Khảo sát bất thường nhiễm sắc thể trong bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho B ở trẻ em bằng kỹ thuật nhuộm băng G

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  179 KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ   TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO B Ở TRẺ EM   BẰNG KỸ THUẬT NHUỘM BĂNG G   Nguyễn Trần Nam An*, Nguyễn Hồng Xuyến*, Phan Cao Thanh Thảo*, Trần Thị Trúc Thanh*,   Phan Thị Xinh**  TÓM TẮT   Mục tiêu: Bằng kỹ thuật nhuộm băng G khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể (NST) trong bệnh bạch cầu  cấp dòng lympho B (BCCDL‐B) trẻ em tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM.   Đối tượng và phương pháp: Từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013 có 64 bệnh nhân (BN) BCCDL‐B được  cấy NST sử dụng mẫu tủy hoặc mẫu máu đủ tiêu chuẩn cấy. Mẫu được cấy trong môi trường RPMI‐1640 có bổ  sung FBS, kháng sinh và PHA‐LCM. Tế bào được thu hoạch, chuẩn bị tiêu bản, xử lý với trypsin và nhuộm  Giemsa.  Kết quả: Trong 64 BN được cấy NST có 47 BN được cấy thành công chiếm tỷ lệ 73,4%. Kết quả phân tích  NST đồ cho thấy 36,2% BN có bất thường NST thuộc nhóm tiên lượng tốt và 63,8% BN thuộc nhóm tiên lượng  không tốt. Trong nhóm tiên lượng tốt, bất thường liên quan đến 12p chiếm tỷ lệ 23,4%, bất thường số lượng  NST > 50 NST chiếm 12,8%. Có 10 BN có bộ NST bình thường chiếm 21,3%. Các chuyển vị t(1;19)(q23;p13),  t(9;22)(q34;q11), t(4;11)(q21;q23) được phát hiện với  tỷ  lệ  tương ứng  là 6,4%, 4,2%, 2,1%  thuộc nhóm  tiên  lượng không tốt.  Kết luận: Kỹ thuật nhuộm băng G cho phép phát hiện hầu hết các bất thường NST gồm bất thường về cấu  trúc và số lượng trong bệnh BCCDL‐B ở trẻ em. Mặc dù số mẫu chưa lớn nhưng kết quả của nghiên cứu góp  thêm dữ liệu giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho BN BCCDL‐B trẻ em.  Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lympho B, bất thường nhiễm sắc thể, nhuộm băng G  ABSTRACT  DETECTION OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN CHILDHOOD B‐CELL ACUTE  LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA USING G‐BANDING   Nguyen Tran Nam An, Nguyen Hong Xuyen, Phan Cao Thanh Thao, Tran Thi Truc Thanh,   Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 179 ‐ 183  Objective: To detect chromosomal abnormalities  in childhood B‐cell acute  lymphoblastic  leukemia  (B‐ALL) using G banding  technique  in Blood Transfusion and Hematology Hospital  in Ho Chi Minh  City.  Subjects  and Methods:  From  January  2012  to May  2013,  64  eligible  bone marrow  or  blood  samples were cultured in RPMI‐1640 medium supplemented with FBS, antibiotics and PHA‐LCM. Cells  were harvested, prepared specimens, treated with trypsin and stained with giemsa.   