Khảo sát ảnh hưởng của các chất tăng thấm đối với sự thấm clonidin hydrochlorid qua da chuột

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 223 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT TĂNG THẤM ĐỐI VỚI SỰ THẤM CLONIDIN HYDROCHLORID QUA DA CHUỘT Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Nguyễn Thiện Hải*, Lê Hậu*, Nguyễn Thị Yến Trang* TÓM TẮT Mục tiêu: Dạng thuốc dán hấp thu qua da với dược chất clonidin đã được phát triển với tên thương mại là Catapres, tuy nhiên cho đến nay ở trong nước chưa có nghiên cứu cơ bản nào về sự hấp thu thuốc qua da nói chung và clonidin nói riêng. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm sàng lọc tìm chất làm tăng tính thấm và tăng hấp thu clonidin hydroclorid qua da nhằm góp phần xây dựng công thức bào chế dạng thuốc dán hấp thu qua da với clonidin. Phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện với 13 chất thuộc các 6 nhóm hóa học.Thiết bị khảo sát tính thấm là tế bào khuếch tán Franz kiểu đứng, sử dụng màng khuếch tán là da chuột cống trắng giống Sprague- Dawley, trọng lượng 230 ± 20g,, nhanh nhẹn, khỏe mạnh, không bị bệnh ở da. Kết quả: Kết quả khảo sát cho thấy đối với clonidin hydroclorid, nhóm gây tăng thấm mạnh nhất là nhóm alcol, trong đó 3-methyl-1-butanol làm tăng tính thấm của clonidin hydroclorid qua da chuột cao nhất với tốc độ thấm (Flux) đạt 41,0674 µg/cm2/giờ và tiềm thời (lag time) tương đối ngắn với Tlag là 1,9358 giờ. Kết luận: Đề nghị sử dụng 3-methyl-1–butanol làm chất tăng thấm trong công thức bào chế thuốc dán hấp thu qua da với clonidin hydroclorid. Từ khóa: chất tăng thấm, tốc độ thấm qua da, clonidin, tế bào khuếch tán. ABSTRACT STUDYING THE INFLUENCE OF SKIN PERMEATION ENHANCERS ON PERMEATION CAPACITY OF CLONIDIN HYDROCHLORID THROUGH RAT SKIN Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Nguyen thien Hai, Le Hau, Nguyen Thi Yen Trang * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 223 - 228 Objectives: Transdermal patches containing clonidine hydrochloride have been launched into global market under trade name Catapres–TTS (Transdermal Therapeutic System) for a long time. However, until now in Viet nam there has been no basic study on permeation enhancers as well as on transdermal patches containing clonidine hydrochloride. Our aim target was to find a suitable skin permeation enhancer for formulating a transdermal patch containing clonidine hydrochloride for treatment of hypertention diseases. Method: Using Franz diffusion cell to survey permeation capacity through rat skin of clonidine. Results: Among 13 studied chemicals belonging to 6 chemical groups, we found that alcohol group was a the most potential skin permeation enhancer group for clonidine hydrochloride and that 3-methyl-1-butanol could enhance the permeation of clonidine hydrochloride through rat skin in the highest ratio with permeation speed (Flux) was 41.0674 µg/cm2/h and lag time (Tlag) was 1.9358 hour. Conclusion: We recommended using 3-methyl-1-butanol in formulating transdermal patches containing clonidine hydrochloride. Keywords. Skin permeation enhancer, flux, Franz diffusion cell, clonidine. *Bộ môn Công nghiệp Dược – Khoa Dược – ĐH Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: ThS.Trần Quốc Thanh ĐT:0903389214 Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 224 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc dán điều trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin để điều trị tăng huyết áp. Trong những năm qua đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được