Nghiên cứu phát hiện CD89 như một marker mới trong dự đoán tiến triển suy thận ở bệnh thận IgA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Thận Niệu 2012 223 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CD89 NHƯ MỘT MARKER MỚI TRONG DỰ ĐOÁN TIẾN TRIỂN SUY THẬN Ở BỆNH THẬN IgA Vương Tuyết Mai*, Leonid Padyukov** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh thận IgA là một trong những dạng thường gặp nhất của viêm cầu thận, đặc trưng bởi sự lắng đọng IgA trong khu vực gian mạch cầu thận. Lưu thông trong huyết tương, globulin miễn dịch A (IgA) được gắn với thụ thể Fc alpha (FCAR hoặc CD89) thành phức hợp hòa tan. Phức hợp sCD89-IgA đã được chứng minh có liên quan đến hình thành bệnh thận IgA. Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu mối liên quan của các điểm biến đổi của gen FCAR với sự hình thành và tiến triển bệnh thận IgA cũng như sự ảnh hưởng của nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh của bệnh nhân bệnh thận IgA. Đối tượng và phương pháp: Phương pháp ELISA gián tiếp phát hiện sCD89-IgA trong huyết thanh lần đầu tiên được áp dụng cho nghiên cứu trên 177 bệnh nhân bệnh thận IgA và 115 người khỏe mạnh. Chúng tôi cũng phân tích nồng độ sCD89-IgA trong 62 mẫu huyết thanh từ những bệnh nhân bệnh thận IgA được theo chiều dọc trong 15 năm. Kiểu gen của 05 điểm biến đổi (SNPs) của gen FCAR được thực hiện trong tất cả 689 mẫu DNA bằng phương pháp phân tích di truyền allele dựa vào TaqMan. Kết quả: Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ thấp của phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển nặng với nhóm không tiến triển (p = 0,002, Mann-Whitney thử nghiệm). Những bệnh nhân có chức năng thận ổn định không tiến triển bệnh có nồng độ ổn định sCD-IgA cao, trái ngược với nồng độ thấp của sCD89 trong nhóm tiến triển suy thận nặng, kết quả được nghiên cứu trên những bệnh nhân có mẫu huyết thanh theo dõi từ 5 đến 15 năm. Kết luận: Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phức hợp sCD89-IgA có vai trò quan trọng trong dự đoán tiến triển suy thận ở bệnh thận IgA. Từ khoá: Gen FCAR, phức hợp sCD-IgA, bệnh thận IgA, điểm biến đổi gen, SNP. ABSTRACT CD89 AS ONE OF BIOMARKERS FOR PROGRESSIVE RENAL FAILURE OF IgA NEPHROPATHY Vuong Tuyet Mai, Leonid Padyukov * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 3- 2012: 223 - 228 Background:IgA nephropathy is the most common form of glomerulonephritis, characterized by IgA deposition in the mesangial region of the glomeruli. Fc alpha receptor (FcαRI or CD89) is involved in immunoglobulin A (IgA) complex formation in the circulation. CD89-IgA complexes have been suggested to be implicated in development of IgA nephropathy. Objective:Investigate genetic variations of the Fc alpha receptor(FCAR) gene in relation to susceptibility to IgAN and the expression of soluble IgA receptor (sCD89) in plasma of IgAN patients with or without disease progression and in healthy controls. * Bộ môn Nội ĐH Y Hà Nội. ** Viện Karolinska, Thụy Điển. Tác giả liên lạc: TS. Vương Tuyết Mai. ĐT: 0915518775. Email: vuongtuyetmai@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012 Chuyên Đề Thận Niệu 2012 224 Patients and methods. Two hundred and twelve unrelated patients (146 males and 66 females), mean age 38.5±14.4 years (range 17 to 77 years) with biopsy-proven IgAN and 477 healthy (321 males and 156 females), mean age 44.8 ± 13.0 years (range 18 to 80 years) were included in the study. A sandwich ELISA method was developed. Soluble CD89 (sCD89) bound to IgA in human sera was analyzed in 177 IgAN patients and 115 healthy controls. We also