Results:  Among  64  patients,  47  patients  (73.4%)  were  successfully  harvested  with  enough  metaphase cells to analyze. The results of karyotype analysis showed that 36.2% patients with abnormal  chromosomes belong to the standard risk group and 63.8% of patients belong to the high risk group. In the  * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. Hồ Chí Minh  ** Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 0932728115   Email: phanthixinh@yahoo.com   Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  180 standard  risk  group,  12p  abnormalities  and  hyperdiploidy  >  50  chromosomes were  23.4%  and  12.8%,  respectively. 10 patients were  found with normal chromosomes,  occupying 21.3%. The  translocation of  t(1;19)(q23;p13), t(9;22)(q34;q11), t(4;11)(q21;q23) were detected in 6.4 %, 4.2%, 2.1% respectively, which  belong to the high risk group.   Conclusions: G banding technique allows to detecting most structural and numerical chromosomal  abnormalities in children B‐ALL. Although amount of samples are not large, the results of this study can  help clinical doctor in selecting suitable regimen for treatment of B‐ALL patients.  Keywords: B‐cell acute lymphoblastic leukemia, chromosomal abnormality, G‐banding.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bạch  cầu  cấp  dòng  lympho  (BCCDL)  đặc  trưng bởi  sự gia  tăng  quá mức  của  các  tế  bào  lympho  chưa  trưởng  thành,  lấn  át  các  tế  bào  bình  thường  trong  tủy  xương  gây  nhiễm  trùng,  thiếu  máu,  xuất  huyết.  BCCDL  có  nhiều  thể khác nhau và  có  thể  được phân  loại  dựa vào hình  thái  tế bào, dấu  ấn miễn dịch và  các kỹ thuật di truyền phân tử  (5). Bệnh BCCDL  chiếm  76%  các bệnh bạch  cầu  ở  trẻ  em  (5),  tuy  nhiên cũng gặp ở người trưởng thành và chiếm  khoảng 20% bệnh bạch cầu cấp ở người  lớn  (5).  Ngoài  những  nghiên  cứu  về  lâm  sàng,  những  hiểu biết ngày càng sâu sắc về bệnh  trong  lĩnh  vực di truyền học phân tử, các bất thường NST  và gen cũng đóng một vai trò quan trọng trong  việc chẩn đoán, phân nhóm tiên lượng, giúp lựa  chọn phác đồ điều trị thích hợp và theo dõi điều  trị  đối  với BCCDL  (2,9,10). Hơn  75%  trường  hợp  BCCDL được đánh giá tiên lượng và phân nhóm  điều  trị dựa  trên bất  thường về  số  lượng NST,  các  kiểu  tái  sắp  xếp NST  chuyên  biệt  hay  các  thay đổi di truyền ở mức độ phân tử (5).  Ngày  nay,  những  kỹ  thuật  di  truyền  học  phân  tử  như NST  đồ,  lai  tại  chỗ  phát  huỳnh  quang  (Fluorescent  in  situ hybridization: FISH)  và  RT‐PCR  (reverse  transcriptase‐polymerase  chain reaction) đã  trở  thành những xét nghiệm  thường  quy  trong  chẩn  đoán  các  bất  thường  NST và gen cho bệnh nhân  (BN) ung  thư máu  nói chung và bệnh BCCDL nói riêng. Mặc dù, kỹ  thuật FISH và RT‐PCR có độ nhạy cao và cho kết  quả nhanh nhưng  không  khảo  sát  được  tất  cả  các bất thường vì chỉ sử dụng đoạn dò đặc hiệu.  Với  kỹ  thuật NST  đồ,  bộ  nhiễm  sắc  thể  được  phân tích về số lượng, hình dạng, cấu trúc và các  chuyển vị nhiễm sắc thể nên có thể phát hiện bất  thường về số  lượng NST, bất thường phức tạp.  Có  nhiều  phương  pháp  nhuộm  băng  nhưng  băng G được ưu tiên sử dụng tại các phòng xét  nghiệm  NST  Tại  Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết học (BVTMHH), kỹ thuật nhuộm băng G  được  sử  dụng  như  là  xét  nghiệm  thường  quy  giúp  nhận  diện  hầu  hết  các  kiểu  bất  thường  NST. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng kết  các bất thường NST để thấy được các dạng bất  thường  NST  thường  gặp  trong  BCCDL  tại  BVTMHH.  ĐỐI  TƯỢNG ‐ PHƯƠNG  PHÁP  NGHIÊN  CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Sáu mươi  bốn BN  trẻ  em  (≤  15  tuổi)  được  chẩn đoán BCCDL‐B dựa vào tủy đồ và dấu ấn  miễn  dịch  có  làm  xét  nghiệm  NST  đồ  tại  BVTMHH TP.HCM  từ  tháng 1/2012  đến  tháng  5/2013.  Chỉ  có  những  BN  được  chẩn  đoán  BCCDL nguyên phát mới được phân tích trong  nghiên cứu này.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Nghiên cứu mô tả loạt ca  Phương pháp tiến hành  Một  đến  2 mL  tủy  xương hoặc  5 mL máu  ngoại biên (nếu tế bào non hiện diện trong máu  ≥  10%)  trong  chống  đông  heparin  300UI  được  chuyển  đến  phòng  xét  nghiệm  trong  vòng  1  tiếng đồng hồ. Đếm và cấy 2 x 107 tế bào trong  10 mL môi trường RPMI‐1640 chứa 10% FBS, 1%  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  181 kháng  sinh,  bổ  sung  300  μL  PHA‐LCM  (Phytohemagglutinin  –  lymphocyte  ‐  conditioned medium). Mẫu được nuôi cấy ở  nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 1  ‐ 2 ngày đối với  mẫu tủy và 2 ‐ 3 ngày đối với mẫu máu. Sau khi  ngừng phân bào bằng dung dịch demecolcine,  màng  tế  bào  được  phá  hủy  bằng  dung  dịch  nhược trương KCl 0,075M và cố định với dung  dịch Carnoy (Methanol: Acid Acetic = 1: 3). Cặn  tế bào được rửa sạch và chuẩn bị tiêu bản NST.  Tiêu  bản  sau  khi  nướng  ở  600C  trong  4  tiếng  đồng  hồ,  được  xử  lý  với  trypsin  0,1%  trong  khoảng  thời gian  thích hợp, nhuộm Giemsa và  đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.  Đối  với mỗi BN, trung bình 20 tế bào được phân tích  sử dụng phần mềm Ikaros (MetaSystems, Đức).  Trong trường hợp cấy không mọc, mẫu sẽ được  cấy  lại khoảng 3 – 4 ngày sau khi cấy  lần 1 dù  BN đã được điều trị bằng corticosteroid.  KẾT QUẢ   Từ tháng 1/2012 đến tháng 5/2013 có 64 BN  BCCDL‐B  trẻ  em  được  cấy NST và  47 BN  cấy  thành công chiếm tỷ lệ 73,4%. Kết quả phân tích  NST  đồ  cho  thấy  trong 47 BN  có 17 BN  thuộc  nhóm  tiên  lượng  tốt chiếm 36,2%, 30 BN  thuộc  nhóm tiên không tốt chiếm tỷ lệ 63,8%. Kết quả  phân nhóm tiên lượng của BN được trình bày ở  Bảng 1.  Bảng 1: Bảng phân nhóm tiên lượng của BN  BCCDL‐B trẻ em.  Nhóm tiên lượng Kiểu bất thường Số BN (%) % theo nhóm tiên lượng Tốt >50 NST 6 (12,8) 36,2 Bất thường liên quan đến 12p 11 (23,4) Không tốt 47 – 50 NST 7 (14,9) 63,8 NST bình thường 10 (21,3) t(9;22)(q34;q11) 2 (4,2) t(4;11)(q21;q23) 1 (2,1) t(1;19)(q23;p13) 3 (6,4) Các bất thường khác 7 (14,9) Tổng 47 (100) 100 Những  bất  thường  thuộc nhóm  tiên  lượng  tốt gồm bất  thường số  lượng và bất  thường về  cấu trúc thường gặp liên quan đến 12p. Bộ NST  đa  bội  >50 NST  gặp  trong  6  BN  chiếm  12,8%  (Hình 1).   Hình 1:  60,XXY,+4,+5,+6,+7,+11,+13,+13,+17,+18,+21,+21,+ 21,+22  Bất  thường  liên quan đến 12p gặp  trong 11  BN,  chiếm 23,4%  (Bảng 2),  trong  đó  chuyển vị  t(12;21)(p13;q22) gặp trong 9 BN (19,1%) gồm 4  BN  có  t(12;21)(p13;q22)  đơn  độc  (Hình  2)  và  5  BN  có  t(12;21)(p13;q22)  đi kèm với bất  thường  khác như +21, add(4)(q35). Ngoài ra, có 1 BN có  der(12)t(12;21)(p11;q11) và 1 BN có del(12)(p13)  (Bảng 2).  