Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi nấm monascus purpureus để thu sinh khối giàu monacolin K

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 195 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI NẤM MONASCUS PURPUREUS ĐỂ THU SINH KHỐI GIÀU MONACOLIN K Vũ Thanh Thảo*, Huỳnh Bái Nhi*, Cao Thị Hồng Gấm*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Vi nấm Monascus được sử dụng từ rất lâu trong các thực phẩm truyền thống ở các nước Châu Á để làm chất màu. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm Monascus tạo ra sản phẩm trao đổi chất có giá trị thương mại như: chất màu thực phẩm, monacolin K, kháng sinh và chất chống oxy hóa. Mục tiêu: Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm Monascus pupureus nhằm thu nhận sinh khối giàu monacolin K. Phương pháp: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ và độ ẩm ban đầu trên môi trường nền là gạo đến hàm lượng monacolin K. Tiếp theo khảo sát chất nền và sau đó tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo phương pháp Taguchi bằng cách khảo sát các nguồn dinh dưỡng bổ sung bao gồm nguồn carbon (ethanol, glucose), nguồn nitơ (NH4Cl, bột ngọt (MSG), NaNO3), chất béo (glycerol, dầu đậu nành, dầu oliu) và muối khoáng (MgSO4, CaCO3, NaCl). Hàm lượng monacolin K trong sinh khối được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả: Chế độ nhiệt thích hợp là nuôi Monascus purpureus là duy trì ở 30oC trong 2 ngày đầu và ở 26oC trong 14 ngày sau, độ ẩm thích hợp là 65%. Môi trường tối ưu cho nấm sinh monacolin K cao là môi trường có chất nền là gạo, bổ sung thêm etanol 0,3%, NH4Cl 0,5%, glycerol 0,5% và NaCl 0,1%. Kết luận: Đã xác định được điều kiện tối ưu trên môi trường rắn để Monascus purpureus sản xuất monacolin K với hàm lượng cao hơn gấp 3 lần so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Từ khóa: Monascus, monacolin K, lên men rắn, sắc ký lỏng cao áp. ABSTRACT INVESTIGATION OF MONASCUS PURPUREUS CULTURE CONDITIONS FOR PRODUCING MONACOLIN K RICH BIOMASS Vu Thanh Thao, Huynh Bai Nhi, Cao Thi Hong Gam, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 195 - 201 Background: Monascus has been used long time ago in traditional food products in Asia as food colouring agent. Many studies have shown that Monascus produce commercially valuable metabolites including food colorants, cholesterol-lowering agents, antibiotics and antioxidants. Objectives: To optimize the growth condition of Monascus purpureus for production of monacolin K-rich biomass. Methods: Affect of temperature scheme and initial moisture on production of monacolin K were investigated. The basal subtrate and culture conditions including 4 factors carbon, nitrogen, oil and salt sources were optimized by Taguchi method for the production of monacolin K. The monacolin K level were measuring by HPLC. Results: The optimal temperature scheme during solid-state fermentation is 30oC for 2 days and maitained at 26oC for 14 days. Initial moisture of the solid medium is best around 65%. The optimum culture medium is rice with the addition of 0.3% ethanol, 0.5% NH4Cl, 0.5% glycerol and 0.1% NaCl. *Phòng Thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 196 Conclusion: The