Phát hiện đột biến gen KRAS trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự DNA

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  50 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC  TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD‐PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA  Hoàng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà**  TÓM TẮT  Giới  thiệu: Tăng biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô thường gặp trong ung thư đại trực  tràng (UTĐTT) và là đích điều trị của kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, sự kháng thuốc xảy ra khi có đột biến gen  KRAS trong tế bào ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen  KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân UTĐTT  được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược  TPHCM.  Chúng  tôi  sử  dụng  kỹ  thuật  COLD‐PCR  (co‐amplification  at  lower  denaturation  temperature  polymerase chain reaction) để khuếch đại exon 2 của gen KRAS từ bệnh phẩm là mô vùi nến. Sau đó, đột biến  của gen KRAS được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA.  Kết quả: 62 trường hợp có đột biến của gen KRAS (35,8%), trong đó 4 trường hợp mang đột biến ở cả hai  codon 12 và 13. Có  tất cả 7 dạng đột biến được phát hiện, bao gồm 5 dạng đột biến ở codon 12  (Gly12Asp,  Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala và Gly12Cys) và 2 dạng đột biến ở codon 13 (Gly13Asp và Gly13Ser).  Kết luận: Đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS thường gặp trên bệnh nhân Việt Nam bị UTĐTT. Kết  hợp kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA phù hợp cho khảo sát các đột biến này từ bệnh phẩm giải  phẫu bệnh.  Từ khóa: ung thư đại trực tràng, đột biến gen KRAS, giải trình tự chuỗi DNA, COLD‐PCR  ABSTRACT  DETECTION OF KRAS MUTATIONS IN COLORACTAL CANCER USING COLD‐PCR   AND DNA SEQUENCING  Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 51 ‐ 55  Background:  Commonly  over‐expressed  in  colorectal  cancer,  EGFR  is  an  ideal  target  for monoclonal  antibody  therapy.  However,  drug‐resistance  was  observed  in  patients  whose  tumor  cells  harbored  KRAS  mutations. We conduct this study to describe KRAS mutations at codons 12 and 13 for selecting patients suitable  for monoclonal antibody indication.  Materials  and methods:  From  January  2011  to May  2013,  173  patients with  colorectal  cancer were  analyzed for KRAS mutations at Center for Molecular Biomedicine – University of Medicine and Pharmacy, Ho  Chi Minh City. COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) was  used to amplify KRAS exon 2 from paraffin‐embedded tissue samples. Mutations were identified by direct DNA  sequencing.  Results: KRAS mutations were detected  in 62 patients  (35.8%)  including 4 patients who carried double  mutations at both codons 12 and 13.  In  total, 7  types of mutations were  found, of which 5 were at codon 12  * Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM    ** Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM  Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Anh Vũ  ĐT: 0122 299 3537  Email: hoangvuxinh@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  51 (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala and Gly12Cys) and 2 at codon 13 (Gly13Asp and Gly13Ser).  Conclusion: High frequency of KRAS mutations were found in Vietnamese patients with colorectal cancer.  COLD‐PCR  in  combination  with  direct  DNA  sequencing  is  suitable  for  detecting  KRAS mutations  from  pathological samples.  Keywords: colorectal cancer, KRAS gene mutation, DNA sequencing, COLD‐PCR  ĐẶT VẤN ĐỀ  Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó  có  thụ  thể yếu  tố  tăng  trưởng biểu mô  (EGFR:  epidermal growth  factor  receptor),  thường gặp  trong  ung  thư  ở  người,  trở  thành  những  đích  nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị. Hoạt tính  tyrosine  kinase  của  EGFR  đóng  vai  trò  quan  trọng trong sự điều khiển sự tăng sinh và sống  còn  của  tế  bào,  thông  qua  quá  trình  tự  phosphoryl hóa thụ thể EGFR hoặc thông qua 2  con đường truyền tín hiệu trung gian hạ nguồn  là  con  đường  PIK3CA/AKT/mTOR  và  RAS/RAF/MAPK(4).  