Nhân trường hợp một gia đình mang cùng loại đột biến mất đoạn của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

NghiêncứuYhọc YHọcTP.HồChíMinh*Tập17*Số4*2013 214 NHÂN TRƯỜNG HỢP MỘT GIA ĐÌNH MANG CÙNG LOẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN CỦA BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE Đỗ Thị Thanh Thủy*, Trần Thụy Vân Ngọc ** TÓMTẮT Mục tiêu: Trình bày một gia đình với một trẻ nam 4 tuổi bị bệnh DMD và 6 thành viên nữ thuộc 3 thế hệ mang cùng một loại đột biến mất đoạn của gen dystrophin. Phương pháp: Nghiên cứu phân tích gen Dystrophin của một trường hợp bệnh DMD và các thành viên nữ trong gia đình của bệnh nhân này bằng phương pháp MLPA. Kết quả: Bệnh nhân nam 4 tuổi bị bệnh DMD, được phát hiện có đột biến mất đoạn gen dystrophin tại exon 8 và 9. Đồng thời 6 thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân, gồm: bà ngoại, mẹ bệnh nhân, 3 dì và 1 bé gái con dì cũng đều mang đột biến mất đoạn gen dystrophin tại các exon 8 và 9 tương tự như bệnh nhân Kết luận: Đây là một trường hợp hiếm gặp và kỹ thuật MLPA đã cho thấy những ưu điểm trong phát hiện đột biến mất đoạn trong gen dystrophin và phát hiện người nữ mang gen bệnh, giúp cho công tác tư vấn di truyền và là cơ sở cho chẩn đoán trước sinh ở thai phụ, nhằm giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD), Kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò (MLPA), đoạn dò. ABSTRACT PRESENTING A FAMILY CARRYING THE SAME DELETION MUTATIONS OF THE DYSTROPHIN GENE Đo Thi Thanh Thuy, Tran Thuy Van Ngoc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - No 4 - 2013: 213 - 217 Background:Aim: Presenting a family with a 4-year-old male with DMD and 6 female members of 3 generations carrying the same deletion mutations of the dystrophin gene Method: Analyze the dystrophin gene of the boy with DMD and the females in the family by MLPA method. Result: the 4 years old boy with DMD has deletion mutations in exon 8 and 9 of dystrophin gene and 6 other female members in the patient’s family, including his grandmother, his mother, 3 aunts and 1 aunt’s girl also carry the same kinds of deletion mutation in the dystrophin gene as patient’s. Conclusion: This is rare case. MLPA technique has shown the advantages of detecting deletion mutations in the dystrophin gene and discovered the female dystrophin mutation carriers, supporting the work of genetic counseling and helping prenatal diagnostic for patient’s pregnancies, reducing the burden of families and society and contributing to improving the quality of life for people. Key words: Duchene Muscular Dystrophy (DMD), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), probe. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy – DMD) là bệnh lý thần kinh cơ thường gặp với tần suất mắc bệnh khoảng 1/3500 trẻ trai sinh sống(4). Bệnh đặc trưng bởi tình trạng yếu cơ tiến triển tuần tiến. Trẻ mắc bệnh thường xuất hiện triệu chứng lâm sàng lúc 1 đến 3 tuổi, teo cơ là dấu hiệu thường gặp và giả phì đại cơ cẳng chân cũng khá phổ biến, phần lớn trẻ mất khả năng đi lại * Đại học Y Dược TP. HCM ** Bệnh viện Đa khoa Bình Dương, Bình Dương Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Thị Thanh Thủy ĐT: 0908487425 Email: [email protected] YHọcTP.HồChíMinh*Tập17*Số4*2013 NghiêncứuYhọc 215 ở tuổi 12 và tử vong trước 25 tuổi vì suy hô hấp và tổn thương cơ tim(1,6). Đây là bệnh di truyền lặn liên kết với NST giới tính X. Trên lý thuyết thì người mẹ mang gen bệnh kết hôn với người chồng khỏe mạnh sẽ có khả năng truyền gen bệnh cho 50% số con trai và 50% số con gái của họ(1,2). Do đặc điểm di truyền nên bệnh chỉ gặp ở trẻ trai mà rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gene bệnh từ mẹ là thể hiện bệnh, còn trẻ gái thì phải nhận cả 2 gen bệnh từ bố và mẹ mới thể hiện bệnh, tuy vậy trẻ trai bị bệnh thường chết trước tuổi lập gia đình nên khả năng kết hôn và sinh con rất hiếm gặp. Như vậy nhìn chung là người nam mang gen đột biến thì biểu hiện bệnh, còn