optimized solid-state fermentation conditions were defined. Using optimal culture conditions in cultivating, the yield of monacolin K in the fermentation process was three times higher than the traditional conditions. Keywords: Monascus, monacolin K, solid fermentation, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Monascus hay “nấm gạo đỏ” đã được sử dụng ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á từ hàng ngàn năm nay. Monascus được biết đến với nhiều ứng dụng rộng rãi trong sản xuất màu thực phẩm tự nhiên, dùng làm thuốc chữa bệnh. Các nghiên cứu cho thấy rằng tác dụng làm thuốc của Monascus chủ yếu nhờ các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của quá trình lên men Monascus. Trong đó sản phẩm bậc hai được chú ý đến nhiều nhất là monacolin K (C24H36O5) với tác dụng ức chế enzym 3-hydroxy- 3methylglutaryl-coenzym A reductase (HMG- CoA reductase), enzym này xúc tác phản ứng chuyển HMG-CoA thành mevalonat trong quá trình tổng hợp cholesterol, đặc biệt là các lipoprotein tỉ trọng thấp gây hại cho cơ thể. Monacolin K tồn tại ở 2 dạng chính: dạng hydroxy acid và dạng lacton(3,7). Tỉ lệ dạng acid và dạng lacton tùy thuộc vào loài Monascus, điều kiện nuôi cấy và pH khác nhau(7,9). Dạng có hoạt tính sinh học là dạng hydroxyl acid, còn dạng lacton khi vào cơ thể sẽ được enzym chuyển hóa thành dạng hyroxyl acid. Năm 1998, Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng dụng monacolin K chiết xuất từ Monascus trong dược phẩm, từ đó các nghiên cứu về Monascus hướng đến việc nâng cao lượng monacolin K tạo ra từ chủng nấm này. Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm Monascus purpureus cũng như môi trường tối ưu để thu sinh khối nấm giàu monacolin K. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất, dung môi, môi trường Các loại dung môi: etanol, acetonitril, acid trifloacetic (TFA) do Merck cung cấp. Hóa chất: NH4Cl, monosodium glutamat (MSG), NaNO3, glycerol, MgSO4, CaCO3, glucose do Xilong, Trung Quốc cung cấp. Chất chuẩn: monacolin K (Sigma). Môi trường nuôi cấy: PDA (potato dextrose agar), PDB (potato dextrose broth) do Merck cung cấp. Gạo, củ từ tươi: được mua từ siêu thị tại địa phương. Nấm Monascus và nhân giống Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm Monascus purpureus được phân lập từ gạo đỏ bởi Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM. Chủng nấm được duy trì trên thạch nghiêng PDA và được cấy truyền sau 30 ngày. Nhân giống cấp 1: Cấy nấm từ thạch đĩa PDA (5x103 bào tử/ml) vào môi trường PDB, lắc 150 vòng/phút, trong 3 ngày. Chuẩn bị môi trường: Cân 100g gạo, ngâm trong 9 giờ, cho vào mỗi hộp nuôi cấy, thêm một ít nước rồi đem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Nuôi nấm tạo sản phẩm thứ cấp: Cấy giống cấp 1 (107 bào tử/ml) vào các hộp môi trường khảo sát ở tỷ lệ 10% (v/w). Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm Khảo sát độ ẩm của môi trường nuôi cấy từ 50, 55, 60, 65, 70, 75%, với môi trường nền là gạo. Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp tiến hành điều chỉnh độ ẩm cần khảo sát. Nuôi nấm ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày. Định lượng monacolin K từ các mẫu này, chọn độ ẩm cho lượng monacolin K cao nhất(9). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 197 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ khác nhau Khảo sát sự ảnh hưởng của 5 chế độ nhiệt độ khác nhau đến sự sản sinh chất chuyển hóa của nấm M. purpureus trên môi trường chất nền là gạo: (I): Nuôi ở 30oC trong 16 ngày.(II): Nuôi ở 26oC trong 16 ngày. (III): Nuôi ở 30oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày. (IV): Nuôi ở 32oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày. (V): Nuôi ở 28oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày. Nuôi nấm ở điều kiện độ ẩm tối ưu đã khảo sát. Định lượng monacolin K từ các mẫu này, chọn chế độ nhiệt độ thích hợp nhất(9). Khảo sát cơ chất nền Theo các tài liệu tham khảo(4,5), gạo và củ từ là hai chất nền để nuôi cấy Monascus Trong đó, chất nền là gạo được sử dụng phổ biến và lâu đời. Và gần đây chất nền là dioscorea cũng được chứng minh thích hợp cho cho việc sản xuất monacolin K. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai loại chất nền này ở nhiệt độ và độ ẩm tối ưu. Sau đó định lượng monacolin K để chọn chất nền tối ưu. Khảo sát các chất bổ sung ảnh hưởng đến việc tạo monacolin K Bảng 2. Thành phần môi trường thử nghiệm (A) Nguồn Cacbon Yếu tố Cấp độ Ethanol Glucose (B) Nguồn Nitơ 0,5% (C) Chất béo 0,5% (D) Muối khoáng 0,1% 1 0,3 % 0,5 % NH4Cl Glycerol MgSO4 2 0,5 % 1 % MSG Dầu đậu nành CaCO3 3 0,7 % 2 % NaNO3 Dầu oliu NaCl Áp dụng phương pháp Taguchi(2) để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho M. purpureus sinh monacolin K. Các nhân tố khảo sát gồm các nguồn carbon (ethanol, glucose), nguồn nitơ (NH4Cl, MSG, NaNO3), chất béo (glycerol, dầu đậu nành, dầu oliu) và chất khoáng (MgSO4, CaCO3, NaCl) được bổ sung với các nồng độ khác nhau (Bảng 1) vào chất nền tốt nhất đã khảo sát ở trên. Sau đó tiến hành nuôi nấm ở nhiệt độ và độ ẩm tối ưu. Đây là các nguồn sinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp của nấm Monascus sp.(1). Tiến hành 9 thí nghiệm với sự bố trí theo phương pháp Taguchi (Bảng 2), và dựa vào tỉ lệ S/N của các cấp độ để xác định điều kiện tối ưu cho M. purpureus sinh monacolin K. Với 2 loại nguồn carbon bổ sung (ethanol và glucose) có tổng cộng 18 thử nghiệm tương ứng với 18 môi trường. Bảng 3. Bố trí thí nghiệm theo phương pháp Taguchi(2) Thử nghiệm A (hay A’) Nguồn carbon B Nguồn Nitơ C Chất béo D Khoáng 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 Trong đó: Nguồn carbon: A1 =ethanol 0,3%; A2 =ethanol 0,5%; A3 =ethanol 0,7%; A’1 =glucose 0,5%; A’2 =glucose 1%; A’3 =glucose 2%; Nguồn nitơ 0,5%: B1 = NH4Cl, B2 = MSG, B3 = NaNO3; Chất béo 0,5%: C1 = glycerol, C2 = dầu đậu nành, C3 = dầu oliu.; Khoáng 0,1%: D1 = MgSO4, D2 = CaCO3, D3 = NaCl. Với 9 cách phối hợp theo phương pháp Taguchi, chúng tôi có 9 môi trường thử nghiệm. Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N ratio, η) của mỗi môi trường được tính toán từ các dữ liệu thí nghiệm theo công thức sau: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 198 Trong đó: yi là giá trị của môi trường thử nghiệm lần thứ i; n là số lần lặp lại thử nghiệm (n=2). Dựa vào giá trị S/N (η) của từng môi trường để tính giá trị S/N của từng cấp độ theo phương pháp Taguchi. Thu sinh khối và chiết tách monacolin K Sau 16 ngày nuôi cấy, tiến hành đông khô sinh khối nấm, tán thành bột mịn, bảo quản sinh khối ở 4oC đến khi chiết monacolin K. Qui trình chiết(6): Cân 0,5g bột sinh khối, thêm 8 ml ethanol 75%, tán trong bể siêu âm 30 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 rpm trong 10 phút, hút lấy dịch nổi. Chiết lại thêm 2 lần. gộp dịch nổi của 3 lần chiết vào bình định mức 25 ml, bổ sung ethanol 75% vừa đủ 25ml. Đem lọc qua màng 0,45µm rồi phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Định lượng monacolin K Điều kiện sắc ký Cột Europher RP 18 (150 x 4,6mm, 5µm), đầu dò UV-vis, thể tích bơm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1 ml/phút. Pha động: gradient tiệm tiến của acetonitril (dung môi A) và TFA 0,1% (dung môi B) như sau: 20 phút đầu tăng từ 35-75% A, phút 20-28 giữ nguyên 75% A, sau đó giảm về 35% A. Tổng thời gian phân tích là 35 phút. Bước sóng phát hiện 237 nm(6). Dựng đường chuẩn monacolin K Để định lượng monacolin K trong mẫu nấm, tiến hành dựng đường chuẩn của 2 dạng monacolin K chuẩn (Sigma): dạng lacton và dạng hydroxyl acid theo giai nồng độ từ 0 – 200 mg/L. Phương trình thu được từ hai dạng đường chuẩn trình bày trong bảng sau: Bảng 4. Phương trình tuyến tính của monacolin K dạng lacton và hydroxyl acid Dạng monacolin K Phương trình tuyến tính Hệ số tương quan (R2) Lacton y = 93,844x 0,993 Hydroxyl acid y = 96,117x 0,9867 KẾT QUẢ Định lượng monacolin K Từ sắc ký đồ monacolin K chuẩn (Hình 1) cho thấy, monacolin K dạng hydroxyl acid chuẩn có thời gian lưu là 12,1 phút, và monacolin K dạng lacton chuẩn có thời gian lưu là 15,7 phút. Đ ộ hấ p th u (m A U ) (a) 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 15 5 10 20 25 30 MK hydroxyl acid tR 12,1 phút MK lacton tR 15,7 phút 0 15 5 10 20 25 30 0 0,2 0,4 0,6 0,8 MK hydroxyl acid MK lacton Thời gian (phút) Đ ộ hấ p th u (m A U ) (b) Hình 3. Sắc ký đồ của monacolin K (MK) chuẩn (a), và sắc ký đồ định lượng monacolin K từ mẫu nấm (b). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 199 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm Dựa vào đồ thị hình 2, chúng tôi nhận thấy, hàm lượng monacolin K tăng dần từ độ ẩm 50% đến 65% và sau đó giảm dần từ độ ẩm 65% đến 75%, như vậy độ ẩm thấp (dưới 60%) hoặc cao (trên 70%) đều làm giảm hàm lượng monacolin K. Hàm lượng này đạt giá trị cao ở khoảng độ ẩm 60-65%, trong đó cao nhất ở độ ẩm 65% (965,65 µg/g sinh khối khô (SKK)). 204,60 479,35 868,55 965,65 511,06 405,46 0 200 400 600 800 1000 1200 50 55 60 65 70 75 Độ ẩm (%) M on ac ol in K (µ g/ g) Hình 4. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hàm lượng monacolin K Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ khác nhau Nấm Monascus purpureus được nuôi cấy ở các chế độ nhiệt độ khác nhau, trên môi trường nền là gạo với độ ẩm tối ưu là 65%. Hàm lượng monacolin K trong sinh khối nấm ở các chế độ nhiệt khác nhau được trình bày trong hình 3. 331,36 711,71 979,08 823,19 538,67 0 200 400 600 800 1000 1200 I II III IV V Chế độ nhiệt (oC) M on ac ol in K (μ g/ g) Hình 5. Ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ đến hàm lượng monacolin K (I): Nuôi ở 30oC trong 16 ngày; [II]: Nuôi ở 26oC trong 16 ngày; (III): Nuôi ở 30oC trong 2 ngày sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày; (IV): Nuôi ở 32oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày; (V): Nuôi ở 28oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày. Dựa vào hình 3, hàm lượng monacolin K chênh lệch đáng kể khi nuôi M. purpureus ở các chế độ nhiệt khác nhau. Ở chế độ nhiệt III, Monascus tạo monacolin K cao nhất (979,08 µg/g SKK), tiếp theo là chế độ nhiệt IV (823,19 µg/g SKK), II (711,71 µg/g SKK), V (538,67 µg/g SKK), và thấp nhất ở chế độ nhiệt I (331,36 µg/g). Như vậy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến sự tạo monacolin K. Khảo sát chất nền tối ưu Khảo sát hàm lượng monacolin K trên 2 loại chất nền gạo và củ từ. Kết quả được trình bày trong Hình 4. Ta nhận thấy khi nuôi nấm trên môi trường gạo thì hàm lượng monacolin K thu được (973,58 µg/g SKK) cao hơn gấp 3 lần so với củ từ (319,09 µg/g SKK). Do đó, chúng tôi chọn là gạo làm chất nền để khảo sát môi trường dinh dưỡng tối ưu theo phương pháp Taguchi. 973,58 319,09 0 200 400 600 800 1000 1200 Gạo Củ từ Chất nền M on ac ol in K (μ g/ g) Hình 6. Hàm lượng monacolin K trên 2 loại chất nền Khảo sát các nguồn dinh dưỡng bổ sung Dựa vào phương pháp Taguchi, với 2 loại nguồn carbon bổ sung (ethanol và glucose), tiến hành 18 thử nghiệm tương đương với 18 môi trường được trình bày trong bảng sau: Bảng 5. Hàm lượng monacolin K và tỉ lệ S/N tương ứng của các môi trường Nguồn C ethanol Nguồn C glucose STT Lượng (μg/g) S/N STT Lượng (μg/g) S/N 1 2972 69,46 10 2343 67,40 2 1844 65,32 11 1478 63,40 3 2957 69,42 12 2511 68,00 4 255 68,13 13 2779 68,88 5 1522 63,65 14 1517 63,62 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 200 Nguồn C ethanol Nguồn C glucose STT Lượng (μg/g) S/N STT Lượng (μg/g) S/N 6 2069 66,32 15 2307 67,26 7 1638 64,29 16 2942 69,37 8 1263 62,03 17 1779 65,01 9 1717 64,70 18 2851 69,10 TB 65,92 TB 66,89 Bảng 6. Tỉ lệ S/N của các cấp độ trong thử nghiệm trên các môi trường Tỉ lệ S/N của monacolin K Yếu tố Cấp độ Ethanol Glucose A1 (ethanol 0,3%) 68,07 * A2 (ethanol 0,5%) 66,03 * A3 (ethanol 0,7%) 63,67 * A’1 (glucose 0,3%) * 66,26 A’2 (glucose 0,5%) * 66,59 A (nguồn carbon 0,5% ) A’3 (glucose 0,7%) * 67,83 B1 (NH4Cl) 67,29 68,55 B2 (MSG) 63,67 64,01 B (nguồn nitơ 0,5%) B3 (NaNO3) 66,81 68,12 C1 (glycerol) 65,94 66,56 C2 (dầu đậu nành) 66,05 67,13 C (chất béo 0,5%) C3 (dầu oliu) 65,79 67 D1 (MgSO4) 65,94 66,71 D2 (CaCO3) 65,31 66,68 D (muối khoáng 0,1%) D3 (NaCl) 66,53 67,29 TB: 65,92 TB: 66,89 Dựa vào đồ thị biểu diễn kết quả thử nghiệm Taguchi (hình 5), các nhân tố B, C, D tương ứng với các nguồn nitơ, chất béo và muối khoáng đều có xu hướng như nhau khi thử nghiệm trên 2 nguồn carbon khác nhau. Nguồn nitơ thì NH4Cl (B1) có tác động tốt nhất đối với monacolin K ở cả 2 thử nghiệm. Trong khi đó, chất béo không ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh monacolin K. Trong 3 loại muối khoáng thì NaCl (D3) có ảnh hưởng tốt nhất đối với sự tạo monacolin K. Còn đối với nguồn C là ethanol, khi nồng độ ethanol giảm (A3→A2→A1) thì hàm lượng monacolin K tăng, ethanol 0,3% (A1) cho hàm lượng monacolin K cao nhất, đến ethanol 0,5% (A2), thấp nhất là ethanol 0,7% (A3). Ngược lại, khi nguồn C là glucose, nồng độ glucose tăng (A1→A2→A3) thì làm tăng hàm lượng monacolin K Như vậy, nguồn carbon bổ sung là ethanol và glucose đều kích thích nấm tạo nhiều monacolin K. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của tác giả Wang và cộng sự, 2003(8) ; Lee và cộng sự, 2007(4). Tuy nhiên, nguồn C là ethanol 0,3% (A1) thì kích thích nấm tạo ra monacolin K nhiều hơn so với nguồn C là glucose 0,7%. Ngoài ra, theo Lee (2007)(4), ethanol còn có tác dụng làm giảm lượng citrinin (một độc tố do Monacus sinh ra trong quá trình phát triển). Vì vậy, chúng tôi chọn môi trường nuôi cấy tối ưu cho Monascus purpureus sinh monacolin K là các yếu tố: A1 (ethanol 0,3%), B1 (NH4Cl), C1 (glycerol), D3 (NaCl). Monacolin K 62,00 64,00 66,00 68,00 70,00 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 Các cấp độ của thử nghiệm S/ N Monacolin K 62,00 64,00 66,00 68,00 70,00 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 Các cấp độ của thử nghiệm S/ N Nguồn C là Ethanol Nguồn C là Glucose ,, , Hình 7. Ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến khả năng sinh monacolin K. Nguồn C: A1=ethanol 0,3%, A2=ethanol 0,5%, A3=ethanol 0,7%; A’1= glucose 0,3%, A’2=glucose 0,5%, A’3=glucose 0,7%. Nguồn Nitơ: B1=NH4Cl, B2=MSG, B3=NaNO3. Chất béo: C1=glycerol, C2=dầu đậu nành, C3=dầu oliu. Muối: D1=MgSO4, D2=CaCO3, D3=NaCl Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 201 So sánh hàm lượng monacolin K trong điều kiện nuôi cấy tối ưu và truyền thống Phương pháp nuôi cấy nấm Monascus truyền thống là nuôi trên chất nền gạo và không bổ sung thêm các nguồn dinh dưỡng khác, chính là điều kiện nuôi cấy nấm trong quá trình khảo sát nhiệt độ và độ ẩm. Theo kết quả của khảo sát nhiệt độ và độ ẩm ở trên thì ở độ ẩm 65% và chế độ nhiệt III (30ºC trong 2 ngày đầu và duy trì 26ºC trong 14 ngày sau) hàm lượng monacolin K thu được khoảng 970 (μg/g). Bảng 7. Hàm lượng monacolin K thu được ở điều kiện nuôi cấy tối ưu hóa và truyền thống Phương pháp nuôi cấy Monacolin K (μg/g) Tối ưu hóa 2972,11 Truyền thống 970 Như vậy, quá trình tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nấm M. purpureus đã làm tăng hàm lượng monacolin K lên gấp 3 lần so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. KẾT LUẬN Tóm lại, kết quả thử nghiệm cho thấy điều kiện nuôi cấy tối ưu cho Monascus purpureus sinh monacolin K cao nhất (2972,11 μg/g) là trên môi trường nền là gạo có bổ sung thêm ethanol 0,3%, NH4Cl 0,5%, glycerol 0,5% và NaCl 0,1% với độ ẩm ban đầu là 65%, nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 2 ngày đầu và duy trì ở 26 oC trong 14 ngày sau. Các thông số khảo sát này sẽ là tiền đề cho việc ứng dụng sản xuất ở quy mô lớn sau này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. A. Illanes, Ruiz A., et al. (1990). Immobilization of lactase for the continuous hydrolysis of whey permaete. Bioprocess Engineering. ( 5): 257- 262. 2. Chung C. C., Chen H. H. (2007). Application of the Taguchi method to optimize Monascus spp. Culture. Food Process Engineering. 30: 241-254. 3. Endo A. (1979). Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J. Antibiotics 32: 852- 854. 4. Lee C. L., Hung H. K., et al. (2007). Improving the ratio of monacolin K to citrinin production of Mo