Sự  hoạt  hóa  của  protein  EGFR khởi động cho các dòng thác tín hiệu nội  bào, có liên quan đến một số con đường truyền  tin  để  gây  ra  những  đáp  ứng  tế  bào  vô  cùng  quan trọng bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa tế  bào,  sự di  động và  sinh  tồn  của  tế bào. Trong  ung  thư đại  trực  tràng  (UTĐTT), protein EGFR  thường biểu hiện quá mức  trên bề mặt  tế bào,  được  coi  là  nguồn  gốc  khởi  phát  các  tín  hiệu  tăng  sinh  tế  bào  quá  độ  trong  khối  u.  Ức  chế  hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến  lược  điều  trị  thích  hợp,  đã  được  nghiên  cứu  nhiều  trong UTĐTT. Tuy nhiên kháng  thể đơn  dòng  ức  chế  đặc  hiệu  sự  hoạt  hóa  EGFR  như  cetuximab hay panitumumab được chứng minh  chỉ có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn  tiến xa  trên nhóm bệnh nhân không mang  đột  biến  gen  KRAS,  giúp  kéo  dài  thời  gian  sống  thêm và thời gian sống không bệnh(2,8). Hiệp hội  ung thư Châu Âu và Hiệp hội ung thư Hoa kỳ  đều  khuyến  cáo  chỉ  điều  trị  cetuximab  hay  panitumumab  cho  những  bệnh  nhân  không  mang đột biến gen KRAS(1,16,17). Gen KRAS là một  thành viên  của gia  đình gen RAS, mã hóa  cho  một guanosine triphosphate GTPase vốn có hai  trạng  thái:  trạng  thái  bất  hoạt  có  gắn GDP  và  trạng  thái  hoạt  động  có  gắn  với GTP.  Là một  chất  truyền  tin  hạ  nguồn  của EGFR, KRAS  có  vai  trò quan  trọng  trong việc khởi phát và  tiến  triển  của một  số ung  thư  như  carcinôm  tuyến  của đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ  làm  mất  hoạt  tính  ATPase  và  giữ  phân  tử  protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn  đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn  luôn hoạt động để duy  trì  tín hiệu  tăng sinh  tế  bào(13).  Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được  chỉ định cho UTĐTT giai đoạn  tiến xa. Nghiên  cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất  đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh  nhân  UTĐTT  bằng  kỹ  thuật  COLD‐PCR  (co‐ amplification  at  lower  denaturation  temperature)  kết  hợp  với  giải  trình  tự  DNA,  giúp quyết định  lựa chọn kháng  thể đơn dòng  cho  bệnh  nhân  một  cách  phù  hợp.  Kỹ  thuật  COLD‐PCR  cho phép khuếch  đại  ưu  thế dòng  alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi DNA(10). Trong  kỹ  thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu  tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng  nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 900C  chỉ đủ cho các mạch đôi dị hợp tử có mang đột  biến  trong  sản phẩm PCR duỗi  ra  để được  ưu  tiên khuếch đại. Với những điều kiện tối ưu hóa,  COLD‐PCR có  thể giúp  cho giải  trình  tự DNA  đạt độ nhạy <1%, tương đương pyrosequencing  mà không cần trang bị thêm hệ thống mới(18).  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Chúng  tôi  tiến hành khảo  sát  đột biến gen  KRAS cho những bệnh nhân UTĐTT có nhu cầu  được điều trị bằng cetuximab trong thời gian từ  tháng  01/2011  đến  tháng  05/2013.  Bệnh  nhân  được  chẩn  đoán  xác  định  UTĐTT  bằng  tiêu  chuẩn  giải  phẫu  bệnh  tại  Bô  môn  Giải  phẫu  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  52 bệnh  –  Đại  học  Y  Dược  Thành  phố  Hồ  Chí  Minh.  