Phân lập hai protoberberin alkaloid từ loài Bình vôi Cam bốt (Stephania cambodica Gagnep. Menispermaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 565 PHÂN LẬP HAI PROTOBERBERIN ALKALOID TỪ LOÀI BÌNH VÔI CAM BỐT (STEPHANIA CAMBODICA GAGNEP. MENISPERMACEAE) Mã Chí Thành*, Trần Hùng** TÓM TẮT Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập các alkaloid của Bình vôi Cam bốt để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiêu chuẩn hoá dược liệu, tác dụng dược lý hay ứng dụng trong thực tế của dược liệu này. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: củ Bình vôi Cam bốt thu hái tại tỉnh An giang (02/2007), phơi khô rồi xay nhỏ đến dạng bột thô. Từ 50 kg dược liệu tươi thu được 4,5 kg bột thô. Chiết xuất và phân lập: Dược liệu được ngấm kiệt với cồn citric 5% ở nhiệt độ phòng. Các phân đoạn được phân tách bằng phân bố lỏng – lỏng với dung môi CHCl3 theo gradient pH. Việc phân lập các chất tinh khiết được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển trên Silica gel và Sephadex và bằng kết tinh phân đoạn. Cấu trúc các chất phân lập được xác định bằng các dữ liệu phổ MS, NMR. Kết quả: Từ 4,5 kg nguyên liệu thô của củ Bình vôi Cam bốt đã thu được alkaloid toàn phần. Từ cao chiết này đã thu được 5 phân đoạn theo thứ tự là A (167 g), B (85 g), C (13 g), D (14 g), E (22 g) và F (102 g). Từ các phân đoạn này 8 hợp chất tinh khiết đã được phân lập. Trong đó, cấu trúc của 2 chất phân lập được xác định là palmatin và jatrorrhizin. Kết luận: Từ củ Bình vôi Cam bốt (S. cambodica Gagnep. Menispermaceae) đã phân lập được 2 hợp chất có cấu trúc protoberberin. Đây là lần đầu tiên palmatin và jatrorrhizin được báo cáo trong loài này. Việc phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid khác vẫn đang được tiến hành. Từ khóa: Stephania cambodica, protoberberin alkaloid, palmatin, jatrorrhizin. ABTRACTS TWO PROTOBERBERINE ALKALOIDS ISOLATED FROM TUBER OF STEPHANIA CAMBODICA GAGNEP. (MENISPERMACEAE) Ma Chi Thanh, Tran Hung* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 565 - 569 Objective: Extraction, isolation and structure elucidation of Stephania cambodica alkaloids for further studies on quality controls of herb, pharmacological activities and the practical uses of this medicinal resource. Materials and Method: The tubers of S. cambodica were collected in An giang Province (20/02/2007), dried in indirect sunlight and ground to coarse powders. From 50 kg of fresh tubers, 4.5 kg of powder was obtained. Extraction and separation: The material was percolated by 5% citric acid in ethanol 95% to give extract. The extract was fractionated by liquid-liquid distribution with CHCl3 using gradient pH. Fractions were chromatographed on a VLC and conventional column chromatography using silica gel and Sephadex as stationary phases and purified by recrystallization to achieve pure compounds. The structure of isolated compounds were deduced by the means of MS and NMR spectral data. Result: From 4.5 kg of Stephania cambodica dry tubers, the total alkaloidal extract was obtained. Five fractions, namely A (167 g), B (85 g), C (13 g), D (14 g), E (22 g) and F (102 g) was obtained from the extract. *Labo hoá học các hợp chất tự nhiên, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh ** Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 566 From these fractions, by using VLC and conventional column chromatography, 8 pure compounds were isolated. Of these, the structure of two compounds were identified as palmatine, jatrorrhizine. Conclusion: From tubers of Stephania cambodica, two protoberberine alkaloids were isolated. This is for the first time palmatine, jatrorrhizine are reported as constituents of this plant. The isolation, structure elucidation of other alkaloids in S. cambodica is still in process. Keywords: Stephania cambodica, protoberberine