analysis the levels of sCD89 of 62 serum samples from seven longitudinal IgAN patients, who had followed up 15 years. Genotyping for 5 single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FCAR gene was performed in all samples using a TaqMan allelic discrimination assay. Results. There was a significant difference between the levels of sCD89-IgA complexes in IgAN patients with and without disease progression (p=0.002, Mann-Whitney Test) and none significant difference was found in the disease control group (p=0.326, Mann-Whitney Test). The patients with non-progression had stable with high level of sCD89, in contrast to low level of sCD89 in progression group during up to 15 years of follow-up with repeated measures data. Conclusions. Our data ssuggested sCD89-IgA complexes in plasma as one of possible biomarkers for progressive renal failure of IgA Nephropathy. Key words: FCAR gene, sCD89-IgA, IgA nephropathy, polymorphism, SNP ĐẶT VẤN ĐỀ Trong bệnh lý cầu thận, bệnh thận IgA là một trong những nhóm bệnh thường gặp nhất với tiêu chẩn đoán xác định bệnh là sự lắng đọng của IgA tại gian mạch cầu thận. Sau thời gian mắc bệnh từ 10-20 năm, khoảng 30% bệnh nhân có thể sẽ tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối (end stage renal disease-ESRD) đòi hỏi phải điều trị thận thay thế(1; 2). Khi lưu thông trong huyết thanh, IgA gắn với CD89 thành một phức hợp hòa tan, hoặc với hoặc các thụ thể tế bào(3; 4). Phức hợp IgA-CD89 được xác định có vai trò quan trọng trong lắng đọng IgA ở gian mạch cầu thận(5). Chúng tôi đặt giả thiết rằng phức hợp sCD89-IgA hoà tan trong huyết thanh có thể là maker quan trọng cho sự hình thành bệnh thận IgA và cũng có thể là yếu tố nguy cơ tiến triển đến suy thận ở bệnh nhân bệnh thận IgA. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu mối liên quan của các điểm biến đổi của gen FCAR với sự hình thành và tiến triển bệnh thận IgA cũng như sự ảnh hưởng của nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh của bệnh nhân bệnh thận IgA. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiện trên 689 mẫu DNA di truyền từ hai trăm mười hai bệnh nhân bệnh thận IgA không có quan hệ huyết thống (146 nam và 66 nữ), tuổi trung bình 38,5 ± 14,4 (17 đến 77 tuổi) và 477 đối tượng khỏe mạnh (321 nam và 156 nữ), tuổi trung bình 44,8 ± 13,0 (18 đến 80 tuổi). Tách chiết DNA được thực hiện bằng phương pháp “salting-out” từ máu toàn phần đã được giữ trong trong EDTA hoặc từ phân đoạn tế bào máu có nhân. Sau tách chiết chất lượng DNA hoà tan được xác định ở bước đặt 260/280 nm với spectrophotometer DU600 series (Beckman Coulter, Bromma, Thụy Điển). Phương pháp phân tích di truyền Allele dựa vào TaqMan (Allele-specific TaqMan assays của Applied Biosystems, Foster City, Hoa Kỳ) cũng được sử dụng cho việc xác định kiểu gen của rs thuộc gen FCAR. Kỹ thuật ELISA gián tiếp được sử dụng để phát hiện phức hợp CD89-IgA trong huyết thanh. Kháng thể 1 được sử dụng là kháng thể đơn dòng của chuột CD89 (A3) người (Abcam) và kháng thể thứ 2 được sử dụng là kháng thể thỏ cộng hợp alkaline phosphatase kháng IgA người (Dako, Glostrup, Denmark). Các mẫu huyết thanh được pha loãng ở hai mức độ (1:10 và 1:1000) và pha loãng 4 mức độ theo cơ số 10 (1:10-1:10000). Phản ứng với giữa alkaline phosphatase và cơ chất (Sigma-Aldrich) được đo ở bước sóng (OD) 405 nm trên máy Multiscan MS spectrophotometer (Labsystems, Finland). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Thận Niệu 2012 225 Để so sánh tỷ lệ phần trăm kiểu gen, allele và kiểu hình, test X bình phương và Fisher’s exact được sử dụng với phần mềm SPSS. Haplotype được phân tích bằng chương trình HaploView. KẾT QUẢ Tỷ lệ kiểu gen và allele của SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA Bảng 1: Tỷ lệ kiểu gen của SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA và nhóm chứng. SNPs Tỷ lệ kiểu gen ở mô hình đồng phối hợp gen FCAR rs11084377 Total AA AG GG X2 p-value Chứng 312 36 (11.5%) 130 (41.7%) 146 (46.8%) Nhóm n=451 Bệnh 139 6 (4.3%) 67 (48.2%) 66 (47.5%) 6.335 0.04 FCAR rs4806605 Total CC CT TT Chứng 310 207 (66.8%) 93 (30%) 10 (3.2%) Nhóm n=450 Bệnh 140 96 (68.6%) 40 (28.6%) 4 (2.8%) 0.155 0.93 FCAR rs10402324 Total AA AG GG Chứng 302 135 (44.7%) 138 (45.7%) 29 (9.6%) Nhóm n=444 Bệnh 142 51 (35.9%) 71 (50%) 20 (14.1%) 3.918 0.14 FCAR rs1865097 Total AA AG GG Chứng 312 33 (10.6%) 143 (45.8%) 136 (43.6%) Nhóm n=443 Bệnh 131 20 (15.3%) 59 (45%) 52 (39.7%) 2.039 0.36 FCAR rs16986050 Total AA AG GG Chứng 319 210 (65.8%) 93 (29.2%) 16 (5%) Nhóm n=456 Bệnh 137 90 (65.7%) 44 (32.1%) 3 (2.2%) 2.117 0.35 Bảng 2: Tỷ lệ allele của các SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA và nhóm chứng. Gen FCAR SNPs Số allele bệnh, chứng Tỷ lệ allele bệnh, chứng X2 P value rs11084377 309:117, 643:281 0.725, 0.696 1.218 0.27 rs4806605 88:342, 176:746 0.205, 0.191 0.353 0.55 rs10402324 158:272, 288:608 0.367, 0.321 2.756 0.09 rs1865097 144:256, 305:617 0.360, 0.331 1.060 0.30 rs16986050 338:68, 755:173 0.833, 0.814 0.684 0.41 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012 Chuyên Đề Thận Niệu 2012 226 Nồng độ phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối và nhóm không có suy thận Biểu đồ: Phân bố nồng độ của phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối và nhóm không có suy thận. Phân bố cho thấy rất rõ ở nhóm bệnh thận IgA không tiến triển đến suy thận có nồng độ phức hợp sCD89-IgA cao hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến ESRD. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển một phương pháp mới để phát hiện CD89 hòa tan trong huyết thanh thông qua xác định phức hợp sCD89-IgA trong huyết thanh người và phương pháp này đã được áp dụng cho 177 bệnh nhân bệnh thận IgA và 115 người khỏe mạnh. Trước chúng tôi đã có nhiều nhóm nghiên cứu khác đã cố gắng để định lượng được sCD89 trực tiếp trong huyết thanh nhưng đã thất bại. Thực tế cho thấy rằng có thể là hầu như tất cả các sCD89 phân tử đều kết hợp chặt chẽ để IgA trong phức hợp CD89-IgA và chỉ một phần nhỏ của phân tử sCD89 được tiếp xúc với kháng thể. Do đó khi phức hợp này đã được phân ly trong ống nghiệm bằng chất tẩy rửa mạnh do vậy mà phản ứng trong trường hợp này không thực hiện được vì sự biến tính của kháng thể. Đây rất có thể là lý do tại sao sCD89 chưa được công bố định lượng ở huyết thanh người cho dù những nghiên cứu về sCD89 đã được tiết hành rất đa dạng trong phòng thí nghiệm và trong những nghiên cứu thực nghiệm trên chuột (transgenic mice)(5). Western blotting cũng có hiệu quả áp dụng cao nhưng không phải là một phương pháp định lượng chính xác. Chính vì vậy chúng tôi đã quyết định giải quyết vấn đề bằng cách định lượng phức hợp sCD89-IgA thay vì sCD89 phân tử đơn độc, thông qua việc sử dụng các kháng thể kháng IgA là một loại kháng thể thứ hai trong một sandwich ELISA. Kết hợp với sCD89 huyết thanh với một kháng thể đặc hiệu thứ Nhóm bệnh thận IgA không có tiến triển suy thận. Nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến ESRD. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Thận Niệu 2012 227 nhất, đơn dòng kháng thể CD89 đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng. Từ những nghiên cứu bước đầu thành công đã cho thấy phương pháp này có thể được sử dụng để phát hiện lưu hành sCD89 trong huyết thanh/plasma trong nhiều loại bệnh lý khác nhau. Kết quả nghiên cứu của của chúng tôi cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ thấp của phức hợp sCD89-IgA trong huyết thanh của bệnh nhân bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối so với nhóm chứng. Điều quan trọng là xét nghiệm cùng thời điểm nồng độ phức hợp sCD89-IgA và creatinine huyết thanh trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối và nhóm không có suy thận cho thấy phân bố nồng độ của phức hợp sCD89-IgAổn định ở mức thấp trong khi nồng độ creatinine huyết thanh trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối. Ngược lại nhóm không có suy thận thì nồng độ sCD89-IgA ổn định ở mức cao trong giai đoạn theo dõi liên tiếp từ 5-15 năm. Khi bắt bắt đầu tiến hành nghiên cứu, bước đầu tiên, chúng tôi xác định kiểu gen của FCAR và phân tích sự phân bố ở bệnh nhân bệnh thận IgA và người khoẻ mạnh. Việc lựa chọn maker dựa trên những kinh nghiệm của chúng tôi ở những nghiên cứu trước khi đã xác định kiểu gen trên những vị trí khác nhau của gen và chọn SNP ở các vị trí khác nhau sao cho bao phủ được hầu hết chiều dài của gen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự tái tổ hợp gen tương đối thấp ở chủng tộc da trắng: trong tổng số 32 tái tổ hợp gen có thể có chúng tôi ghi nhận 8 tái tổ hợp là phổ biến nhất trong nhóm đối tượng nghiên cứu. Bằng chứng là LD rất mạnh ở khu vực này, như vậy về mặt lý thuyết là tăng khả năng cho sự phát hiện mối liên quan của SNP với bệnh thận IgA hoặc haplotype. Tuy nhiên chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong tỷ lệ kiểu gen và allele giữa nhóm bệnh nhân bệnh thận IgA và nhóm chứng. Điều quan trọng nhất của nghiên cứu là cho thấy là nồng độ huyết thanh của sCD89-IgA là ổn định ở mức thấp ở những bệnh nhân bị bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối và liên tục cao ở bệnh nhân bị bệnh thận IgA nhưng triệu chứng ổn định và không có dấu hiệu tiến triển các cơ chế đằng sau tác dụng này vẫn chưa rõ ràng. Chúng tôi suy đoán rằng có thể sự thiếu hụt sCD89 đã là yếu tố tham gia vào làm tăng sự tiến triển nặng của bệnh nhân bệnh thận IgA và phức hợp này có thể được sử dụng như một biomarker cho dự đoán sự tiến triển nặng ở những bệnh nhân viêm cầu thận IgA. KẾT LUẬN Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho phép kết luận rằng có mối liên quan giữa nồng độ thấp của phức hợp sCD89-IgA trong huyết tương và nguy cơ suy thận nặng của bệnh thận IgA. Có khả năng có sự tham gia của yếu tố gen di truyền trong tổng hợp và ảnh hưởng tới nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh. Những nghiên cứu tiếp theo về vai trò của gen FCAR và sự lưu hành phức hợp sCD89-IgA trong huyết thanh ảnh hưởng đến cơ chế bệnh sinh bệnh thận IgA rất cần được thực hiện. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Berthoux FC, Mohey H, Afiani A. Natural history of primary IgA nephropathy. Semin Nephrol 2008; 28: 4–9 2. Donadio JV, Grande JP. IgA nephropathy. N Engl J Med. Sep 5 2002;347(10):738-748. 3. Floege J, Feehally J. IgA nephropathy: recent developments. J Am Soc Nephrol. Dec 2000;11(12):2395-2403. 4. Van der Boog PJ, van Kooten C, de Fijter JW, Daha MR. Role of macromolecular IgA in IgA nephropathy. Kidney Int. Mar 2005;67(3):813-821. 5. Launay P, Grossetete B, Arcos-Fajardo M, et al. Fcalpha receptor (CD89) mediates the development of immunoglobulin A (IgA) nephropathy (Berger's disease). Evidence for pathogenic soluble receptor-Iga complexes in patients and CD89 transgenic mice. J Exp Med. Jun 5 2000;191(11):1999-2009.