Tách chiết genomic DNA  Bệnh phẩm là mô vùi nến đã dùng để chẩn  đoán giải phẫu bệnh. Trường hợp là bệnh phẩm  phẫu  thuật, vùng mô ung  thư  được  đánh dấu  trên  tiêu  bản  để  phân  biệt  với  vùng mô  lành  xung quanh,  rồi  được  cạo vào  tube  ly  tâm  1,5  mL bằng các lưỡi dao mỏng riêng biệt (từ 2 – 4  tiêu bản). Những  trường hợp bệnh phẩm  sinh  thiết  quá  nhỏ  không  thể  đánh  dấu  phân  biệt  vùng ung thư và mô lành, nếu phần mô ung thư  chiếm ít nhất 30% thì được thu toàn bộ vào tube  ly tâm. Chúng tôi không đưa vào nhóm nghiên  cứu nếu mẫu sinh thiết chứa <30% lượng tế bào  ung thư để tránh khả năng âm tính giả do hạn  chế về độ nhạy của kỹ thuật giải trình tự chuỗi  DNA. Genomic DNA được ly trính bằng bộ kít  ReliaPrep™  FFPE  gDNA  Miniprep  System  (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà  sản xuất.  Khuếch đại exon 2 của gen KRAS bằng kỹ  thuật COLD‐PCR  Cặp  mồi  được  thiết  kế  bằng  phần  mềm  Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen KRAS  mang accession number NG_007524  (mồi xuôi:  5’‐  AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA‐3’;  mồi  ngược:  5’‐  CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC‐3’).  Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 50 μL, các  thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 μM  cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 μM  cho mỗi  loại), 1,25 unit TaKaRa TaqTM HotStart  Polymerase  (Takara, Nhật Bản) và 50 – 100 ng  genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt theo kỹ thuật  COLD‐PCR  được  thực  hiện  trên  máy  GeneAmp®  PCR  system  9700  (Applied  Biosystems, Mỹ)  bao  gồm  giai  đoạn  biến  tính  ban đầu ở 980C  trong 3 phút,  theo sau bằng 10  chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn  mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở  720C  trong  40  giây.  Tiếp  theo,  phản  ứng  tổng  hợp chuỗi DNA  được  thực hiện với 40  chu kỳ  gồm 5 bước: biến  tính ở 980C  trong 10 giây,  tái  bắt cặp các sản phẩm PCR ở 700C trong 2 phút,  phân  tách  các  sản phẩm PCR  ở  800C  trong  10  giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây và tổng hợp  chuỗi DNA ở 720C trong 40 giây. Phản ứng được  kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C  trong  5  phút.  Sản  phẩm  PCR  được  phát  hiện  bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm  ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel  Pringraph  (Atto,  Nhật  Bản).  Sản  phẩm  PCR  được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit  (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện di  trên  thạch  agarose  1,5%.  Trong mỗi  đợt  thực  nghiệm  luôn  có một  tube  chứng  âm,  trong  đó  genomic DNA được thay bằng nước cất đã dùng  để pha master mix.  Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA  Sản phẩm PCR  đã  được  tinh  sạch  sẽ  được  thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với  BigDye  Terminator  Version  3.1  từ  Applied  Biosystems,  theo  2  chiều  xuôi  và  ngược.  Sản  phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan  trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2  phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA  được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer,  với POP‐7 polymer và capillary 50 cm (Applied  Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân  tích bằng  phần mềm SeqScape. Quy  trình chẩn đoán đột  biến gen  được  thực hiện  tại Trung  tâm Y Sinh  học Phân tử, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Đặc điểm mẫu nghiên cứu  Có  tất  cả  173  bệnh  nhân  được  chọn  vào  nghiên cứu, gồm 95 nam và 78 nữ (tỷ lệ nam/nữ  là 1,2/1). Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 19 tuổi, lớn  nhất 100 tuổi, với trị số trung vị là 54 tuổi. Khối  u  ở  đại  tràng  chiếm  nhiều  hơn  so  với  ở  trực  tràng: 122 trường hợp ở đại tràng (70,5%) và 51  trường hợp ở  trực  tràng  (29,5%). Hầu hết bệnh  nhân đã được ghi nhận tổn thương có xâm nhập  đến  lớp  thanh mạc  (38,7%) hoặc  khối u  ở  giai  đoạn tiến xa (36,4%).  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  53 Đột biến gen KRAS  KRAS  đột biến  đóng vai  trò quan  trọng  cả  trong hình thành ung thư cũng như sự đề kháng  với  điều  trị.  Trong  ung  thư  đại  trực  tràng,  sự  hiện diện của đột biến gen KRAS là một yếu tố  tiên  lượng xấu độc  lập và  tiên đoán kháng với  điều  trị  chống EGFR(8).  