Mục tiêu: Xây dựng mô hình mô phỏng bệnh gan và tình trạng sắt thừa ở người nghiện rượu trên chuột
nhắt trắng.
Phương pháp: Chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% (g/ml), sau đó theo dõi lượng rượu tiêu thụ,
trọng lượng cơ thể và tình trạng dinh dưỡng mỗi ngày . Sau 8 tuần, thu nhận mẫu máu xác định hoạt tính men
gan, các chỉ số sắt huyết thanh, tách lấy gan xác định nồng độ protein, sắt và phân tích mô học.
Kết quả: chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% biểu hiện tình trạng viêm gan nhưng chưa có sự xơ
hóa thể hiện qua chỉ số AST, ALT tăng và hình ảnh vi thể. Ngoài ra, chuột được gây bệnh có hiện tượng thừa sắt
trong gan thể hiện qua nồng độ sắt trong gan tăng và sắt tích tụ trong tế bào khi phân tích vi thể bằng phương
pháp nhuộm Perls.
Kết luận: mô hình gây được tình trạng viêm gan do rượu và sắt thừa tích tụ trong gan. Từ đó có thể sử
dụng những mô hình này để nghiên cứu tác dụng phòng và điều trị bệnh gan do rượu của các chất mới hoặc dược
liệu theo cơ chế loại bỏ sắt thừa trong gan.
6 trang |
Chia sẻ: thuyduongbt11 | Ngày: 14/06/2022 | Lượt xem: 323 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Chuyên Đề Dược Học 418
KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG CHUYỂN HÓA SẮT
TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG MÔ PHỎNG BỆNH GAN
Ở NGƯỜI NGHIỆN RƯỢU
Tất Chí Hùng*, Đỗ Thị Hồng Tươi*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng mô hình mô phỏng bệnh gan và tình trạng sắt thừa ở người nghiện rượu trên chuột
nhắt trắng.
Phương pháp: Chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% (g/ml), sau đó theo dõi lượng rượu tiêu thụ,
trọng lượng cơ thể và tình trạng dinh dưỡng mỗi ngày . Sau 8 tuần, thu nhận mẫu máu xác định hoạt tính men
gan, các chỉ số sắt huyết thanh, tách lấy gan xác định nồng độ protein, sắt và phân tích mô học.
Kết quả: chuột được cho uống dung dịch ethanol 20% biểu hiện tình trạng viêm gan nhưng chưa có sự xơ
hóa thể hiện qua chỉ số AST, ALT tăng và hình ảnh vi thể. Ngoài ra, chuột được gây bệnh có hiện tượng thừa sắt
trong gan thể hiện qua nồng độ sắt trong gan tăng và sắt tích tụ trong tế bào khi phân tích vi thể bằng phương
pháp nhuộm Perls.
Kết luận: mô hình gây được tình trạng viêm gan do rượu và sắt thừa tích tụ trong gan. Từ đó có thể sử
dụng những mô hình này để nghiên cứu tác dụng phòng và điều trị bệnh gan do rượu của các chất mới hoặc dược
liệu theo cơ chế loại bỏ sắt thừa trong gan.
Từ khóa: bệnh gan do rượu, chuyển hóa sắt, rượu
ABSTRACT
INVESTIGATION ON IRON METABOLISM IN MICE MODEL
MIMICKING ALCOHOLIC LIVER DISEASE
Tat Chi Hung, Đo Thi Hong Tuoi
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 418 - 423
Objectives: The aim of this work is to establish a mice model mimicking alcoholic liver disease (ALD) and to
study iron homeostasis.
Methods: Mice were used to induce liver injury by feeding ethanol in water at a final concentration of 20%
(g/ml). Alcohol consumption, body weight and diet were daily determined. After 8-week treatment, blood samples
were used for biochemical assays, liver tissues were excised for total protein and iron assays as well as histological
analysis.
Results: Mice fed ethanol in water at 20% (g/ml) exhibited hepatitis without fibrosis, as measured by rise in
AST, ALT activity and histological photomicrographs. Moreover, a hepatic iron overload was observed in ethanol-
fed mice by increase in liver iron concentration and iron-laden hepatocytes at histological examination using Perls
staining.
Conclusions: Results showed that in mice, ethanol induced hepatitis and hepatic iron overload paralleling
alcohol-induced liver injury in human ALD. Thus, ethanol-fed mice model could be applied to study prevention
and treatment effect of novel molecules or plants extracts on alcoholic liver disease by removing excessive iron.
