Khảo sát các đột biến trên gen mecA và mecI ở một số chủng staphylococcus aureus đề kháng methicillin

Mở đầu: Không phải tất cả các chủng Staphylococcus aureus mang gen mecA đều có kiểu hình đề kháng methicillin. Sự hiện diện của gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA đã được tìm thấy ở một số chủng. Các đột biến trên hai gen này có thể ảnh hưởng kiểu hình đề kháng, do đó cần phải được xác định để giải thích rõ hơn về cơ chế đề kháng của vi khuẩn. Mục tiêu: Giải trình tự và xác định đột biến trên gen mecA, mecI của một số chủng MRSA phân lập trên bệnh nhân tại bệnh viện đa khoa Sóc Trăng. Phương pháp: Phân lập và định danh các chủng S.aureus bằng phương pháp thường quy tại bệnh viện. Thử nghiệm kháng sinh đồ với oxacillin để xác định kiểu hình đề kháng. Chiết tách ADN, thực hiện PCR với các cặp mồi mecA và mecI. Giải trình tự sản phẩm PCR. Dùng phần mềm ClusterX 2.0.1. để phát hiện các đột biến bằng cách so sánh với trình tự chủng chuẩn. Kết quả: Phân lập được 33 chủng S. aureus trong đó có 10 chủng có kiểu hình đề kháng và PCR dương tính với mecA, 23 chủng còn lại nhạy cảm với oxacillin và PCR âm tính với mecA. Trong số 10 chủng mang gen mecA, xác định được 4 chủng mang gen mecI. Xác định được đột biến trên gen mecA ở 4 chủng (7, 16, 28 và 30). Chỉ xác định đột biến trên gen mecI ở 1 chủng (28). Các dạng đột biến này đều là đột biến điểm và chưa thấy được công bố trước đây ngoại trừ dạng đột biến trên gen mecI. Kết luận: Tất cả chủng MRSA có kiểu hình đề kháng đều mang gen mecA. Các đột biến xác định được trên gen mecA và mecI không làm thay đổi kiểu hình.

pdf5 trang | Chia sẻ: thanhuyen291 | Ngày: 14/06/2022 | Lượt xem: 322 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khảo sát các đột biến trên gen mecA và mecI ở một số chủng staphylococcus aureus đề kháng methicillin, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 170 KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN MECA VÀ MECI Ở MỘT SỐ CHỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐỀ KHÁNG METHICILLIN Bùi Minh Giao Long*, Mạnh Trường Lâm**, Vũ Thanh Thảo***, Trần Cát Đông*** TÓM TẮT Mở đầu: Không phải tất cả các chủng Staphylococcus aureus mang gen mecA đều có kiểu hình đề kháng methicillin. Sự hiện diện của gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA đã được tìm thấy ở một số chủng. Các đột biến trên hai gen này có thể ảnh hưởng kiểu hình đề kháng, do đó cần phải được xác định để giải thích rõ hơn về cơ chế đề kháng của vi khuẩn. Mục tiêu: Giải trình tự và xác định đột biến trên gen mecA, mecI của một số chủng MRSA phân lập trên bệnh nhân tại bệnh viện đa khoa Sóc Trăng. Phương pháp: Phân lập và định danh các chủng S.aureus bằng phương pháp thường quy tại bệnh viện. Thử nghiệm kháng sinh đồ với oxacillin để xác định kiểu hình đề kháng. Chiết tách ADN, thực hiện PCR với các cặp mồi mecA và mecI. Giải trình tự sản phẩm PCR. Dùng phần mềm ClusterX 2.0.1. để phát hiện các đột biến bằng cách so sánh với trình tự chủng chuẩn. Kết quả: Phân lập được 33 chủng S. aureus trong đó có 10 chủng có kiểu hình đề kháng và PCR dương tính với mecA, 23 chủng còn lại nhạy cảm với oxacillin và PCR âm tính với mecA. Trong số 10 chủng mang gen mecA, xác định được 4 chủng mang gen mecI. Xác định được đột biến trên gen mecA ở 4 chủng (7, 16, 28 và 30). Chỉ xác định đột biến trên gen mecI ở 1 chủng (28). Các dạng đột biến này đều là đột biến