Đột biến KRAS  thường  tập trung ở codon 12 và 13, ngoài ra cũng có thể  gặp ở codon 61 và 146 với tần suất rất thấp(7,12).  Tại  codon  12  và  13,  có  14  kiểu  đột  biến  khác  nhau của gen KRAS đã được ghi nhận  trên  thế  giới.  Vì  chưa  có  số  liệu  nào  về  đột  biến  gen  KRAS trên bệnh nhân Việt Nam, chúng tôi chọn  kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA để có thể phát  hiện được  tất cả các kiểu  thay đổi nucleotide ở  codon 12 và 13.  Nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến gen  KRAS,  chúng  tôi  thực  hiện  đồng  thời  2  giải  pháp. Trước tiên, trong bước nhận mẫu nghiên  cứu  chúng  tôi  chỉ  khảo  sát  đột  biến  khi  bệnh  phẩm có  ít nhất 30%  số  lượng  tế bào ung  thư.  Tiếp  đó,  kỹ  thuật  COLD‐PCR  được  dùng  để  khuếch đại exon 2 có chứa codon 12 và 13. Đây  là kỹ  thuật được phát minh bởi Li và cộng sự,  giúp phát hiện được đột biến gen bằng giải trình  tự DNA ngay cả khi chỉ có <1% tế bào mang đột  biến trong mẫu khảo sát(10).  Trong  tổng số 173  trường hợp đã khảo sát,  chúng tôi phát hiện 62 bệnh nhân có mang đột  biến gen KRAS, chiếm tỷ lệ 35,8%. Tần suất đột  biến này tương đồng với hầu hết các nghiên cứu  trước  đây,  vốn  dao  động  trong  khoảng  27  –  43%(2,3,5,11). Đặc biệt, trong nghiên cứu này, chúng  tôi phát hiện có 4 bệnh nhân mang đột biến ở cả  2  codon  12  và  13.  Đây  là  những minh  họa  về  tính đa dòng tế bào trong ung thư nói chung và  UTĐTT nói riêng. Chúng tôi không thấy có mối  liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS với  vị trí khối u, nhưng đột biến có khuynh hướng  thường  gặp  hơn  trên  bệnh  nhân  nam  so  với  bệnh nhân nữ (Bảng 1). Bệnh nhân trẻ tuổi (dưới  40  tuổi) cũng  ít gặp đột biến gen KRAS hơn so  với nhóm bệnh nhân lớn tuổi. Đây là những ghi  nhận mới, cần được nghiên cứu thêm trong thời  gian tới.  Bảng 1: Tương quan giữa đặc điểm bệnh nhân và đột  biến KRAS.  Đặc điểm Đột biến gen KRAS Không đột biến gen KRAS P Số trường hợp Tỉ lệ (%) Số trường hợp Tỉ lệ (%) Giới: Nam Nữ 40 (42,1%) 22 (28,2%) 55 (57,9%) 56 (71,8%) < 0,01 Tuổi: ≤40 >40 4 (16,7%) 58 (38,9%) 20 (83,3%) 91 (61,1%) < 0,01 Vị trí: trực tràng đại tràng 20 (36,4%) 42 (35,6%) 35 (63,6%) 76 (64,4%) 0,44 Tổng cộng 62 111 Có tất cả 7 kiểu đột biến tại codon 12 và 13  được phát hiện trên 62 bệnh nhân trong nghiên  cứu này (Bảng 2 và Hình 1). Thường gặp nhất là  các  đột biến Gly12Asp và Gly12Val  của  codon  12 và Gly13Asp  của  codon 13. Các  số  liệu này  hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu trước  đây  trên  thế  giới(6,9).  Kết  quả  nghiên  cứu  của  chúng tôi giúp ích cho việc xác định những bệnh  nhân phù hợp cho chỉ định kháng thể đơn dòng,  đồng thời cũng là cơ sở quan trọng cho việc thiết  kế các bộ kít chẩn đoán bằng ASO‐PCR  (allele‐ specific  oligonucleotide‐PCR)  để  phát  hiện  những đột biến gặp trên bệnh nhân Việt Nam.  Bảng 2: Phân phối các đột biến gen KRAS.  Kiểu đột biến Số trường hợp Tỷ lệ (n = 173) Thay đổi nucleotide Thay đổi amino acid c.35G>A Gly12Asp 19 10,9 c.35G>T Gly12Val 18 10,4 c.38G>A Gly13Asp 15 8,6 c.34G>T Gly12Cys 4 2,3 c.35G>C Gly12Val 4 2,3 c.34G>A Gly12Ser 3 1,7 c.37G>A Gly13Ser 3 1,7 Cần chú ý rằng tình trạng không đột biến ở  codon 12 và 13 của gen KRAS chưa đủ đảm bảo  cho bệnh nhân có đáp ứng với cetuximab hoặc  panitumumab. Các yếu tố kháng thuốc khác bao  gồm  đột biến  codon  61 và  146  của gen KRAS,  đột biến codon 12, 13 và 61 của gen NRAS, đột  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  54 biến codon 600 của gen BRAF, đột biến exon 9  và  20  của gen PIK3CA(3,14,15) nên  được khảo  sát  trong các nghiên cứu tiếp theo.  KẾT LUẬN  Đột  biến  gen  KRAS  thường  gặp  trong  UTĐTT  ở bệnh nhân Việt Nam. Phát hiện  đột  biến  gen KRAS  bằng  kỹ  thuật COLD‐PCR  kết  hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện  cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng  thể đơn dòng cetuximab.