Khảo sát mức độ nhạy cảm của Candida spp. với Fluconazole

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 83 KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP. VỚI FLUCONAZOLE Nguyễn Thị Thúy Anh*, Trần Cát Đông**, Nguyễn Đinh Nga** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên fluconazole trong điều trị là nguyên nhân gây ra sự kháng thuốc ở Candida albicans và Candida non albicans. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy của Candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm nấm tại 5 Bệnh viện ở TP. HCM. với fluconazole. Định danh các chủng Candida kháng fluconazole bằng PCR. Vật liệu và phương pháp: Mức độ nhạy của 129 chủng Candida với fluconazole được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán theo NCCLS M44-A. Định danh các chủng Candida non albicans bằng giải trình tự vùng ITS. Kết quả: 93.64% chủng Candida albicans trong thử nghiệm nhạy với fluconazole. 5/19 chủng Candida non albicans kháng fluconazole có trình tự ITS tương đồng với trình tự ITS loài Candida glabrata và Candida tropcalis. Bàn luận và kết luận: Tỷ lệ Candida non albicans kháng fluconazole cao hơn C. albicans. Vì vậy cần sử dụng môi trường thích hợp để định danh Candida hoặc thực hiện kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng nấm thích hợp. Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, fluconazole, MHA – GMB,PCR ABSTRACT SURVEY ON SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP. TO FLUCONAZOLE Nguyen Thi Thuy Anh, Tran Cat Dong, Nguyen Đinh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 83 - 85 Background: Over the past few decades, Candida spp. are the most common of fungal pathogens and the emergence of drug resistant Candida spp. become an important problem in therapy. Objective: to determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to fluconazole. Material and methods: The antifungal activity against 129 trains of Candida spp. of fluconazole were determined by the Disk diffusion method according to the guidline of NCCLS M44-A. The PCR amplification of the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) is used for species identification. Outcome: 93,64% of Candida albicans were sensible to fluconazole. 5/19 resistant strains are identified belong to Candida glabrata and Candida tropicalis. Conclusion: Disk diffusion test are simple to set up to propose a reasonable antifungal agent for physicians Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh do Candida gây ra gia tăng nhanh chóng từ đầu thập niên 1990 đến nay, đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch. Một số báo cáo ngoài nước cảnh báo việc sử dụng fluconazole  Trường Đại học Khoa học tự nhiên  Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 84 thường xuyên trong điều trị, cộng với tỉ lệ bệnh do Candida non albicans đang có khuynh hướng tăng dần(1,6) có thể là nguyên nhân làm kéo dài thời gian hoặc thất bại trong điều trị bệnh do Candida. Để tìm hiểu mức độ đáp ứng của Candida phân lập từ một số bệnh nhân Việt Nam với fluconazole, trong phạm vi đề tài chúng tôi khảo sát mức độ nhạy của Candida spp. với fluconazole in vitro. ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 129 chủng Candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida ở 5 bệnh viện tại TP. Hồ Chí Minh từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2011. Candida albicans ATCC 10231, được sử dụng làm chủng đối chứng, nhạy với fluconazole với đường kính vòng kháng nấm từ 38-40 mm Chất kháng nấm Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm lượng 99,41%. Môi trường Mueller Hinton Broth (Merck) và Czapeck- Dox ((Merck). Phương pháp nghiên cứu Để xác định mức độ nhạy của Candida spp. với fluconazolee Chúng tôi sử phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn của NCCLS M44-A(2, 4) với các điều kiện thử nghiệm như sau: Đĩa giấy tẩm fluconazole 25 µg, thạch Mueller Hinton bổ sung 2% glucose và xanh methylen 5 µg/ml (MHA-GMB). Đo đường kính vòng ức chế sau 24 giờ ủ ở 370C. Dựa vào đường kính vòng ức chế, mức độ nhạy của Candida spp với fluconazole được NCCLS M44 chia thành 3 mức, nhạy (S) khi đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ 15-18 mm và đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 14 mm. Định danh Candida spp. Phân nhóm Candida albicans và Candida non albicans: Dựa vào các đặc điểm sợi nấm giả - bào tử bao dầy trên môi trường thạch bột ngô và sự tạo ống mầm trong huyết thanh sau 3-4 giờ ủ ở 37 oC(5) Đinh danh Candida non