giúp tìm ra những tế bào bạch cầu ác tính còn sót lại ở những mẫu tủy sau điều trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Mawali A, Gillis D, Hissaria P, Lewis I. (2008) Incidence, sensitivity, and specificity of leukemia-associated phenotypes in acute myeloid leukemia using specific five-color multiparameter flow cytometry. Am J Clin Pathol; 129 (6), pp.934-945. 2. Al-Mawali A, Gillis D, Lewis I. (2009) The role of multiparameter flow cytometry for detection of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Am J Clin Pathol; 131 (1), pp.16-26. 3. Campana D, Coustan-Smith E. (1999) Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry; 38 (4), pp.139-152. 4. Coustan-Smith E, Sancho J, Behm FG, Hancock ML, Razzouk BI, Ribeiro RC, Rivera GK, Rubnitz JE, Sandlund JT, Pui CH, Campana D. (2002) Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood; 100 (1), pp.52-58. 5. Dongen Jv, Szczepánski T, Adriaansen H. (2002) Immunophenobiology of leukemia. Leukemia, 7th edition; Saunders, Philadelphia, USA, pp.85-130. 6. 6ochem Ev, Wiegers Y, Beemd Rvd, Hhlen K, Dongen Jv, Hooijkaas H. (2000) Regeneration pattern of precursor-B-cells in bone marrow of acute lymphoblastic leukemia patients depends on the type of preceding chemotherapy. Leukemia; 14 (4), pp.688-695. 7. Lucio P, Gaipa G, van Lochem EG, van Wering ER, Porwit- MacDonald A, Faria T, Bjorklund E, Biondi A, van den Beemd MW, Baars E, Vidriales B, Parreira A, van Dongen JJ, San Miguel JF, Orfao A. (2001) BIOMED-I concerted action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B- ALL with standardized triple-stainings. BIOMED-1 Concerted Action Investigation of Minimal Residual Disease in Acute Leukemia: International Standardization and Clinical Evaluation. Leukemia; 15 (8), pp.1185-1192. 8. Lucio P, Parreira A, van den Beemd MW, van Lochem EG, van Wering ER, Baars E, Porwit-MacDonald A, Bjorklund E, Gaipa G, Biondi A, Orfao A, Janossy G, van Dongen JJ, San Miguel JF. (1999) Flow cytometric analysis of normal B cell differentiation: a frame of reference for the detection of minimal residual disease in precursor-B-ALL. Leukemia; 13 (3), pp.419-427. 9. Nagler A, Condiotti R, Rabinowitz R, Schlesinger M, Nguyen M, Terstappen LW. (1999) Detection of minimal residual disease (MRD) after bone marrow transplantation (BMT) by multi-parameter flow cytometry (MPFC). Med Oncol; 16 (3), pp.177-187. 10. Rohatiner A, Lister TA. (2002) Acute myeloid leukemia. Leukemia, 7th edition; Saunder, Pennnsylvania, USA, pp.485- 518. 11. San Miguel JF, Vidriales MB, Lopez-Berges C, Diaz- Mediavilla J, Gutierrez N, Canizo C, Ramos F, Calmuntia MJ, Perez JJ, Gonzalez M, Orfao A. (2001) Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood; 98 (6), pp.1746-1751.