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Allegra  CJ,  Jessup  JM,  Somerfield  MR,  Hamilton  SR,  Hammond EH, Hayes DF,  et  al  (2009). American  Society of  Clinical  Oncology  provisional  clinical  opinion:  testing  for  KRAS  gene mutations  in  patients with metastatic  colorectal  carcinoma to predict response to anti‐epidermal growth factor  receptor  monoclonal  antibody  therapy.  J  Clin  Oncol;  27(12):2091‐6.  2. Amado  RG,  Wolf  M,  Peeters  M,  Van  Cutsem  E,  Siena  S,  Freeman  DJ,  et  al  (2008).  Wild‐type  KRAS  is  required  for  panitumumab  efficacy  in  patients with metastatic  colorectal  cancer. J Clin Oncol.;26(10):1626‐34.  3. Benvenuti S, Sartore‐Bianchi A, Di Nicolantonio F, Zanon C,  Moroni M, Veronese S, et al (2007). Oncogenic activation of the  RAS/RAF  signaling  pathway  impairs  the  response  of  metastatic  colorectal  cancers  to  anti‐epidermal growth  factor  receptor antibody therapies. Cancer Res;67(6):2643‐8.  4. Ciardiello  F,  Tortora  G  (2008).  EGFR  antagonists  in  cancer  treatment. N Engl J Med;358(11):1160‐74.  5. Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, Le Pessot F, Lamy A,  Galais MP, et al  (2007). Clinical relevance of KRAS mutation  detection in metastatic colorectal cancer treated by Cetuximab  plus chemotherapy. Br J Cancer;96(8):1166‐9.  6. Domagala P, Hybiak  J, Sulzyc‐Bielicka V, Cybulski C, Rys  J,  Domagala  W  (2012).  KRAS  mutation  testing  in  colorectal  cancer as an example of the pathologistʹs role in personalized  targeted  therapy: a practical approach. Pol  J Pathol;63(3):145‐ 64.  7. Edkins S, OʹMeara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, et  al.  (2006)  Recurrent  KRAS  codon  146 mutations  in  human  colorectal cancer. Cancer Biol Ther;5(8):928‐32.  8. Karapetis CS, Khambata‐Ford S, Jonker DJ, OʹCallaghan CJ, Tu  D, Tebbutt NC, et al (2008). K‐ras mutations and benefit from  cetuximab  in  advanced  colorectal  cancer.  N  Engl  J  Med;359(17):1757‐65.  9. Kristensen  LS,  Kjeldsen  TE,  Hager  H,  Hansen  LL  (2012).  Competitive amplification of differentially melting amplicons  (CADMA)  improves  KRAS  hotspot  mutation  testing  in  colorectal cancer. BMC Cancer.12:548.  10. Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos  GM  (2008). Replacing PCR with COLD‐PCR enriches variant  DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing.  Nat Med;14(5):579‐84.  11. Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, et al  (2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in  patients  with  advanced  colorectal  cancer  treated  with  cetuximab. J Clin Oncol;26(3):374‐9.  12. Oliveira C, Westra  JL, Arango D, Ollikainen M, Domingo E,  Ferreira A, et al (2004). Distinct patterns of KRAS mutations in  colorectal carcinomas according  to germline mismatch repair  defects  and  hMLH1  methylation  status.  Hum  Mol  Genet;13(19):2303‐11.  13. Roberts  PJ,  Der  CJ  (2007).  Targeting  the  Raf‐MEK‐ERK  mitogen‐activated protein kinase cascade for the treatment of  cancer. Oncogene;26(22):3291‐310.  14. Sartore‐Bianchi  A,  Martini  M,  Molinari  F,  Veronese  S,  Nichelatti  M,  Artale  S,  et  al  (2009).  PIK3CA  mutations  in  colorectal  cancer  are  associated  with  clinical  resistance  to  EGFR‐targeted monoclonal antibodies. Cancer Res;69(5):1851‐ 7.  15. Sullivan KM, Kozuch PS (2011). Impact of KRAS Mutations on  Management  of  Colorectal  Carcinoma.  Patholog  Res  Int:219309.  16. Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes A  (2010). Advanced  colorectal  cancer:  ESMO  Clinical  Practice  Guidelines  for  treatment. Ann Oncol;21 Suppl 5:v93‐7.  17. Van Cutsem EJ, Oliveira J, Kataja VV (2005). ESMO Minimum  Clinical  Recommendations  for  diagnosis,  treatment  and  follow‐up of advanced colorectal cancer. Ann Oncol;16 Suppl  1:i18‐9.  18. Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, Galbincea JM, Soape M, Doan S,  et al (2009). