Nghiên cứu điều chế và tiêu chuẩn hóa Secnidazol

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 305 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA SECNIDAZOL Trương Phương*, Trần Thị Trúc Thanh*, Phạm Thị Diệu Thảo* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu điều chế secnidazol trong điều kiện Việt Nam và tiêu chuẩn hóa sản phẩm. Phương pháp: Xây dựng qui trình điều chế sernidazol theo 2 bước. Tổng hợp 2-methyl-5- nitroimidazol bằng phản ứng nitro hóa 2-methylimidazol. Ngưng tụ 2-methylimidazol với propylen oxyd thu được secnidazol. Xây dựng và chuẩn hóa quy trình kiểm nghiệm secnidazol. Áp dụng quy trình kiểm nghiệm để định lượng secnidazol tổng hợp được với các điều kiện khảo sát và một biệt dược trên thị trường Việt Nam (Flagentyl 500 mg). Kết quả: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình điều chế secnidazol. Xây dựng tiêu chuẩn cho nguyên liệu secnidazol. Kết luận: Từ những nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có ở Việt Nam đã xây dựng qui trình điều chế sernidazol một thuốc dùng trong trị lỵ và một số bệnh ký sinh trùng. Qui trình đã được tối ưu hóa nên đơn giản, phù hợp với điều kiện Việt Nam. Sản phẩm sernidazol tổng hợp đã được tiêu chuẩn hóa giúp ích cho việc ổn định qui trình sản xuất cũng như ổn định chất lượng sản phẩm. Từ khóa: Secnidazol, 2- methylimidazol, 2-methyl-5- nitroimidazol, tối ưu hóa, tiêu chuẩn hóa. ABSTRACT STUDY ON THE PREPATION AND STANDARDIZATION OF SECNIDAZOLE Truong Phuong, Tran Thị Truc Thanh, Pham Thi Dieu Thao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 305 - 312 Objective: Study on the process for producing secnidazole in Vietnamese condition. Built a standard for analyzing the product. Method: Establish the process for the preparation of secnidazole through two steps. Step 1: Nitrosation of 2- methyl imidazole to get 2-methyl-5- nitroimidazole. Step 2: Condensation of 2-methyl-5- nitroimidazole and propylene oxyde to obtain sernidazole. Establish the control process of secnidazole. Applying the above process for quantification on the product secnidazole and on the special medicine (Flagentyl 500mg). Result: We studied and established the optimal process prepation of secnidazole. Setting the standards for the material secnidazole. Conclusion: From cheap and available materials such as 2-methyl imidazole, propylene oxide, we have synthesized secnidazole which is a antidisentery and antiparasite drug.The procedure has been optimized for simplicity and compatibility with Vietnamese conditions. The product sernidazole has been standardized for stabilizing the producing process as well as the quality of product. Keywords: Secnidazole, 2- methylimidazole, 2-methyl-5- nitroimidazole, optimize, standardization. ĐẶT VẤN ĐỀ Lỵ Amíp là tình trạng nhiễm trùng ở ruột già do Entamoeba histolitica, bệnh xảy ra khấp nơi trên thế giới với tỷ lệ 10%. Ở Việt Nam, tỷ lệ người lành mang mầm bệnh có nơi lên đến 25%, tại thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ trung bình là 8%. Đây là một bệnh nhiễm ký sinh gây tử vong đứng thứ 2 trên thế giới chỉ sau sốt rét. *Bộ môn Hóa Dược - Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trương Phương ĐT: 0908553419 Email: phuongnq@hcm.fpt.