Bảng 2: BN BCCDL‐B trẻ em có bất thường liên  quan đến 12p  STT Nam Nữ Bất thường NST 1 2010 46,XX,der(12)t(12;21)(p11;q11)[11]/ 46,XX[4] 2 2009 46,XX,der(12)t(12;21)(p13;q22)[5]/ 47,XX,der(12)t(12;21)(p13;q22),+21[3]/ 46,XX[3] 3 2008 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[10]/ 46,XX[2] 4 2008 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[5] 5 2009 46,XX,t(12;21)(p13;q22)[6] 6 2008 46,XY,add(4)(q35),t(12;21)(p13;q22)[7]/46,XY,t(12;21)(p13;q22)/46,XY[6] 7 2001 46,XY,del(12)(p13)[8]/46,XY[8] 8 2010 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[10]/46,XY[4] 9 2010 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[10] 10 2008 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[3]/ 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[12] 11 2008 47,XY,t(12;21)(p13;q22),+21[5]/ 46,XY,t(12;21)(p13;q22)[10]/46,XY[5] Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  182 Hình 2: Chuyển vị t(12;21)(p13;q22)   Trong 30 BN thuộc nhóm tiên lượng  không tốt, có 7 BN có bộ NST 47 – 50 NST  (14,9%),  10  BN  có  bộ  NST  bình  thường  (21,3%),  6  BN  có  chuyển  vị  NST  gồm  t(1;19)(q23;p13),  t(9;22)(q34;q11)  (Hình  3),  t(4;11)(q21;q23) với tỷ lệ tương ứng là 6,4%,  4,2%, 2,1%, và 7 BN có bất thường NST khác  (Bảng  1).  Chuyển  vị  t(1;19)(q23;p13)  có  2  dạng cân bằng (Hình 4) và không cân bằng.  Các bất thường NST khác gặp trong nghiên  cứu  này  là  del(X)(q26),  +der(7)t(X;7),  t(3;7)(q27;q32), del(2)(p22), del(8)(q21).  Hình 3: Chuyển vị t(9;22)(q34;q11)   Hình 4: Chuyển vị t(1;19)(q23;p13) cân bằng  BÀN LUẬN  Kết quả  cấy mọc nghiên  cứu  trong  chúng  tôi là 73,4% cho thấy việc cấy NST thành công  trong  BCCDL‐B  là  khó  khăn,  phù  hợp  với  nhận định của một số nghiên cứu khác (4). Thời  gian  từ  lúc  lấy mẫu  cho  đến  lúc  cấy  là  quan  trọng, nếu để hơn 2 tiếng đồng hồ thường cấy  thất bại hoặc  sai  lệch kết quả do dòng  tế bào  bình thường mọc nhiều hơn  (8). Một số trường  hợp  khác  ngay  lúc  chẩn  đoán  số  lượng  bạch  cầu tăng cao cấy không mọc nhưng cấy lại sau  3 ‐ 5 ngày điều trị với corticosteroid làm giảm  số lượng bạch cầu thì cấy thành công, cho thấy  số  lượng  bạch  cầu  cao  cũng  là  một  yếu  tố  không thuận lợi cho việc cấy NST.  Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh  rằng bất thường NST lúc chẩn đoán là một trong  những yếu  tố phân nhóm nguy  cơ,  có ý nghĩa  quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị  BCCDL‐B ở trẻ em (6,9). Kết quả phân tích trên 47  BN cho  thấy bất  thường NST  thuộc nhóm  tiên  lượng  tốt và không  tốt  tương  ứng  là  36,2% và  63,8% (Bảng 1). Chuyển vị t(12;21)(p13;q22) gặp  trong 9 BN (19,1%) và là chuyển vị NST thường  gặp  nhất  trong  BCCDL‐B.  