albicans đến mức loài bằng PCR(3): Sử dụng cặp mồi ITS1 (5’ TCC GTA GGT GAA CGT GCG G 3’) và ITS4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'). Phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendorf 0.2 ml với thể tích hỗn hợp là 50 l có thành phần phản ứng như sau: 1 M mỗi mồi, 0,5 mM dNTP, 2 mM MgSO4 ,1X buffer và 1U Taq Polymerase. Tiền biến tính DNA trong 950C, 10 phút, 1 chu kỳ. Chu kỳ khuếch đại gồm 30 chu kỳ: biến tính 950C, 45 giây, gắn mồi 500C, 45 giây, kéo dài 720C, 2 phút, hoàn chỉnh 720C, 10 phút, 1 chu kỳ. Sản phẩm tinh sạch ADN được đem gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogen, Hàn Quốc. Kết quả giải trình tự được nhận biết bằng bộ phần mềm Lasergene 7.1 và công cụ BLAST (NCBI). KẾT QUẢ Phân nhóm Candida spp. Trong 129 chủng Candida spp. ly trích từ bệnh nhân, 110/129 chủng thuộc Candida albicans và 19/129 chủng thuộc Candida non albicans. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazole Kết quả ở bảng 1 cho thấy chỉ có ba chủng C. albicans được phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV và một chủng C. albicans từ bệnh nhân lao ở bệnh viện Phạm Ngọc Thạch kháng fluconazole, chiếm 3,64%. Nếu chỉ tính trên số ca phân lập từ phết họng của bệnh nhân HIV ở bệnh viện Nhiệt Đới, có 11.43% trường hợp C. albicans kém nhạy với fluconazole. Tỉ lệ này thấp hơn 1/2 so với báo cáo của Trần Phủ Mạnh Siêu (26,67%)(6). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 85 Bảng 1. Mức độ nhạy của Candida spp. với fluconazole Nguồn phân lập Số chủng Candida spp. đáp ứng với tác động của fluconazole C. albicans (n = 110) C. non albicans (n=19) S SDD R S R Bệnh viện Q4 (n=15) 15 0 0 0 0 BV. Nhiệt Đới (n=52) 31 1 3 14 3 BV Phạm Ngọc Thạch (n=26) 23 0 1 0 2 BV. Pháp Việt (n=30) 28 2 0 0 0 Bệnh viện X (n=7) 7 0 0 0 0 Tổng cộng 104 3 4 14 5 (93,64%) (2,73%) (3,64%) (73,68 %) (26,32%) Tỉ lệ Candida non albicans kém nhạy và kháng fluconazole cao hơn C. albicans. Theo Trần Phủ Mạnh Siêu(6), trong 8 chủng C. tropicalis phân lập từ phết họng và phết lưỡi bệnh nhân HIV ở bệnh viện Nhiệt Đới, 25% chủng kháng fluconazole. Ở nghiên cứu của chúng tôi, các chủng kháng fluconazole chiếm khoảng 26,32%. Định danh các chủng Candida non albicans bằng giải trình tự vùng ITS Năm chủng Candida non albicans kháng fluconazole gồm PNT20, PNT31, PNT33, ND31, ND32 được để giải trình tự vùng ITS. Vì vùng ITS kích thước ngắn nên chúng tôi chỉ dùng một phản ứng với một mồi tương ứng cho mỗi mẫu. Bảng 2. Kết quả định danh của 7 chủng Candida non albicans Chủng Description Max score Total score Querry coverage E value Max ident ND31 C. glabrata 1282 1282 100% 0.0 99% ND32 C. glabrata 1079 1079 100% 0.0 99% PNT20 C. tropicalis 693 693 100% 0.0 98% PNT31 C. tropicalis 800 800 97% 0.0 98% PNT33 C. tropicalis 728 728 100% 0.0 99% Dựa trên Query coverage, Max ident cao nhất và E value thấp nhất theo kết quả bảng 3: Hai chủng ND31, ND32 có sự gần đồng nhất về trình tự ITS với Candida glabrata. Ba chủng PNT 20, PNT 31, PNT 33 có sự gần đồng nhất về trình tự ITS với C. tropcalis. Candida glabrata và Candida tropcalis là những loài thường gây bệnh ở người suy giảm miễn dịch, gây khó khăn cho việc điều trị. Do vậy, để điều trị cho đối tượng bệnh nhân này, cần sử dụng môi trường thích hợp để định danh Candida hoặc thực hiện kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng nấm thích hợp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Capoor MR et al (2005). Emergence of Non-albicans Candida Species and antifungal resistance in a tertiary care hospital. Jpn. J. Infect. Dis., 58: 344-348 2. Ernst EJ ( 2007). Methods in Molecular medicine. In: Ernst EJ và Rogers PD. Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188, pp 3-12. Humana Press Inc, Totowa, NJ 3. Korabecna M (2007). The Variability in the Fungal Ribosomal DNA (ITS1, ITS2 and 5.8S rRNA Gene): its Biological Meaning and Application in Medical Mycology. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology A. Méndez – Villas (Ed) 4. NCCLS (2004). Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline. NCCLS document M44-A, NCCLS, Wayne, PA, 19087-1898 5. Pfaller MA, McGinnis MR (2003). The laboratory and clinical mycology. In: Anaissie EJ, McGinnis MR. & Pfaller M.A. Clinical Mycology, p 55-74. Churchill Livingstone 6. Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010). Tình hình nhiễm vi nấm Candida spp. trên các bệnh nhân nhập viện tại Bệnh viện Nhiệt Đới TP. HCM năm 2009. Tạp chí Y học, phụ bản số 1, tập 14, tr 206-212