điểm và chưa thấy được công bố trước đây ngoại trừ dạng đột biến trên gen mecI. Kết luận: Tất cả chủng MRSA có kiểu hình đề kháng đều mang gen mecA. Các đột biến xác định được trên gen mecA và mecI không làm thay đổi kiểu hình. Từ khóa: MRSA, mecA, mecI, đột biến, đề kháng kháng sinh. ABSTRACT MUTATIONS IN mecA AND mecI GENES OF SOME MRSA STRAINS (METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS) Bui Minh Giao Long, Manh Truong Lam, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 170 - 174 Background: Not all mecA-positive Staphylococcus aureus strains have phenotypic resistance to methicillin. The presence of mecI coding for mecA repressor was found in some strains. Mutations in both genes may affect phenotypes, therefore to understand more thoroughly about the resistance mechanism these mutations need to be identified. Objectives: Sequencing and identifying mutations in mecA and mecI genes of some MRSA strains isolated from patients in Hospital of Soctrang Province. Methods: S. aureus strains were isolated and identified by using the routine methods of hospital. Oxacillin disk agar diffusion was used to screen for strains having the resistance phenotype. DNA of theses strains was extracted and used as templates for PCR. The PCR products were sequenced. The ClusterX 2.0.1.1 software was used to detect genetic mutation by aligning the sequences of examined genes with those of the control strain. * Bộ môn Dược Lâm Sàng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM ** Khoa Dược, Bệnh viện Đa khoa Sóc Trăng *** Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 171 Results: 33 strains of S. aureus were isolated and identified, among them, there were 10 strains having both phenotypic and genotypic resistance. The 23 others were sensitive to oxacillin and mecA negative as well. Mutations in mecA were found in 4 strains (7, 16, 28 and 30) only one mecI mutation was identified in one strain (28). These mutations are point mutations and have not been reported in previously except the mecI mutation. Conclusion: In this study, all MRSA phenotypic strains possessed mecA gene. Mutations in mecA and mecI genes detected did not change the phenotype. Keywords: MRSA, mecA , mecI, mutation, antibiotic resistant. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (MRSA) là nguyên nhân phổ biến trong nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng tỉ lệ tử vong vì chúng đề kháng với hầu hết kháng sinh họ β-lactam(11). Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm β-lactam gồm khả năng sản xuất β- lactamase của vi khuẩn và sự hiện diện của gen mecA trong đó cơ chế đề kháng do gen được xem là quan trọng hơn và được nghiên cứu bởi một số tác giả(7,10). Gen mecA mã hóa protein gắn kết penicillin 2a (PPB2a) có ái lực giảm với kháng sinh nhóm β-lactam(4,8,9). Gen này nằm trên nhiễm sắc thể nhưng được điều hòa bởi các gen trên plasmid và thuộc transposon Tn-4291 nên gen này có thể được truyền dễ dàng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Điều này giải thích sự lan truyền nhanh chóng của các chủng MRSA(10). Phương pháp xác định MRSA dựa trên sự hiện diện của gen mecA hiện được xem chính xác hơn các phương pháp xác định kiểu hình khác(3). Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng mang gen mecA nhưng không có kiểu hình đề kháng methicillin. Sự hiện diện của gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA đã được tìm thấy ở một số chủng(5,6,10,12). Các đột biến trên hai gen này có thể làm thay đổi hoặc không thay đổi kiểu hình đề kháng do đó cần phải được xác định để giải thích rõ hơn về cơ chế đề kháng của vi khuẩn. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Hóa chất: đĩa kháng sinh (Nam Khoa), TSA, MHA, MSA, BA, agarose, ethidium bromide (Merck), PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs), kit tinh chế sản phẩm PCR (Wizard SV gel & PCR clean-up system) (Promega). Trang thiết bị: máy UV-vis Genquant 1300, tủ ấm Shellab, máy li tâm Sigma 3 – 18, máy luân nhiệt Techne TC - 3000 G, bộ điện di ngang Bio- rad Mini-sub cell GT. Phân lập và định danh Các chủng Staphylococcus aureus được phân lập từ mẫu bệnh phẩm trong thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng 08/2010 tại Bệnh viện Sóc Trăng và định danh bằng phương pháp thường quy theo quy trình của bệnh viện như cấy lên các môi trường phân biệt và chọn lọc như BA (Blood Agar), MSA (Mannitol Salt Agar) và thực hiện phản ứng coagulase. Kháng sinh đồ: Thử nghiệm kháng sinh đồ bằng phương pháp Kirby – Bauer(9), với đĩa giấy kháng sinh của Công ty Nam Khoa. Hiện nay, methicillin ít được sử dụng do độc tính cao nên một kháng sinh cùng nhóm là oxacillin được thay thế để điều trị và dùng cho kháng sinh đồ(1). Hai chủng dùng làm chứng gồm S. aureus ATCC 29213 (nhạy methicillin) và S. aureus ATCC 4330 (MRSA). Đo đường kính vùng ức chế bằng thước kẹp. Bất cứ sự tăng trưởng nào quan sát được bên trong vùng ức chế đều chứng tỏ rằng vi khuẩn kháng kháng sinh. Kết quả được biện giải theo M100-S18 của CLSI. (1). Chiết tách ADN và thực hiện PCR Chiết tách ADN theo qui trình chiết tách chung cho vi khuẩn Gram dương của Cutting S. và cs(2). Sau đó, thực hiện PCR khuếch đại đoạn gen với mồi đặc hiệu được trình bày trong Bảng 1. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 172 Bảng 1. Các cặp mồi của phản ứng PCR gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) Tên mồi Trình tự mồi tự thiết kế ( 5’ đến 3’) Kích thước sản phẩm khuếch đại MecA-F2 AGT TGT AGT TGT GGG GTT TGG MecA-R2 CGT ATT TTT TAT TAC CGT TTCTC 2000 bp mecI-F AAT GGC GAA AAA GCA CAA CA mecI-R GAC TTG ATT GTT TCC TCT GTT 481 bp Phản ứng PCR thể tích 25 µl có thành phần gồm 0,5 µl ADN trộn với 2,5 µl đệm PCR 10 X, 0,25 µl dNTP 25 mM, 0,25 µl mồi xuôi và mồi ngược với nồng độ 100 µM và 0,2 µl Taq ADN polymerase 5 U/ µl và nước khử khoáng vừa đủ. Thực hiện chương trình PCR gồm 95°C trong 1 phút, 45°C trong 45 giây, 72 °C trong 2,5 phút, lập lại 35 chu kì. Sản phẩm khuếch đại được chạy điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 100V trong 15 phút, đọc kết quả bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide và xem dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Sau đó, tinh chế sản phẩm PCR bằng cột Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Giải trình tự và phân tích kết quả Sản phẩm PCR của các gen mecA, mecI hiện diện ở các chủng S. aureus khảo sát được giải trình tự bởi dịch vụ của công ty Macrogen (Hàn Quốc) với các mồi tương ứng (xem Bảng 1). Các kết quả gửi về được lắp ráp thành đoạn gen hoàn chỉnh bằng chương trình SeqMan trong bộ phần mềm Lasergene v 7.1. Đột biến được xác định thực hiện bằng cách so sánh đoạn gen mecA và mecI với các gen tương ứng của chủng S.aureus N315 bằng phần mềm ClustalX 2.0.11. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Có 10 chủng trong số 33 chủng S. aureus có mang gen đề kháng mecA gồm chủng 7, 9, 10, 16, 19, 20, 25, 28, 30 và 32. Các chủng này được tiếp tục thực hiện PCR để xác định gen mecI. Kết quả cho thấy chỉ có 4/10 chủng mang gen mecI. Nghiên cứu của Timothy M.A Weller cho thấy tỉ lệ mang gen mecI cao hơn với 48% (12). Chủng đối chứng là S. aureus ATCC 43300 (MRSA) cho kết quả dương tính với gen mecA và âm tính với gen mecI. Kết quả được trình bày trong Bảng 2. Bảng2. Kết quả xác định các gen mecA và mecI Chủng mecA mecI 7 + + 9 + - 10 + - 16 + - 19 + - 20 + - 25 + - 28 + + 30 + + 32 + + MRSA 43300 + - CT 7 9 10 16 19 20 28 25 32 30 T 7 9 10 16 19 20 28 25 3230 Mẫu a Mẫu b 2kb 481bp Hình 1. Kết quả PCR của gen mecA (a) và gen mecI (b) trên các chủng S. aureus khảo sát T: thang 1kb, C: chứng MRSA. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 173 Giải trình tự và phân tích kết quả Các trình tự hoàn chỉnh được so sánh với các trình tự gen mecI, mecA của chủng S. aureus N315 bằng cách sử dụng phần mềm ClustalX 2.0.11. Kết quả được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. Kết quả xác định đột biến trên các chủng S. aureus khảo sát Chủng Gen Loại đột biến Hậu quả 28 mecI Đột biến thay thế C Æ T ở nucleotid 202 Tạo ra bộ ba kết thúc TAA 7, 16, 28 và 30 mecA Đột biến thay thế C Æ A ở nucleotid 75 Làm TCC Æ TCA cùng mã hóa cho serin Đột biến thay thế T Æ G ở nucleotid 150 Làm ATA Æ AGA chuyển isoleucin thành asparagin. 30 mecA Đột biến thay thế A Æ G ở nucleotid 242 CAG Æ CGG chuyển glycin thành asparagin. A. Đột biến thay thế C Æ T ở nucleotid 202 trên gen mecI của chủng 28 B. Đột biến thay thế C Æ A ở nucleotid 75 trên gen mecA của chủng 7, 16, 28 và 30 C. Đột biến thay thế T Æ G ở nucleotid 150, A Æ G ở nucleotid 242 trên mecA của chủng 30 Hình 2. Kết quả xác định đột biến trên các chủng S. aureus khảo sát bằng phần mềm ClustalX 2.0.11 Theo kết quả trên, các chủng 7, 16 và 28 chỉ có một đột biến điểm và dạng này không làm thay đổi acid amin được dịch mã. Chủng 30 có đến 3 đột biến điểm gồm 1 dạng giống 3 chủng trên và 2 dạng khác làm thay đổi acid amin được dịch mã. Như vậy, 4 chủng có đột biến trên mecA dù làm thay đổi hay không làm thay đổi acid amin được dịch mã đều vẫn biểu hiện thành kiểu hình đề kháng. Nói cách khác, các đột biến này không ảnh hưởng đến sự đề kháng của các chủng này. Một số nghiên cứu của Nobumichi và cs.(5) về các đột biến trên mecA nhưng không tìm thấy dạng nào tương tự như dạng đã xác định trong nghiên cứu này. Trong 4 chủng mang gen mecI chỉ có một chủng (28) có đột biến được xác định. Trên lý thuyết cả 4 chủng mang gen mecI sẽ không có kiểu hình đề kháng vì mecI mã hóa cho chất chế ức chế hoạt động của mecA nên sẽ không biểu hiện được thành PBP2a. Tuy nhiên, cả 4 chủng này theo thử nghiệm kháng sinh đồ đều thể hiện kiểu hình đề kháng. Ở chủng 28, đột biến trên mecI dẫn đến việc tạo bộ ba kết thúc làm cho mecI không còn khả năng tác động ức chế hoạt động của mecA. Do đó, chủng này vẫn biểu hiện kiểu hình đề kháng. Đột biến này cũng đã được xác định trong một nghiên cứu trước đây của Nobumichi và cs.