alkaloids, palmatine, jatrorrhizine ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Stephania (chi Bình vôi, chi Lõi tiền) họ Tiết dê (Menispermaceae) có nhiều loài được sử dụng trong y học cổ truyền nhiều nước và trong y học hiện đại(1). Y học hiện đại đã chứng minh các alkaloid phân lập từ các loài thuộc chi Stephania có nhiều tác dụng dược lý hữu ích như rotundin dùng làm thuốc an thần, mất ngủ, cycleanin làm thuốc hạ sốt chống viêm, stepharin có tác dụng ức chế men cholinesterase, dehydroremerin, cepharanthin, tetrandrin có hoạt tính kháng viêm, hạ huyết áp, có tác dụng chẹn dòng calci và gây tê bề mặt(1,3,5). Bình vôi Cam bốt (Stephania cambodica Gagnep.) là một loài thuộc chi Stephania phân bố tại khu vực An giang với trữ lượng tương đối lớn(8). Thành phần hoá học của loài này hầu như chưa được biết tới. Trong hướng nghiên cứu về các cây thuốc thuộc chi Stephania có ở các tỉnh phía nam, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu chiết xuất phân lập các chất có trong loài Stephania cambodica Gagnep. nhằm làm tiền đề cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hoá dược liệu, khảo sát tác dụng dược lý cũng như hướng ứng dụng của cây thuốc này. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu: Củ Bình vôi Cam bốt thu hái tại An giang (02/2007) được thái nhỏ phơi trong mát cho đến khô rồi xay đến dạng bột thô. Từ 50 kg dược liệu tươi thu được 4,5 kg bột thô. Sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột chân không dùng silica gel 60 (Merck, 40-63 µm). Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản silica gel F254 tráng sẵn (Art.1.05554, Merck) phát hiện vết bằng đèn UV 254/365 nm và thuốc thử Dragendorff. Phổ MS thực hiện trên máy Quattro Micro API (Waters) của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Phổ NMR được thực hiện trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Phòng cấu trúc, Viện hoá học, Trung tâm Khoa học Công nghệ quốc gia, Hà nội, sử dụng tetramethylsilane (TMS) như là chất chuẩn nội. Phương pháp: Nguyên liệu thô của củ Bình vôi được chiết xuất với cồn citric 5% ở nhiệt độ phòng. Cao alkaloid toàn phần tiến hành chiết phân bố với dung môi CHCl3 theo gradient pH để thu được các phân đoạn alkaloid đơn giản hơn. Các phân đoạn này được sắc ký qua cột silica gel thu được các hợp chất tinh khiết. Các chất phân lập được được kiểm tra mức độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung môi, xác định điểm chảy và các phổ IR, MS và NMR. Cấu trúc các chất được xác định bằng các dữ liệu của phổ MS và NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, NOESY, HMBC, HSQC). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Củ Bình vôi (4,5 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn citric 5% ở nhiệt độ thường, dịch chiết cồn acid sau đó được cô thu hồi dung môi đến cao đặc. Cao cồn acid được hoà loãng với nước theo tỉ lệ (1:2) và được chiết phân bố với dung môi CHCl3 theo gradient pH lần lượt ở các pH 2- 3, pH 7 và cuối cùng là pH 9-10. Dịch chiết CHCl3 được cô thu hồi dung môi thu được các phân đoạn A (167 g), B (85 g), C (13 g), D (14 g), E (22 g) và F (102 g). Phân đoạn A (8 g) được sắc ký với cột silica gel đã được giảm hoạt bằng 10% nước, khai triển với hệ dung môi benzen-aceton với sự tăng dần tỉ lệ của aceton và thu được 5 phân đoạn (A1-A5). Phân đoạn A2, A3 được kết tinh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 567 trong dung môi MeOH cho ra 2 chất 3 (332 mg), 4 (730 mg). Phân đoạn B được thu hồi dung môi, hoà tan lại trong EtOH và để kết tinh thu được các tinh thể thô (6,93 g). Các tinh thể này được sắc ký qua cột silica gel cổ điển với hệ dung môi PE- CH2Cl2 (9:1), (8:2), (6:4) thu được chất 1 (10,2 mg), và chất 2 (636 mg). Phân đoạn C (13 g) và D (14 g) được tiếp tục phân tách thành các phân đoạn đơn giản bằng sắc ký cột chân không với chất hấp