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 306 Secnidazol là một dẫn chất nitroimidazol, để điều trị các bệnh do Amíp, Giardia và Trichomonas gây ra. Secnidazol có thời gian bán hủy dài nhất của nhóm nitroimidazol, đây là một lợi thế của hoạt chất này(3). Secnidazol được sử dụng từ lâu dưới nhiều biệt dược: Flagentyl, Cedazol.... và được đưa vào danh mục thuốc thiết yếu Việt nam lần thứ V. Tuy vậy, cho tới nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp secnidazol nào ở Việt Nam. Trong bài này chúng tôi thông báo các kết quả nghiên cứu tổng hợp secnidazol với hi vọng tạo thêm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp Dược Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Tổng hợp và xây dựng tiêu chuẩn secnidazol dược dụng, Nguyên liệu Nguyên liệu tổng hợp Acid formic, methanol, cloroform, acid sulfuric, acid nitric, acid acetic, amoniac (Trung quốc) tinh khiết hóa học. Nguyên liệu dùng cho kiểm nghiệm Isopropanol, Acetonitril, methanol (Merck,) dùng cho HPLC. Bản mỏng silicagel GF254 Secnidazol chuẩn (Aventis) 2- methylimidazol (Acros) tinh khiết phân tích. 2-methyl-5- nitroimidazol (Acros) tinh khiết phân tích. Thiết bị Quang phổ kế UV-VIS Shimadzu UV Probe 2550 HPLC Waters 2695 Đầu dò DAD Waters 2614 Màng lọc 0,45 µm (cellulose acétat) Sartorius Màng lọc 0,45 µm GHP Acrodisc 13 Cột sắc ký Phenoménex C18 15cm x 4,6 mm, 5 µm. Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp secnidazol Quá trình tổng hợp secniazol gồm 2 giai đoạn: - Điều chế 2-methyl-5- nitroimidazol(4) Điều chế secnidazol(2) Kiểm nghiệm secnidazol tổng hợp Secnidazol chưa có trong các dược điển nên chưa tiêu chuẩn chính thức. Trong phần này chúng tôi tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm trên cơ sở: Chuyên luận dược điển Việt Nam IV về metronidazol vì qui trình điều chế 2 chất này tương tự nhau Các tài liệu về tiêu chuẩn hóa và thẩm định qui trình kiểm nghiệm Các phân tích về qui trình tổng hợp secnidazol. + HNO3 H2SO4 N H N CH3 N O O N H N CH3 N H N CH3 N O O O CH3 + N NN O O CH3 CH3 OH Acid formic Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 307 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tổng hợp 2-methyl-5- nitroimidazol Khảo sát sơ bộ Trong một bình cầu hai cổ gắn sinh hàn hồi lưu, cho vào 5 mL acid sulfuric đậm đặc, thêm tiếp 20,5 g 2-methylimidazol. Lắc đều và làm lạnh hỗn hợp. Chuẩn bị một hỗn hợp gồm 40 ml acid nitric và 75 ml acid sulfuric. Phối hợp từ từ hỗn hợp hai acid này vào bình cầu hai cổ ở trên. (Thao tác trong tủ hốt và làm lạnh do phản ứng xảy ra mãnh liệt). Sau đó duy trì nhiệt độ phản ứng ở khoảng 40oC. Ngừng phản ứng sau 7h. Trung hòa hỗn hợp sau phản ứng bằng dung dịch amoniac 25% (v/v), thu được tủa. Tái kết tinh sản phẩm trong dung dịch methanol - nước (7: 3). Thu được 16,6g 2-methyl- 5-nitro-imidazol, nóng chảy ở 254-256 oC. Hiệu suất 54% Khảo sát tỉ lệ thể tích giữa acid nitric HNO3 và aid sulfuric H2SO4 Tiến hành theo các điều kiện: tỉ lệ mol giữa 2-methylimidazolvà acid nitric HNO3: 1:2,5; thời gian phản ứng t=7h Thay đổi tỷ lệ thể tích giữa acid nitric và acid sulfuric lần lượt