(5) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 174 Tuy nhiên, đối với 3 chủng mang gen mecI còn lại là chủng số 7, 30 và 32 lại không xác định được đột biến nào trên mecI. Trong đó, chủng 30 được xác định mang đột biến trên gen mecA làm thay đổi acid amin, chủng 7 mang đột biến không làm thay đổi acid amin và chủng 32 không có đột biến (xem Bảng 3). Có nhiều giả thuyết về kết quả này, đối với chủng 30, có thể đột biến trên gen mecA đã giúp cho gen này tránh sự ức chế của mecI. Đối với chủng 7 và chủng 32, một giả thuyết khác có thể dùng để lý giải là sự hoạt động của một gen điều hòa khác là gen mecR1 với vai trò cảm ứng hoạt động của gen mecA, trái ngược với mecI. Hầu như các chủng MRSA mang gen mecA đều có mang gen mecR1 (95%)(12). Trong trường hợp này, gen mecR1 có thể làm gia tăng hoạt động cảm ứng của gen mecA để bù lại sự ức chế của gen mecI. Cần nghiên cứu thêm các đột biến trên gen này để có kết luận chính xác hơn. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, tất cả chủng có kiểu hình đề kháng đều mang gen mecA, cho thấy có sự liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình đề kháng rất rõ ràng. Những đột biến xác định được trên gen mecA và mecI không làm thay đổi kiểu hình. Cần tiếp tục nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn hơn để xác định sự liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen đề kháng và các đột biến trên các gen mecA , mecI và mecR1 để hiểu rõ hơn về cơ chế đề kháng methicillin của vi khuẩn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. CLSI (2008). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; 18th Informational Supplement. M100- S18. 28 (1): 46-53. 2. Cutting S. M. and Horn P. B. V. (1990). Genetic Analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. C. R. Harwood and S. M. Cutting. Chichester, England, John Wiley & Sons Ltd: 27-74. 3. Dominguez MA, Linares J, Martin R (1997). Molecular mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Microbiologia; 13: 301-8. 4. Gerberding JL, Miick C, Liu HH, Chambers HF (1991). Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother; 35: 2574-79. 5. Kobayashi N., Taniguchi K., and Urasawa S. (1998), Analysis of diversity of mutations in the mecI gene and mecA promoter/operator region of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, Antimicrobial Agents And Chemotherapy, p 717–720, Vol. 42, No.3 6. Lewis RA. and Dyke KGH, MecI represses synthesis from the β-lactamase operon of Staphylococcus aureus J. Antimicrob. Chemother. (2000) 45(2): 139-144 7. McCallum N. et al. (2010). Regulation of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus International Journal of Medical Microbiology 300: 118–129 121 8. Murakami, K., Minadime W., Wanda K., Nakamura E., Teraoka H., and Watanabee S. (1991). Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244. 9. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Ellen Jo Baron, et al. (1999), "Manual of clinical microbiology", American Society Microbiology Publisher:pp.172, 292-293. 10. Sharma VK, Hackbarth CJ, Dickinson TM, Archer GL., (1998 ) Interaction of native and mutant MecI repressors with sequences that regulate mecA, the gene encoding penicillin binding protein 2a in methicillin-resistant staphylococci. J Bacteriol. Apr;180(8):2160-6. 11. Voss A., Doebbeling N.B. (1995). The worldwide prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents 5:101-106. 12. Weller M.A.T. (1999). The distribution of mecA, mecR1 and mecI and sequence analysis of mecI and the mec promoter region in staphylococci expressing resistance to methicillin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 43: 15–22.
Tài liệu liên quan