người nữ mang gen đột biến chỉ là người mang mầm bệnh. Vì thế, việc phân tích gen xác định đột biến sẽ giúp chẩn đoán bệnh sớm để có hướng điều trị sớm và tích cực nhằm giảm các biến chứng cho bệnh nhân, ngoài ra còn giúp phát hiện các thành viên nữ mang gen bệnh (bà ngoại, mẹ, chị em gái, dì) trong gia đình bệnh nhân, phân tích sơ đồ phả hệ, giúp ích cho công tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, nhằm giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân và các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Địa điểm phân tích và lưu trữ mẫu Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP HCM. Cách lấy mẫu Lấy 2 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA. Mẫu được bảo quản ở 40C trước khi tách DNA và bảo quản ở -200C sau khi tách DNA. Phương pháp nghiên cứu Máu toàn phần được ly trích DNA từ bạch cầu bằng phương pháp kết tủa và ly tâm qua cột với hóa chất QIAamp DNA blood Mini kit (QIAGEN - Đức). Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA ở bước sóng 260/280nm (máy của hãng Eppendorf), chỉ chấp nhận các mẫu có tỉ số mật độ quang trong khoảng 1,8 – 2,0. Tiến hành phản ứng MLPA với 4 giai đoạn gồm: biến tính DNA, lai hóa, nối 2 đoạn dò gắn tín hiệu huỳnh quang và khuếch đại các đoạn dò này. Sau đó phân tách sản phẩm sau khuếch đại trên hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP và phân tích kết quả phát hiện đột biến nhờ phần mềm GeneMarker bản 1.6 (Softgenetics). Kết quả được hiển thị dưới dạng bảng và dạng biểu đồ sóng. Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) là sản phẩm của một đoạn dò. Kích thước của mỗi đỉnh tín hiệu được xác định nhờ so sánh với thang kích thước chuẩn và mẫu đối chứng để tính ra tỉ lệ DQ (Dosage quotients). Chiều cao của đỉnh tín hiệu thay đổi cho thấy sự thay đổi số bản sao của đoạn DNA có trình tự bổ sung với đoạn dò(7). KẾT QUẢ Bệnh nhân nam 4 tuổi, với triệu chứng lâm sàng phì đại cẳng chân 2 bên và hơi khó khăn khi đi lên xuống cầu thang, nồng độ creatin kinase trong huyết thanh là 33.480 U/L. Chẩn đoán lâm sàng là bị bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Bệnh nhân này được xét nghiệm phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA tại Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, với kết quả là bị đột biến mất đoạn gen dystrophin tại exon 8 và 9. Kết quả từ hình 1 cho thấy, không xuất hiện đỉnh tín hiệu của các đoạn dò tương ứng với exon 8 và 9 (DQ = 0), chứng tỏ bệnh nhân này bị mất đoạn gen đồng exon 8 và 9(8). Chúng tôi đã tiến hành phân tích gen của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân, bao gồm: bà ngoại, mẹ bệnh nhân, 3 dì và 1 em gái con dì. Kết quả trình bày trong hình 2. Kết quả từ Bảng 1 cho thấy, đỉnh tín hiệu của các đoạn dò (probe) tương ứng với exon 8 và 9 của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân (bà ngoại, mẹ, dì 1, dì 2, dì 3 và con gái của dì 3) NghiêncứuYhọc YHọcTP.HồChíMinh*Tập17*Số4*2013 216 bằng khoảng ½ so với mẫu đối chứng nữ (DQ tương ứng trong khoảng 0,441 đến 0,598), chứng tỏ các thành viên nữ bị mất đoạn dị hợp tử ở exon 8 và 9. Theo Hwa H.L. (2007), khi đỉnh tín hiệu của exon bị đột biến ở người nữ bằng ½ so với chứng nữ thì người nữ xem như bị đột biến mất đoạn dị hợp tử(3). Hình 1. Đột biến mất đoạn exon 8 và 9 của bệnh nhân Bà ngoại Người mẹ Dì thứ 1 Dì thứ2 Dì thứ 3 Con dì thứ 3 Hình 2. Đột biến mất đoạn exon 8 và 9 của các thành viên khác 8 9 Mẫu của bệnh nhân Mẫu chứng YHọcTP.HồChíMinh*Tập17*Số4*2013 NghiêncứuYhọc 217 Bảng 1: Tín hiệu đoạn dò trong đột biến mất đoạn của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân STT Probe Name Bin Size Bà ngoại Mẹ Dì thứ 1 Dì thứ 2 Dì thứ 3 Con Dì thứ 3 Theo Lai K.K. và cộng sự (2006), khi chiều cao đỉnh tín hiệu của người mẹ giảm từ 35 – 50% so với mẫu chứng nữ thì người mẹ này bị đột biến mất đoạn exon tương ứng với đỉnh tín hiệu đó(5). Khi phân tích phả hệ của gia đình, chúng tôi ghi nhận bệnh nhân này có 1 người cậu mắc bệnh DMD đã chết lúc 