Key words: alcoholic liver disease, iron metabolism, alcohol
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM
Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoid99@gmail.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 419
ĐẶT VẤN ĐỀ
Một số nghiên cứu báo cáo tình trạng thừa
sắt trong gan ở những bệnh nhân bệnh gan do
rượu và sắt thừa làm tăng độc tính của rượu trên
gan(6,7). Những nghiên cứu in vitro cho thấy một
số chất hoặc dược liệu chứa polyphenol có tác
dụng bảo vệ gan nhờ cơ chế loại bỏ sắt thừa
trong gan(1,2,4). Những kết quả này cần được
khẳng định ở cấp độ in vivo trên động vật nhưng
mô hình chuột nhắt mô phỏng bệnh gan do rượu
ở Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi
thực hiện xây dựng mô hình chuột nhắt trắng
mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu và
khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình
này với hy vọng tìm được mô hình thích hợp để
nghiên cứu tác dụng phòng và điều trị bệnh gan
do rượu của các chất mới hoặc dược liệu theo cơ
chế loại bỏ sắt thừa trong gan.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chuột nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 6-
8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 g,
được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm
Nha Trang. Chuột được nuôi riêng lẻ trong các ô
ngăn cách bằng khung lưới của lồng có kích
thước 35 x 25 x 15 cm (6 ô/lồng). Chuột được
cung cấp thức ăn và nước uống theo điều kiện
của mô hình thí nghiệm.
Hóa chất và trang thiết bị
Ethanol (Guangdong), dung dịch đỏ trung
tính (neutral red) 0,1%, ferrocyanid 20%, HCl
20%, đệm PBS 1X, NaCl 0,9%, nước cất đều đạt
tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích.
Mô hình cho chuột uống dung dịch ethanol
20% (g/ml)
Chuột được chia thành 2 lô, mỗi lô 6 con: lô
chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống
dung dịch ethanol nồng độ tăng dần: 10% (g/ml)
cho 2 ngày đầu, 15% cho 5 ngày tiếp theo, 20% từ
tuần thứ 2. Dung dịch ethanol hoặc nước cất là
nguồn cung cấp nước duy nhất đựng trong
xilanh thiết kế đặc biệt cho chuột uống tự nhiên.
Cung cấp cám viên không giới hạn. Mô hình này
đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu để mô
phỏng tình trạng nghiện rượu ở người (3).
Xác định lượng ethanol tiêu thụ mỗi ngày
methanol (g) = [Vdung dịch ban đầu (ml) – Vdung dịch sau 24 giờ
(ml)] × 0,2.
Khảo sát tình trạng dinh dưỡng của chuột
thử nghiệm mỗi ngày
mthức ăn (g) = mthức ăn ban đầu (g) –
mthức ăn sau 24 giờ (g)
Theo dõi trọng lượng cơ thể chuột
Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của chuột
được ghi nhận bằng cách cân chuột 3 lần/tuần.
Xác định hoạt tính men gan (AST, ALT)
Sau 8 tuần, chuột được giết, lấy máu tim xét
nghiệm hoạt tính ALT, AST tại Khoa Sinh hóa,
Bệnh viện Chợ Rẫy, TP.HCM trên máy Hitachi
917 lần lượt với các kit 80327 và 80325 (Biolabo)
bằng phương pháp đo động học enzym.
Phân tích mô học xác định mức độ tổn
thương gan
Sau 8 tuần, chuột được giết, tách lấy gan, rửa
sạch bằng NaCl 0,9% lạnh. Thấm khô, cân và ghi
nhận trọng lượng. Quan sát đại thể về màu sắc,
tình trạng bề mặt, tổn thương. Một phần gan
được cố định trong formol 10% để làm xét
nghiệm vi thể bằng phương pháp nhuộm HE
(hematoxylin và eosin), trichrom tại khoa Sinh
hóa – Bệnh viện Nhi Đồng 1, TP.HCM. Quan sát
cấu trúc, hình thái tế bào gan dưới kính hiển vi,
đánh giá mức độ tổn thương gan.
Xác định protein toàn phần trong gan
Gan được nghiền trong đệm PBS 1X lạnh
(pH 7,4) theo tỉ lệ 1g/1ml. Ly tâm (12000g)
trong 15 phút ở 4°C, lấy dịch trong cho vào
eppendorf để định lượng protein toàn phần
bằng phương pháp Biuret trên máy Hitachi
917, kit A42.600.16 (BioLabo) tại Khoa Sinh
hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Chuyên Đề Dược Học 420
Định lượng sắt huyết thanh và sắt toàn
phần trong gan
Huyết thanh và dịch gan sau ly tâm được
dùng định lượng sắt trên máy Hitachi 917 với
bộ kit 92108 (Biolabo) bằng phương pháp
Feren S.