như sau 40ml: 40ml (1:1); 40ml:80ml (1:2); 40ml:120ml (1:3); 80ml:120ml (2:3). Kiểm tra sản phẩm trên bản mỏng với hệ dung môi: Cloroform: methanol = 9: 1 phát hiện vết bằng soi UV 254 Bảng 1. Kết quả khảo sát tỉ lệ thể tích giữa acid nitric và acid sulfuric Tỉ lệ thể tích giữa HNO3 và H2SO4 1:3 1: 2 2: 3 1: 1 9,52 16,66 20,31 18,84 8,79 17,36 19,97 18,30Khối lượng thực tế (g) 9,65 18,01 20,54 18,79 Khối lượng lý thuyết (g) 31,75 27,69 52,47 63,97 59,34 30,67 54,68 62,89 57,65Hiệu suất (%) 30,39 56,72 64,69 59,21 Hiệu suất trung bình (%) 29,58 54,62 63,85 58,73 Nhận xét: tỉ lệ thể tích giữa acid nitric và acid sulfuric ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng. Tỉ lệ tối ưu khảo sát được là 2: 3. Khảo sát tỉ lệ mol giữa 2-methyl imidazol và acid nitric Tiến hành theo các điều kiện: tỉ lệ mol giữa 2- methyl imidazol và acid nitric: 1:2,5; thời gian phản ứng t=7h; tỉ lệ acid nitric và acid sulfuric là 2: 3. Thay đổi tỷ lệ mol giữa 2 -methyl imidazol và acid nitric lần lượt như sau 20,5g: 16ml (1:1); 20,5g:24ml (1:1,5); 20,5g:32ml (1:2); 20,5g: 40ml (1:2,5); 20,5g:48ml(1:3). Bảng 2. Kết quả khảo sát tỉ lệ mol giữa 2- methylimidazol và acid nitric Tỉ lệ mol giữa 2- methylimidazol và HNO3 1: 1 1: 1,5 1: 2 1:2,5 1: 3 3,95 10,86 23,94 25,01 22,32 5,04 11,23 23,09 24,36 23,16 Khối lượng thực tế (g) 4,58 11,84 24,57 22,43 23,01 Khối lượng lý thuyết (g) 31,75 12,44 34,20 75,40 78,77 70,29 15,87 35,37 72,72 76,72 72,94Hiệu suất (%) 14,43 37,29 77,38 70,65 72,47 Hiệu suất trung bình (%) 14,25 36,62 75,17 75,38 71,90 Nhận xét: hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào tỉ lệ mol giữa 2-methylimidazol và acid nitric. Từ thực nghiệm trên, tỉ lệ tối ưu khảo sát được là 1: 2,5. Khảo sát thời gian phản ứng Tiến hành theo các điều kiện: Tỉ lệ thể tích giữa acid nitric và acid sulfuric là 2:3 Tỉ lệ mol giữa 2-methylimidazol và acid nitric là: 1:2,5 Thay đổi thời gian: 5h, 7h, 9h, 12h, 15h. Bảng 3. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng Thời gian phản ứng (h) 5 7 9 12 15 13,75 19,69 20,64 24,77 20,75 11,23 20,63 19,88 25,98 20,56Khối lượng thực tế (g) 10,94 18,41 19,37 26,45 19,98 Khối lượng lý thuyết (g) 31,75 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 308 Thời gian phản ứng (h) 5 7 9 12 15 43,31 64,88 65,01 78,02 65,35 35,37 61,83 62,61 81,76 64,76Hiệu suất (%) 34,56 57,98 61,01 83,31 62,93 Hiệu suất trung bình (%) 37,73 61,56 62,87 81,03 64,35 Nhận xét: thời gian phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất và thời gian tối ưu là 12h. Điều chế secnidazol Khảo sát sơ bộ Trong một bình cầu hai cổ hòa tan 3,1 g 2- methyl-5-nitro-imidazol (0,025mol) trong 15 ml acid formic 85%, làm lạnh dung dịch thu được ở khoảng 14oC. Thêm 3,5 ml (0,05mol) propylen oxyd trong vòng 15 phút. Duy trì nhiệt độ hỗn hợp ở khoảng 14 oC. Ngừng phản ứng sau 7 h. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 20ml nước lạnh. Thêm từ từ dung dịch amoniac 25% (pH dung dịch không quá 8). Tủa tạo thành. Rửa tủa với 20 ml nước lạnh và sấy khô. Tái kết tinh trong toluen, thu được 2,31g secnidazol, nóng chảy ở 76oC. Hiệu suất 15,8% Kiểm tra sản phẩm trên bản mỏng với hệ dung môi: Cloroform: methanol = 9: 1 phát hiện vết bằng soi UV 254 Khảo sát tỉ lệ mol giữa 2- methyl- 5-nitro imidazol và propylen oxyd Tiến hành theo các điều kiện: Thời gian phản ứng t=7h; dung môi: acid formic Thay đổi tỉ lệ mol giữa 2- methyl- 5-nitro imidazol và propylen oxyd: 1: 2, 1: 3, 1: 5, 1,7 Bảng 4. Kết quả khảo tỉ lệ mol giữa 2- methyl- 5- nitro imidazol và propylen oxyd Tỉ lệ mol giữa 2- methyl- 5- nitro imidazol và propylen oxyd 1: 2 1: 3 1: 5 1:7 2,31 3,12 6,89 5,67 3,57 4,35 7,12 5,32 Khối lượng thực tế (g) 2,94 2,99 7.58 5,21 Khối lượng lý thuyết (g) 18,5 12,48 16,86 37,24 30,6 19,29 23,51 38,49 28,75Hiệu suất (%) 15,89 16,16 40,97 28,1 Hiệu suất trung bình (%) 15,87 18,84 38,9 29,15 Nhận xét: Các kết quả trên cho thấy tỉ lệ mol giữa 2-methyl-5-nitro-imidazol và propylen oxyd có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng và tỉ lệ mol 1:5 cho kết quả tốt. Khảo sát thời gian phản ứng Tiến hành theo các điều kiện:; dung môi: acid formic; tỉ lệ mol giữa 2-methyl-5-nitro- imidazol và propylen oxyd 1:5 Thay đổi thời gian phản ứng: 7h, 10, 12, 14h. Bảng 5. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng Thời gian phản ứng (h) 7 10 12 14 Khối lượng thực tế (g) 5,98 5,07 4,86 6,21 5,76 4,94 8,85 10,05 10,17 7,94 6,13 6,58 Khối lượng lý thuyết (g) 18,5 Hiệu suất (%) 32,32 27,41 26,27 33,57 31,14 26,70 47,84 54,32 54,97 42,92 31,14 35,57 Hiệu suất trung bình (%) 28,67 30,47 52,38 36,54 Nhận xét: thời gian tối ưu cho phản ứng tổng hợp secnidazol là 12h. Khảo sát dung môi Tiến hành theo các điều kiện: Thời gian phản ứng t=12h; tỉ lệ mol giữa 2- methyl-5-nitro-imidazol và propylen oxyd: 1: 5 Thay đổi: Dung môi: acid formic và acid acetic Bảng 6. Kết quả khảo sát dung môi Dung môi Acid acetic Acid formic 2,18 8,85 1,95 10,05 Khối lượng thực tế (g) 1,75 10,17 Khối lượng lý thuyết (g) 18,5 11,78 47,84 10,54 54,32 Hiệu suất (%) 9,46 54,97 Hiệu suất trung bình (%) 10,59 52,38 Nhận xét: acid formic hòa tan các nguyên liệu hoàn toàn hơn nên cho kết quả tốt hơn. Xây dựng tiêu chuẩn secnidazol Cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cho secnidazol là chuyên luận dược điển Việt Nam IV về metronidazol(5). Sau khi tiến hành kiểm nghiệm các giời hạn tạp chất kết quả cho thấy Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 309 secnidazol tổng hợp đạt tất cả tiêu chuẩn qui định cho metronidazol vì thế chúng tôi chọn các chỉ tiêu tương tự metronidazol (trừ tạp chất liên quan). C7 H11N3O3 P.t.l: 185,18 Secnidazol là 2-Dimethyl-5-nitro-1H- imidazol-1-ethanol; phải chứa từ 97,0 đến 101,0% C7 H11N3O3, tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng. Khó tan trong nước, trong aceton, ethanol 96% và trong methylen clorid. Định tính A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của secnidazol chuẩn (ĐC). B. Nhiệt độ nóng chảy:74- 76oC Độ trong và màu sắc của dung dịch Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT) và pha loãng thành 20 ml với cùng dung môi. Dung dịch thu được không được đục hơn hỗn dịch chuẩn đối chiếu số II và có màu không được đậm hơn dung dịch màu mẫu. Tạp chất liên quan Xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Xem phần định lượng). Trên mẫu tổng hợp sắc ký đồ chỉ cho 1pic duy nhất cò thời gian lưu trùng với pic của secnidazol chuẩn. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu. Lấy 1,0 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 3. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5%. (1,000 g; 100 – 105 oC; 3 giờ). Tro sulfat Không được quá 0,1%. Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát phương pháp định lượng secnidazol bằng HPLC. Khảo sát các điều kiện phân tích - Cân chính xác khoảng 2,5 mg secnidazol và 2,5 mg metronidazol làm mẫu chuẩn. Phối hợp đồng lượng vào một bình định mức 20ml, thêm methanol đến khoảng 15ml, lắc đều và bổ sung đến vừa đủ 20ml. Nồng độ dung dịch này là 125 mcg/ml. - Lọc dung dịch này qua màng lọc 0,45 µm. - Thử nghiệm hệ dung môi. Bảng 7. Các hệ sắc ký thử nghiệm Pha động Thử nghiệm Thành phần Tỉ lệ 1 ACN/H2O 50/50 2 MeOH/ H2O 30/70 3 MeOH/ H2O 40/60 4 MeOH/ H2O 50/50 Nhận xét: pha động của thử nghiệm 2 có độ phân giải và thời gian phân tích tốt, Kiểm tra tính tương thích của hệ HPLC Cân chính xác khoảng 2,5 mg secnidazol và 2,5 mg metronidazol làm mẫu chuẩn. Cho vào bình định mức 20ml, thêm methanol đến khoảng 15 ml, lắc đều và bổ sung đến vừa đủ 20 ml (dung dịch mẫu chuẩn). Cân chính xác khoảng 2,5 mg secnidazol và 2,5 mg metronidazol làm mẫu thử. Cho vào bình định mức 20 ml, thêm methanol đến khoảng 15 ml, lắc đều và bổ sung đến vừa đủ 20 ml (dung dịch mẫu thử).Lọc dung dịch này qua màng lọc 0,45 µm. N NN O O CH 3 CH 3 O H Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 310 Tiêm 6 lần dung dịch mẫu chuẩn gồm chuẩn nội (metronidazol) và chuẩn ngoại (secnidazol) nồng độ 125 mcg/ mL. Tính CV% của các thông số kỹ thuật. Tiêm 6 lần dung dịch mẫu thử gồm chuẩn nội (metronidazol) và sản phẩm tổng hợp (secnidazol) nồng độ 125 mcg/ mL. Tính CV% của các thông số kỹ thuật Bảng 8. Kết quả kiểm tra tính tương thích của hệ HPLC trên mẫu chuẩn Lần tiêm tR1 (Metronidazol) tR2 (Secnidazol mẫu chuẩn) tR1/tR2 Spic1 (Metronidazol) Spic2(Secnidazol mẫu chuẩn) Spic1/Spic2 1 3,356 5,145 0,6523 4889423 3753659 0,7677 2 3,352 5,135 0,6528 4905022 3804402 0,7756 3 3,345 5,139 0,6509 4924126 3765175 0,7646 4 3,347 5,132 0,6522 4957212 3781286 0,7628 5 3,348 5,136 0,6519 4948613 3797008 0,7673 6 3,345 5,129 0,6522 4909326 3769142 0,7678 Trung bình 3,349 5,136 0,6520 4922287 3778445 0,7676 SD 0,004 0,005 0,001 24021,88 17811,08 0,004 CV% 0,119 0,099 0,088 0,488 0,471 0,522 Bảng 9. Kết quả kiểm tra tính tương thích của hệ HPLC trên mẫu thử Lần tiêm tR1 (Metronidazol) tR3 (Secnidazol mẫu thử) tR1/tR3 Spic1 (Metronidazol) Spic3 (Secnidazol mẫu thử) Spic1/Spic3 1 3,357 5,145 0,6525 3754296 4049069 1,0785 2 3,346 5,132 0,6520 3757658 4056516 1,0795 3 3,359 5,142 0,6532 3773936 4054206 1,0743 4 3,348 5,135 0,6520 3774461 4064450 1,0768 5 3,352 5,140 0,6521 3774248 4065244 1,0771 6 3,355 5,151 0,6513 3761875 4065121 1,0806 Trung bình 3,353 5,141 0,6522 3766079 4059101 1,0778 SD 0,005 0,006 0,001 8427,622 6243,302 0,002 CV% 0,139 0,122 0,089 0,224 0,154 0,191 Kết quả bảng trên cho thấy mẫu chuẩn và mẫu thử thoả mãn yêu cầu về tính tương thích hệ thống với CV% <2%. Thẩm định quy trình phân tích Tính tuyến tính Cân chính xác khoảng 0,0625g