phụ là silica gel, hệ dung môi CH2Cl2 với tỉ lệ của MeOH tăng dần. Từ phân đoạn C thu được 10 phân đoạn (C1 – C10), phân đoạn D thu được 13 phân đoạn (D1 – D13). Phân đoạn D4 được kết tinh lại trong MeOH thu được chất 5 (38,8 mg). Phân đoạn C7 và D8 thu được 2 chất kết tinh tương ứng là chất 6 (986 mg) và chất 7 (123 mg). Phân đoạn F sau khi cô dưới áp suất giảm thu được tinh thể thô khoảng 102 g. Từ tinh thể thô này qua quá trình kết tinh lại nhiều lần thu được chất 8 (12,85 g). Các chất được kiểm tra sự tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau. Kết quả nghiên cứu được tóm tắt bằng sơ đồ sau. Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất và phân lập các alkaloid từ củ Bình vôi Cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được xác định bằng các dữ liệu phổ MS và NMR có so sánh các dữ liệu phổ đã được công bố trong tài liệu. Palmatin (6): tinh thể hình kim màu vàng, tan tốt trong các dung môi phân cực MeOH, EtOH, n-BuOH, nước. Kém tan trong benzen, aceton, CH2Cl2, CDCl3 Phổ ESI-MS positive của chất (6) cho ion [M-H]+ với có m/z = 353,2 tương ứng với công thức nguyên C21H22NO4. Ngoài ra còn có các phân mảnh [M – CH3] + m/z = 337,2; [M – H – Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 568 OCH3] + m/z = 322,2 và [M – H – OCH3 – CH3] + m/z = 308,2. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của (6) cho thấy hợp chất này có 21 carbon với 9 carbon bậc IV, 6 carbon bậc III, 2 carbon bậc II và 4 carbon bậc I. Tất cả các carbon bậc III và bậc IV của (6) đều là các carbon sp2 đặc trưng của vòng thơm. 4 nhóm methyl trong phân tử đều cộng hưởng ở vùng trường thấp (δC 57,2; 56,8; 62,57; 57,8 ppm; δH 4,01 (3H, s); 3,96 (3H, s); 4,23 (3H, s); 4,12 (3H, s) ppm, đặc trưng của nhóm thế methoxy. Trong số 6 proton methin thơm của (6) chỉ có 2 proton (δH 8,025 (1H, d, 9Hz, H-11); 8,117 (1H, d, 9,5 Hz, H-12) là 2 đỉnh đôi (d) của 2 =CH– kế cận nhau, 4 proton còn lại đều là các đỉnh đơn (s) của các =CH– đứng riêng lẻ. Kết hợp các yếu tố phổ NMR và MS ở trên (6) được xác định là một tetramethoxy protoberberin. So sánh dữ liệu phổ với các chất đã được công bố thì dữ liệu của (6) hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của palmatin(2,3,4). Cấu trúc của (6) và chuyển dịch hóa học của các carbon và proton trên phân tử được xác định một cách chắc chắn bằng các dữ liệu phổ 1 và 2 chiều. Các dữ liệu phổ 1H và 13C của palmatin được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Dữ liệu phổ của (6) so sánh với palmatin (6)/CD3OD Palmatin(3)/CD3OD Vị trí C δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 7,68 (1H, s) 110,6 7,72 (1H, s) 112,2 2 151,2 149,7 3 154,2 152,4 4 7,07 (1H, s) 112,6 6,91 (1H, s) 109,8 4a 130,2 129,5 5 3,31 (2H, m) 27,9 3,22 (2H, t) 26,9 6 4,96 (2H, t, 6,5 Hz) 57,5 4,96 (2H, t) 56,3 8 9,74 (1H, s) 146,2 9,90 (1H, s) 146,3 8a 123,3 122,3 9 145,9 144,6 10 152,0 151,5 11 8,11 (1H, d, 9,5 Hz) 128,5 8,16 (1H, d) 127,7 12 8,02 (1H, d, 124,4 8,06 (1H, d) 124,4 (6)/CD3OD Palmatin(3)/CD3OD Vị trí C δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 9 Hz) 12a 135,4 134,1 13 8,78 (1H, s) 121,3 9,12 (1H, s) 120,9 13a 139,9 138,6 13b 120,6 119,9 2-OCH3 4,01 (3H, s) 57,2 3,93 (3H, s) 57,2 3-OCH3 3,96 (3H, s) 56,8 3,86 (3H, s) 56,8 9-OCH3 4,23 (3H, s) 62,6 4,10 (3H, s) 62,9 10-OCH3 4,12 (3H, s) 57,8 4,06(3H, s) 58,0 N + H3CO H3CO OCH3 OCH3 Hình 1. Cấu trúc của palmatin Jatrorrhizin (7): tinh thể hình khối màu đỏ cam tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như MeOH, EtOH, ít tan trong dung môi kém phân cực. Phổ ESI-MS positive của chất (7) cho ion [M]+ m/z 338,2 tương ứng với công thức nguyên C20H20NO4+. Ngoài ra còn có các phân mảnh [M – CH3] + m/z = 322,2 [M – CH3 – CH3] + m/z = 308,1 và [M – CH3 – CH3 – OCH3] + m/z = 277,2. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của (7) cho thấy hợp chất này có 20 carbon với 9 carbon bậc IV, 6 carbon bậc III, 2 carbon bậc II và 3 carbon bậc I. Trong đó, các carbon bậc III và bậc IV của (7) đều là các carbon sp2 đặc trưng của vòng thơm. 3 nhóm methyl trong phân tử đều cộng hưởng ở vùng trường thấp (δC 56,4; 62,0; 56,8 ppm; δH 4,01 (3H, s); 4,22 (3H, s); 4,07 (3H, s) ppm, đặc trưng của nhóm thế methoxy. Độ dịch chuyển hoá học của carbon trên khung chính của (7) khá gần với palmatin. Tuy nhiên, (7) có ít hơn palmatin một nhóm methyl gắn trên oxy (14 amu). Nói cách khác, một nhóm methoxy của palmatin được thay bằng nhóm OH. Vị trí của nhóm OH được xác định là ở vòng A (C2 hoặc C3) vì 2 carbon mang nhóm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 569 methoxy ở C9 và C10 cho thấy tương tác rõ với H-8 (C-9) và H11, H12 (C-10) trong phổ HMBC. Việc xác định vị trí của nhóm OH dựa vào tương tác NOESY của proton trong nhóm CH3 với proton H1. Kết hợp các yếu tố phổ NMR và MS ở trên (7) được xác định là jatrorrhizin. Các dữ liệu phổ 1H và 13C của jatrorrhizin được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Dữ liệu phổ của (7) so sánh với jatrorrhizin (7)/CD3OD Jatrorrhizin(4)/DMSO Vị trí C δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 7,45 (1H, s) 108,5 7,69 (1H, s) 109,3 2 - 148,1 - 149,9 3 - 150,3 - 147,7 4 6,86 (1H, s) 114,7 6,85 (1H, s) 114,8 4a - 128,3 - a 5 3,20 (2H, t, 6,5 Hz) 26,5 3,15 (2H, t, 6,1 Hz) 25,8 6 4,94 (2H, t, 6,5 Hz) 56,3 4,92 (2H, t, 6,1 Hz) 55,4 8 9,75 (1H, s) 144,3 9,85 (1H, s) 145,1 8a - 121,7 - 117,5 9 - 144,2 - 149,9 10 - 150,0 - 147,7 11 7,89 (1H, d, 9Hz) 126,6 8,19 (1H, d, 9,1 Hz) 123,2 12 7,98 (1H, d, 9Hz) 123,1 8,01 (1H, d, 9,1 Hz) 126,6 12a 133,8 128,7 13 8,61 (1H, s) 119,7 8,98 (1H, s) 119,3 13a - 138,6 - 133,1 13b - 117,6 - 121,1 2-OCH3 4,01 (3H, s) 56,4 3,94 (3H, s) 57,0 3-OH - 150,3 - - 9-OCH3 4,22 (3H, s) 62,0 4,06 (3H, s) 61,9 10-OCH3 4,07 (3H, s) 56,8 4,09 (3H, s) 56,2 a: không thấy tín hiệu Chuyển dịch hoá học và các tương tác trong phổ COSY và HMBC của jatrorrhizin được trình bày ở Hình 2. H H H H H N + OH OCH3 OCH3 H H H H H H3CO 26.5 126.6 56.3 56.9 62.0 138.6 123.1 114.7 144.3 108.5 119.7 121.6 117.6 128.3 133.7 148.1 144.1 150.3 150.0 4.07 s 4.22 s 7.98 d J= 9 Hz 6.86 s 3.20 t J= 6.5Hz 4.94 t J= 6.5 Hz1 56.4 4.01 s 7.45 s 8.61 s 9.75 s 7.89 d J= 9 Hz 3.50 brs NOESY Hình 2. Cấu trúc của jatrorrhizin Töông taùc H-H trong COSY Töông taùc xa H-C trong HMBC KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN Từ củ Bình vôi Cam bốt (S. cambodica Gagnep. Menispermaceae) đã phân lập được 8 alkaloid. Hai trong số đó đã được xác định là palmatin và jatrorrhizin. Đây là lần đầu tiên 2 alkaloid này được báo cáo trong loài Bình vôi Cam bốt. Cấu trúc của các alkaloid còn lại sẽ được trình bày trong một báo cáo khác. Việc phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid khác vẫn đang được tiến hành. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 512 – 515, 779 – 781. 2. Lenka Grycova´, Jirˇı´ Dosta´l, Radek Marek (2007), “Quaternary protoberberin alkaloids”, Phytochemistry, 68, pp. 150–175. 3. Phạm Thanh Kỳ, Vũ Xuân Giang, Nguyễn Tiến Vững (2007), “Nghiên cứu alkaloid trong loài Bình vôi Stephania viridiflavens H.S.Lo et Yang”, Tạp chí thông tin y dược. số 4, tr. 31-35. 4. Trinh Thi Thuy, K. Franke, A. Porzel, L. Wessjohann and Tran Van Sung (2006), “Quaternary protoberberine alkaloids from Stephania rotunda”, Journal of Chemistry, Vol. 44, 2, pp. 259 – 264 5. Viện Dược liệu (2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, NXB Khoa học và Kỹ thuật, TPHCM, tr. 210 – 215(I), 547 – 548(I), 161 – 163(II) 6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 325 – 327. 7. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và Kỹ thuật, TPHCM, tr. 2334 - 2340. 8. Võ Văn Chi (1991), “Cây thuốc An Giang”, NXB Khoa Học và Kỹ thuật An Giang, tr. 398 – 399.