Định lượng transferrin huyết thanh
Định lượng transferrin huyết thanh thực
hiện trên máy BS 300 (Mindray) với bộ kit
1102134 (Spinreact) bằng phương pháp đo độ
đục miễn dịch.
Xác định độ bão hòa của transferrin
Giá trị sắt và transferrin huyết thanh được
dùng để tính độ bão hòa transferrin (TS) theo
công thức TS = (Sắthuyết thanh/Transferrinhuyết thanh)
x 4.
Phương pháp nhuộm Perls
Cố định gan trong formol 10%, xử lý bằng
máy tự động tại khoa Sinh hóa – bệnh viện Nhi
Đồng 1. Ngâm lam mẫu trong nước cất 10 phút,
ủ 20 phút với kali ferrocyanid 20% trong HCl
20%. Rửa lam mẫu 3 lần với nước cất (5
phút/lần), nhuộm 15 phút với dung dịch đỏ
trung tính 0,1%. Rửa sạch bằng nước, loại nước
trong cồn tuyệt đối, để khô.
Phân tích kết quả-xử lý số liệu thống kê
Kết quả trình bày dưới dạng giá trị trung
bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình và
đánh giá ý nghĩa thống kê bằng test Mann-
Whitney (phần mềm Minitab 14.0). Sự khác biệt
có ý nghĩa khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Lượng rượu tiêu thụ
Trong 2-3 tuần đầu lượng rượu tiêu thụ tăng
dần đến mức tối đa, sau đó ổn định trong suốt
thời gian thử nghiệm.
Lượng thức ăn tiêu thụ
Chuột uống dung dịch ethanol 20% tiêu thụ
cám viên tăng dần nhưng ít hơn khoảng 2 g so
với chuột chứng (4 g/ngày so với 6 g/ngày).
Sự thay đổi trọng lượng cơ thể
Trọng lượng chuột ở lô chứng tăng nhanh
liên tục (Hình 1). Sự tăng trọng lượng của chuột
ở lô thử có thể chia theo 3 giai đoạn: Giai đoạn 1:
trọng lượng giảm trong tuần 1. Giai đoạn 2:
trọng lượng duy trì ổn định trong khoảng 2 tuần.
Giai đoạn 3: từ tuần 4-8 trọng lượng tăng với tỷ
lệ thấp hơn so với lô chứng.
Mức độ tổn thương gan
Tỉ lệ trọng lượng gan trên trọng lượng cơ thể
Tỉ lệ trọng lượng gan trên trọng lượng cơ thể
của chuột ở lô thử và lô chứng khác biệt không
đáng kể (Bảng 1: p = 0,200)
Lượng protein toàn phần trong gan
So với chuột chứng, lượng protein toàn
phần của gan chuột thử giảm hơn 60% (Bảng
1, p = 0,005).
Bảng 1. Tỉ lệ trọng lượng gan/trọng lượng cơ thể và
lượng protein toàn phần của gan. Kí hiệu ** biểu hiện
cho p < 0,01 khi so sánh lô thử với lô chứng.
Tỉ lệ TL gan/TL cơ
thể
Protein toàn phần
của gan
Lô chứng Lô thử Lô chứng Lô thử
Chuột uống dung
dịch ethanol 20%
100,0 ±
7,5
91,0 ±
13,9
100,0 ±
13,2
37,4 ±
8,5**
Thay đổi hoạt tính men gan ALT, AST
Hoạt tính ALT, AST của chuột thử tăng so
với chuột chứng (Hình 2, ALT: +78,8%, p =
0,0131; AST: +74,3%, p = 0,036).
Thay đổi về mặt mô học
Chuột thử và chứng đều có gan màu đỏ tươi,
bề mặt nhẵn, không phù nề, không sung huyết
khi quan sát đại thể. Mô hình gây được tình
trạng viêm gan trên 100% chuột ở lô thử tương
tự viêm gan do rượu ở người thể hiện qua kết
quả phân tích vi thể (Hình 3).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 421
Hình 3. Hình ảnh vi thể gan chuột (X400). Lô chứng: nhuộm HE (A, B); nhuộm trichrom (C); lô thử: tế bào viêm
xâm nhập khoảng cửa (E), tế bào kupffer phình to (D), không xơ hóa (F).
Tình trạng chuyển hóa sắt Chuột gây bệnh có sắt toàn phần trong gan
A B C
E F D
Hình 1. Trọng lượng cơ thể chuột
Hình 2. Hoạt tính men gan ALT, AST.* và ** lần lượt biểu hiện cho p <
0,05 và p < 0,01 khi so sánh lô thử với lô chứng.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Chuyên Đề Dược Học 422
tăng đáng kể so với chuột chứng (Hình 4A). Kết
quả này được củng cố thêm bởi những hình ảnh
vi phẫu nhuộm Perl tế bào gan (Hình 4B,C): 70%
chuột lô thử có tế bào gan nhuộm màu xanh thể
hiện tình trạng tích lũy sắt thừa.
\
Hình 4. Nồng độ sắt toàn phần trong gan chuột (A) và hình ảnh vi thể (X1000) tế bào gan sau khi nhuộm Perls:
lô chứng (B); lô thử (C). Màu xanh dương đậm, dạng hạt là hemosiderin.
Các chỉ số sắt huyết thanh gồm sắt,
transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin
của chuột gây bệnh gan do rượu khác biệt
không đáng kể so với chuột chứng (dữ liệu
không trình bày).
BÀN LUẬN
Từ thực nghiệm cho thấy, chuột lô thử trong
mô hình có tình trạng tiêu thụ ethanol tăng dần,
trong khi đó trọng lượng cơ thể tăng nhẹ hơn so
với lô chứng.
Mô hình gây được tình trạng viêm gan do
rượu, chưa thấy xuất hiện xơ hóa, thể hiện qua
các hình ảnh rất đặc trưng khi so sánh trên lâm
sàng ở người bệnh gan do rượu(5). Kết quả được
củng cố bởi tăng AST, ALT trong xét nghiệm
hoạt tính men gan.
Về tình trạng chuyển hóa sắt, chuột được
gây bệnh gan do rượu đều có lượng sắt toàn
phần trong gan tăng rất đáng kể so với lô chứng.
Kết quả này củng cố cho thực tế lâm sàng rằng
người nghiện rượu có 50-60% trường hợp thừa
sắt trong gan và hoàn toàn phù hợp nghiên cứu
in vitro cho thấy ethanol làm tăng sắt nội bào do
làm tăng biểu hiện các gen mã hóa cho protein
dự trữ sắt L-ferritin, vận chuyển sắt như
transferrin(4). Thừa sắt tích tụ trong gan là một
trong những nguyên nhân làm tình trạng viêm
gan. Thật vậy, sắt làm tăng sinh các gốc tự do
gây ra bởi ethanol làm tăng độc tính của ethanol,
gây peroxyd hóa lipid màng tế bào dẫn đến phá
hủy tế bào gan(4).
Các chỉ số sắt huyết thanh gồm sắt,
transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin
của chuột gây bệnh gan do rượu trên mô hình
không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng.
Điều này cho thấy tình trạng thừa sắt ở giai đoạn
đầu, sắt mới chỉ tăng trong gan, chưa ảnh hưởng
đến sắt hệ thống.
KẾT LUẬN
Mô hình cho chuột uống dung dịch ethanol
20% (g/ml) gây được tình trạng viêm gan và
thừa sắt tích tụ trong gan như bệnh gan ở người
nghiện rượu. Có thể sử dụng mô hình này để
nghiên cứu tác dụng loại bỏ sắt thừa trong gan
của các chất/dược liệu theo hướng phòng và
điều trị bệnh gan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Acker Saskia ABE van (1998). Influence of Iron Chelation on the
Antioxidant Activity of Flavonoids. Biochemical Pharmacology
56:935-943.
2. Brittenham GM (2003). Iron chelators and iron toxicity. Alcohol.
30:151-158.
3. Coleman Ruth A et al. (2008). A Pratical Method of Chronic
Ethanol Administration in Mice, in Alcohol: Methods and
C
B
A
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 423
Protocols, Laura E. Nagy, Human press, 11-60.
4. Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự (2010). Mối quan hệ giữa hoạt
tính ức chế tăng trưởng của rượu đối với quá trình chuyển hóa
sắt trên dòng tế bào ung thư gan HepaRG. Hội nghị khoa học
công nghệ toàn quốc trường ĐHYD Cần thơ, 705-708.
5. Kanel Gary C et al (2005). Atlas of Liver Pathology, Elsevier
Saunders, 63-76.
6. Moirand R et al. (1991). Increase in glycosylated and
nonglycosylated serum ferritin in chronic alcoholism and their
volution during alcohol withdrawal. Alcohol Clin Exp Res.
15:963-972.
7. Suzuki Y (2002). Up-regulation of transferrin receptor expression
in hepatocytes by habitual alcohol drinking is implicated in
hepatic iron overload in alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp
Res. 26:26S-31S.
Ngày nhận bài báo: 14.12.2012
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2012
Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014