metronidazol làm chuẩn nội. Cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol đến khoảng 90 ml, lắc đều và bổ sung đến vừa đủ 100 ml (dung dịch mẹ metronidazol). Cân chính xác khoảng 0,2500 g secnidazol làm chuẩn. Cho vào bình định mức 500 ml, methanol đến khoảng 490 ml, lắc đều và bổ sung đến vừa đủ 100 ml (dung dịch mẹ secnidazol). Từ 2 dung dịch mẹ trên, tiến hành pha các dung dịch có nồng độ secnidazol lần lượt là 250, 225, 175, 125, 100, 75, 25 µg/mL và nồng độ metronidazol là 125 µg/mL (pha loãng với methanol). Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 µm Tiêm các dung dịch (mỗi dung dịch 3 lần) và lấy giá trị trung bình của diện tích pic. Bảng 10. Kết quả tính tuyến tính của mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ ml) S1 Metronidazol S2 Secnidazol S1 /S2 S1 /S2 trung bình 4030090 704262 0,1748 4041874 706569 0,1748 25 4034385 698494 0,1731 0,1742 4079440 2108760 0,5169 4009148 2069935 0,5163 75 4003424 2065886 0,5160 0,5164 4026887 2763083 0,6862 4023343 2760994 0,6862 100 4030156 2760951 0,6851 0,6858 4052315 3467470 0,8557 4070750 3487658 0,8568 125 4072470 3486515 0,8561 0,8562 4019222 4855835 1,2082 4030105 4851099 1,2037 175 4029216 4867421 1,2080 1,2066 225 4014730 6215752 1,5482 1,5484 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 311 Nồng độ (µg/ ml) S1 Metronidazol S2 Secnidazol S1 /S2 S1 /S2 trung bình 4016140 6227808 1,5507 4024081 6222055 1,5462 4014172 6879798 1,7139 4019257 6891470 1,7146 250 4022010 6893047 1,7138 1,7141 yâ = 0,0069x + 0,0014 R2 = 1 0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 0 50 100 150 200 250 300 Concentration (μg/ml) ra pp or t Biểu đồ 1. Đường giai mẫu tuyến tính của giai mẫu có nồng độ từ 25 đến 250 µg/ m - # Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy (phép kiểm Student). tb=0.579798 < t0,05(N-2)=2,5706: b không có ý nghĩa thống kê. ta=435,21 > t0,05(N-2)=2,5706: b có ý nghĩa thống kê. Vậy: # = 0,0069x - # Thử nghiệm tính tương thích của phương trình hồi quy (phép kiểm Fisher). F=189405 > F (1,5)=6,6079: phương trình hồi quy tương thích. Nhận xét: các kết quả phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ diện tích pic và nồng độ có tương quan tuyến tính. Vậy, quy trình này thỏa mãn yêu cầu về tính tuyến tính của một quy trình phân tích và khoảng tuyến tính là 25 – 250 µg/ L. Độ tin cậy Cân chính xác khoảng 62,5 mg secnidazol mẫu chuẩn và 62,5 mg metronidazol mẫu chuẩn. Phối hợp đồng lượng vào bình định mức 50ml, thêm methanol đến khoảng 45 ml, lắc đều, và bổ sung đến vừa đủ 50 ml. Tiến hành song song 6 mẫu tương tự nhau. Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 µm Tiêm lần lượt các dung dịch và tính CV% Phương pháp định lượng được xem là có tính lặp lại khi CV% # 2%. Bảng 11. Kết quả độ lặp lại Thử nghiệm S1 Metronidazol S2 Secnidazol S1 /S2 C (µg/ mL) Hàm lượng (g/100g) 1 4292288 3492846 0,8137 117,9347 94,3477 2 4515363 3670038 0,8128 117,7955 94,2364 3 4432980 3606355 0,8135 117,9027 94,3221 4 4488403 3659012 0,8152 118,1471 94,5176 5 4403693 3583456 0,8137 117,9332 94,3465 6 4428716 3599116 0,8127 117,7793 94,2234 Trung bình 4426907 3601804 0,8136 117,9154 94,3323 SD 77855,7 63506 0