ưu điểm của dạng thuốc này so với clonidin dạng uống như giảm những tác dụng phụ gây khô miệng, buồn nôn hay rối loạn chức năng sinh dục. Khả năng giảm tác dụng phụ và cho tác dụng kéo dài trong 7 ngày giúp bệnh nhân dễ tuân thủ và tiện dụng hơn so với dạng thuốc uống. Do những ưu điểm và tính hiệu quả trong điều trị cùng với triển vọng phát triển của dạng thuốc này, dạng thuốc dán hấp thu qua da chứa hoạt chất clonidin nên được nghiên cứu ứng dụng và phát triển tại Việt Nam. Vấn đề cơ bản và khó khăn nhất trong nghiên cứu và phát triển dạng thuốc dán hấp thu qua da là khắc phục được sự cản trở hấp thu và làm tăng tính thấm của hoạt chất qua da. Một trong những phương pháp làm tăng khả năng thấm và hấp thu của thuốc là lựa chọn và ứng dụng những chất tăng thấm hoá học(4,5). Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của các chất tăng thấm đối với clonidin hydroclorid qua da chuột” được tiến hành với mục tiêu: “Khảo sát các chất tăng thấm tác động lên khả năng thấm của clonidin hydroclorid để tìm ra nhóm chất tăng thấm hiệu quả nhất làm tăng lưu lượng hấp thu của clonidin hydroclorid qua da chuột”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Các nguyên liệu hoá chất dùng trong thử nghiệm đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết phân tích phù hợp với mục đích sử dụng Dược chất: Clonidin hydroclorid Các chất tăng thấm: Methyl sulfoxid (99,9%), 1– dodecanol (98%), dầu khoáng, poly ethylen glycol 400, isopropyl myristat (98%), 1,2 – propanediol (99%), 3- methyl-1 –butanol (98%), 1- decanol (99%), 1- hexanol, 1- octanol (98%), transcutol P (diethylen glycol monoethyl ether), lauroglycol (Propylene glycol monolaurat, type II), acid oleic (90%). Các hóa chất và dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết phân tích phù hợp với mục đích sử dụng Dụng cụ: thiết bị đo độ khuếch tán kiểu tế bào Franz, thiết bị phân tích HPLC. Phương pháp nghiên cứu 1. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng clonidin hydroclorid bằng phương pháp HPLC trong dịch thử tính thấm theo các quy định phù hợp(2). 2. Xác định nồng độ bão hoà của clonidin hydroclorid trong dung môi thử tính thấm 3.Thử nghiệm bằng tế bào Franz với màng khuếch tán là da chuột cống trắng được xử lý phù hợp(Error! Reference source not found.): Khoang cho: 500 μl dung dịch hoạt chất bão hoà. Khoang nhận: chứa dung dịch đệm phosphat pH 7,4, nhiệt độ 37 ± 2 0C. Thanh khuấy từ: khuấy trộn liên tục, 600 vòng/phút. Màng da: Chuột cống trắng giống Sprague- Dawley, trọng lượng 230 ± 20g, nhanh nhẹn, khỏe mạnh, không bị bệnh ở da. Quy trình xử lý da chuột: Chuột được giết bằng ether. Cạo sạch lông ở phần lưng không làm tổn hại lớp sừng. Cắt rời phần da lưng, loại bỏ lớp mỡ và máu dưới da. tránh làm thủng hoặc tổn thương đến da, dùng giấy thấm ép để loại hết máu. Đặt da lên hộp petri lớp sừng hướng lên trên. Có thể bảo quản miếng da trong tủ lạnh ở ngăn đá không quá 7 ngày trước khi sử dụng. Lấy mẫu: 200 μl dung dịch trong khoang nhận trong 24 giờ ở các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24 giờ. Bổ sung 200 μl dung dịch đệm pH 7,4 sau mỗi lần lấy mẫu. 4.Tính lượng thuốc thấm qua da, tốc độ thấm và xác định tiềm thời. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 225 Hàm lượng hoạt chất thấm qua da chuột theo thời gian: S V x Cm = m: lượng clonidin hydroclorid thấm qua da chuột theo thời gian (µg/cm2); C: nồng độ clonidin hydroclorid tính từ phương trình đường chuẩn dựa vào chiều cao đỉnh; V: thể tích khoang nhận (15,5 ml); S: diện tích khuếch tán qua da từ khoang cho vào dung dịch trong khoang nhận (3,14 cm2). Từ lượng clonidin hydroclorid thấm qua da chuột theo thời gian, vẽ được đồ thị phóng thích dược chất theo thời gian như hình 1: Tốc độ thấm qua da chuột của hoạt chất được tính theo công thức: SS S dt dm A J ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ = 1 Js (flux): Tốc độ thấm qua da của hoạt chất (µg/cm2/giờ) A: diện tích bề mặt khuếch tán của da (cm2) (dm/dt)ss: lượng clonidin hydroclorid thấm qua da theo thời gian (µg/giờ) Tốc độ thấm của hoạt chất Js được ngoại suy từ đồ thị là giá trị slope của phương trình đường thẳng tuyến tính biểu hiện cho tốc độ thấm hằng định theo thời gian. Tiềm thời (lag time) cũng được suy ra từ đồ thị là giao điểm của đường thẳng tuyến tính với trục hoành(3). Hình 1. Đồ thị biểu diễn lượng hoạt chất thấm qua da theo thời gian. H àm lư ợ ng h oạ t c hấ t t hấ m q ua d a (µ g/ cm 2 ) Thời gian (giờ) Tiềm thời (lag) time) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 226 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp định lượng clonidin hydroclorid trong môi trường thử tính thấm Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: Phenomenex–Luna 5u C18 (2) 100 A (150 x 4,6 mm, 5μm). Pha động: hòa 1,21 g natri 1-heptanesulfonat trong 550 ml nước, thêm 450 ml methanol và 1 ml acid phosphoric, chỉnh pH 3 bằng NaOH 1N. Tốc độ dòng: 1 ml/ phút. Bước sóng phát hiện: 220 nm. Thể tích tiêm mẫu: 100 μl. Nhiệt độ cột: 250C. Thẩm định qui trình định lượng clonidin hydroclorid trong môi trường thử tính thấm Tính tương thích hệ thống Các thông số sắc ký gồm hệ số bất đối As = 1,184, hệ số phân giải Rs = 1,973, số đĩa lý thuyết N = 11361,5 và các thông số sắc ký có RSD < 2% nên đạt tính tương thích hệ thống. Độ đặc hiệu Đỉnh của clonidin hydroclorid trong mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu chạy trong 24 giờ tách rõ so với các đỉnh khác và có thời gian lưu khoảng 8,248 phút, mẫu trắng không có đỉnh tại vị trí này Tính tuyến tính Chiều cao đỉnh và nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính trong khoảng nồng độ 5 -100 mcg/ml Độ đúng Tỷ lệ phục hồi khi thêm 80%, 100% và 120% đều nằm trong khoảng 98-102%, vậy độ đúng đạt. Độ chính xác Đo 6 mẫu cùng nồng độ là 30 μg/ml. RSD = 1,525% < 2%. Kết quả khảo sát khả năng thấm của clonidine hydrochlorid qua da chuột Kết quả khảo sát tính thấm được trình bày trong bảng 1 và 2. Bảng 1. Hàm lượng clonidin thấm qua da chuột (µg/cm2) từ dung dịch chất tăng thấm nhóm DMSO, dầu khoáng, acid và ester, ether- alcol Hàm lượng clonidin thấm qua da chuột (µg/cm2) từ dung dịch các chất tăng thấm Giờ DMSO Dầu khoáng Acid oleic Isopropyl myristat Lauroglycol 90 Trancutol P 0 0 0 0 0 0 0 2 0,0392 0 0 0,2074 0,1683 0 4 13,8299 0 0 0,4255 0,7083 0 6 26,8724 0,4264 0 0,4377 2,2037 0,4338 8 68,2220 1,9395 0,5637 0,7394 4,0659 0,8012 10 91,2657 2,4663 0,7682 1,4438 4,3083 1,1488 12 102,4507 2,6955 1,8773 2,9850 7,3748 2,7244 16 132,3834 3,4490 4,0630 6,9785 10,7500 3,5728 20 193,8318 6,7547 7,7380 11,1232 12,5583 5,7533 24 301,9148 11,9078 16,2465 14,3910 17,5274 7,7034 Flux (µg/cm2/giờ) 10,6648 1,0573 0,6865 0,9470 0,8696 0,4458 Tiềm thời (giờ) 2,5102 13,1384 9,3353 8,6168 4,6261 7,1957 Bảng 2. Hàm lượng clonidin thấm qua da chuột (µg/cm2) từ dung dịch chất tăng thấm nhóm alcol và polyalcol Hàm lượng clonidin thấm qua da chuột (µg/cm2) từ dung dịch các chất tăng thấm Giờ Propanediol Metyl butanol Hexanol Octanol Decanol Dodecanol PEG 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 6,5034 0,8187 0,7225 0,8550 0,3335 0 4 0,3589 