Tỷ  lệ  của  t(12;21)  trong  nghiên  cứu  này  tương  đồng  với  các  nghiên cứu khác trên thế giới (10,1). Đa bội với số  lượng NST  >  50  chiếm  12,8%  thấp  hơn  so  với báo  cáo  của Mrózek K và  các nghiên  cứu  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  183 khác  (5,3) có thể do cỡ mẫu trong nghiên cứu  còn nhỏ. Chuyển  vị  t(1;19),  t(4;11)  và  t(9;22)  chiếm tỷ lệ lần lượt là 6,4%, 2,1%, 4,2% tương  đồng với các nghiên cứu khác  trên  thế giới  (5,3).  Các  bất  thường  NST  thuộc  nhóm  tiên  lượng  không  tốt  còn  liên  quan  đến  nhiều NST  khác  nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ phát  hiện thêm bất thường của NST X, 2, 3, 7, 8, còn  các bất thường khác như t(2;8), t(8;14), t(8;22) và  del(9p)  chưa  tìm  thấy.  Đây  là  số  liệu  ban  đầu  trên mẫu nghiên cứu nhỏ, cần nghiên cứu  trên  cỡ mẫu lớn hơn để có một dữ liệu đầy đủ về bất  thường NST trên BCCDL‐B tại Việt Nam.  KẾT LUẬN  Bước  đầu  thực  hiện  nuôi  cấy  trên  64  BN  BCCDL‐B  cho  thấy  tỉ  lệ  cấy NST  thành  công  trong BCCDL không cao, chỉ chiếm 73,4%. Tuy  nhiên, kết quả phân tích NST đồ nhận diện được  các bất  thường NST đa dạng như đa bội,  thiểu  bội, bất thường cấu trúc NST khác ngoài 4 kiểu  chuyển  vị NST  thường  gặp  nên  thuận  lợi  cho  việc phân nhóm tiên  lượng. Cần có nghiên cứu  trên cỡ mẫu lớn hơn, thời gian khảo sát dài hơn  kết hợp với các kỹ thuật di truyền phân tử khác  để có dữ liệu đầy đủ hơn về bất thường NST của  BN BCCDL‐B trẻ em tại BVTMHH TP.HCM.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Carroll  ƯL,  Bhojwani  D,  et  al  (2003).  Pediatric  Acute  Lymphoblastic Leukemia. ASH Education Book; 1: 102‐131.  2. Hilden JM, Dinndorf PA, Meerbaum SO, et al (2006). Analysis  of  prognostic  factors  of  acute  lymphoblastic  leukemia  in  infants:  report  on CCG  1953  from  the Childrenʹs Oncology  Group. Blood; 108:441‐451.  3. Mrozek  K,  Heerema  NA,  Bloomfield  CD,  et  al  (2004).  Cytogenetics in acute leukemia. Blood; 18: 115‐136.  4. Padhi S, Sarangi R, et al (2011). Cytogenetic profile of pediatric  acute lymphoblastic leukemia (ALL): analysis of 31 cases with  review of literature. Caryologia; 64(1): 33‐41.  5. Pui C‐H, et al (1998). Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J  Med; 339(9):605‐615.  6. Pui  C‐H,  Relling  MV,  et  al  (2004).  Acute  lymphoblastic  leukemia. N Engl J Med;350:1535‐1548.  7. Raimondi SC (1993). Current status of cytogenetic research in  childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood; 81: 2237‐2251  8. Rooney  DE  (2000).  Human  Cytogenetics:  malignancy  and  acquired abnormalities. Oxford University Press; 1:1‐26.  9. Schultz1 KR, Pullen DJ, et al (2007). Risk‐and response‐based  classification  of  childhood  B‐precursor  acute  lymphoblastic  leukemia:  a  combined  analysis  of prognostic markers  from  the Pediatric Oncology Group (POG) and Childrenʹs Cancer  Group (CCG). Blood; 109:3926‐3935.  10. Teitell MA and Pandolfi PP, et al (2009). Molecular Genetics of  Acute Lymphoblastic Leukemia Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis;  4:175–198.  Ngày nhận bài báo:     15 tháng 8 năm 2013  Ngày phản biện:      04 tháng 9 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013