26 tuổi (được chẩn đoán tại Bệnh viện Trung ương Huế) và 1 người cậu 18 tuổi đang mắc bệnh DMD hiện không đi lại được (cũng được chẩn đoán tại Bệnh viện Trung ương Huế), vì hiện tại bệnh nhân này cũng không đi lại được nên chúng tôi không lấy được mẫu để làm xét nghiệm di truyền. Điều này chứng tỏ đã có yếu tố di truyền trong gia đình này (thể hiện qua sơ đồ 1). Như vậy, bà ngoại và mẹ của bệnh nhân là dị hợp tử bắt buộc và gen bệnh của con trai họ là do di truyền từ người mẹ, điều này hoàn toàn phù hợp khi phân tích gen của bà ngoại và mẹ bệnh nhân. Trong gia đình này còn có 1 thành viên nữ nhỏ tuổi nhất (9 tháng tuổi lúc tiến hành nghiên cứu, con của dì thứ 3) được phát hiện có mang NghiêncứuYhọc YHọcTP.HồChíMinh*Tập17*Số4*2013 218 gen đột biến mất đoạn trên gen dystrophin và mẹ của bé là dì thứ 3 của bệnh nhân trên cũng bị đột biến tương tự, như thế, bé gái này đã mang exon đột biến do thừa hưởng từ người mẹ. Ngoài ra, khi phân tích gen của 2 người dì còn lại cũng phát hiện đột biến mất đoạn trên exon 8 và 9 tương tự của bệnh nhân và các thành viên nữ khác trong gia đình. Sơ đồ 1: Nam bình thường Nam đồng hợp tử Nam đồng hợp tử đã chết Nữ bình thường ●Nữ dị hợp tử Như vậy, trong gia đình bệnh nhân này thì tất cả 6 thành viên nữ đều là người mang gen bệnh, riêng đối với bà ngoại thì 100% các con hiện có của bà đều mang gen bệnh do bà truyền cho (gồm 2 trai và 4 gái). Bệnh DMD là bệnh di truyền lặn liên kết NST giới tính X mà không có allen tương ứng trên NST Y, trên lý thuyết thì người mẹ mang gen bệnh kết hôn với người chồng khỏe mạnh sẽ có khả năng truyền gen bệnh cho 50% số con trai và 50% số con gái của họ(1,9). Tuy nhiên, ở gia đình này thì 100% số con trai của bà ngoại bị bệnh và 100% số con gái của bà cũng mang gen dị hợp tử. Điều này cho thấy khả năng lan truyền gen bệnh của người mẹ mang gen dị hợp tử là khá cao và khá nhanh trong cộng đồng. Gia đình này rất cần được tư vấn di truyền một cách kỹ lưỡng và chi tiết, nhất là tư vấn về công tác chẩn đoán trước sinh khi các dì lập gia đình và có ý định sinh con (vì các dì còn trong lứa tuổi sinh sản) để tránh sinh ra những đứa trẻ tiếp tục bị bệnh hoặc mang gen bệnh, nhằm làm giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. KẾT LUẬN Đây là một trường hợp hiếm gặp và kỹ thuật MLPA đã cho thấy những ưu điểm trong phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen dystrophin và phát hiện người nữ mang gen bệnh, giúp cho công tác tư vấn di truyền và là cơ sở cho chẩn đoán trước sinh ở thai phụ, nhằm giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Emery AEH (2002), “The muscular dystrophies”, Lancet, 359, pp. 687 – 695. 2. Harvey B.S. (1996), “Neuromuscular Disorders”, Nelson textbook of pediatrics, 15th edition, Vol 2, pp. 1746 – 1748. 3. Hwa HL, Chang YY, Chen CH et al. (2007), “Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification identification of deletions and duplications of the Duchenne muscular dystrophy gene in Taiwanese subjects”, J Formos Med Assoc, 106, pp. 339 – 346. 4. Kneppers ALJ, Ginjaar IB, Bakker E (2004), “Duchenne and Becker muscular dystrophy”, Molecular diagnosis of genetic diseases, Humana Press, New Jersey,2nd edition, pp. 311 – 342. 5. Lai KK., Lo I.F., Tong T.M. et al (2006), “Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)”, Clin Biochem, 39, pp. 367 – 372. 6. Patterson V., Morrison O., Hicks E. (1991), “Mode of death in Duchenne muscular dystrophy”, Lancet, 337, pp. 801 – 802. 7. Prior T.W. and Bridgeman S.J. (2005), “Experience and Strategy for the Molecular Testing of Duchenne Muscular Dystrophy”, Journal of Molecular Diagnostics, 7(3), pp. 317 – 326. 8. Schwartz M. and Duo M. (2004), “Multiplex ligation- dependent probe amplification is superior for detecting deletions/duplications in Duchenne muscular dystrophy”, Clin Genet., 67, pp. 189 – 191. 9. Tạ Thành Văn (2011), “Bệnh loạn dưỡng cơ Duchene và Becker”, Bệnh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, tr. 152 – 169.