78,3686 32,6138 8,3427 7,4922 3,4412 0 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 227 Hàm lượng clonidin thấm qua da chuột (µg/cm2) từ dung dịch các chất tăng thấm Giờ Propanediol Metyl butanol Hexanol Octanol Decanol Dodecanol PEG 6 0,6471 170,7729 46,4142 28,8855 13,9611 7,6479 0 8 0,7800 196,0595 88,4905 34,2495 18,7039 11,1059 0,4393 10 1,8995 230,7420 123,4500 51,8037 30,0886 18,1886 1,3755 12 3,9639 250,4449 149,9065 64,4227 36,2574 22,9992 1,8067 16 6,2552 283,2040 164,9276 66,2472 41,5293 25,3931 3,7247 20 6,9584 314,5352 161,3625 67,6163 42,7371 29,4441 4,9316 24 8,8054 368,8970 190,1721 72,6497 45,6603 30,9038 6,7037 Flux (µg/cm2/giờ) 0,7015 41,0674 15,1432 6,4893 3,5649 2,3004 0,3860 Tiềm thời (giờ) 6,9666 1,9358 2,1966 2,2353 2,0419 2,4635 6,8396 Hình 2. Đồ thị tương quan giữa hàm lượng clonidin thấm qua da chuột theo thời gian với nhóm alcol, alcol béo và glycol. Bảng 3. Tương quan giữa nồng độ bão hòa, tốc độ thấm (Flux) và tiềm thời của clonidine hydrochlorid với các chất tăng thấm khác nhau Chất tăng thấm Nồng độ bão hoà (mg/ml) Flux (µg/cm2/h) Tlag (giờ) Nhóm chức Propanediol 90,917 1,0537 13,1384 Poly alcol Methyl butanol 6,570 41,0674 1,9358 Mono alcol Hexanol 2,627 15,1432 2,1966 Mono alcol Octanol 1,156 6,4893 2,2353 Mono alcol Decanol 0,644 3,5649 2,0419 Mono alcol Dodecanol 0,301 2,3004 2,4635 Mono alcol PEG 7,081 0,3860 6,8396 Poly alcol IPM 0,095 0,9470 8,6168 Ester LG 90 0,357 0,8696 4,6261 Ester – alcol Acid oleic 0,043 0,6865 9,3353 Acid Transcutol P 4,935 0,4458 7,1957 Ehter – alcol DMSO 79,026 10,6648 2,5102 Sulfoxide Dầu khoáng - 1,0573 13,1384 Hydrocarbon Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 228 BÀN LUẬN - Nhóm chất thân nước như nhóm alcol, nhóm sufoxid có khả năng tăng thấm clonidin hydroclorid qua da chuột tốt hơn nhóm chất thân dầu như nhóm hydrocarbon, nhóm ester, nhóm ether và nhóm acid béo. - Nhóm alcol cho tác động tăng thấm cao và giảm dần từ Methyl butanol, Hexanol, Octanol, Decanol Dodecanol, Propanediol, PEG. Cao nhất với 3-methyl-1- butanol đạt giá trị flux cao nhất là 41,0674 μg/cm2/giờ. - DMSO là một dung môi hoà tan tốt cả các hoạt chất thân dầu và thân nước, vừa là chất tăng thấm tốt với nhiều cơ chế tác động lên lớp sừng như gây phá vỡ tạm thời cấu trúc nội bào, phân tách lipid, làm biến đổi keratin KẾT LUẬN 1. Đã xây dựng, đánh giá và thẩm định qui trình định lượng clonidin hydroclorid trong môi trường thử tính thấm 2. Đã khảo sát ảnh hưởng của 6 nhóm chất tăng thấm gồm 13 chất đối với khả năng thấm clonidin hydroclorid qua da chuột. Nhóm gây tăng thấm mạnh nhất là nhóm alcol, trong đó 3 - methyl - 1 - butanol làm tăng tính thấm của clonidin hydroclorid qua da chuột trên 1cm2 /1 giờ là cao nhất với Flux là 41,0674 μg/cm2/giờ ĐỀ NGHỊ Sử dụng chất 3- methyl -1 - butanol trong công thức bào chế thuốc dán hấp thu qua da với clonidin. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Moser K, Kriwet K, Naik A, Kaila YN., RH. Guy (2001). Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro, Eur. J. Pharm. Biopharm., 52:103-112. 2. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Y Học, tr. 160 – 171. 3. Nguyen Thien Hai, Chi Sang-Cheol (2005), “Investigation of the effect of vehicles on skin permeation of Benztropine”, Proceeding of Pharma Indochina IV Conference, pp. 363-368. 4. Pathan I.B., Setty C.M. (2009), Chemical penetration enhancers for transdermal drug delivery systems, Trop. J. Pharm. Res., 173-179. 5. Williams C.A., Barry W.B. (2004). Penetration enhancers, Adv. Drug Del. Rev., 56: 603- 618.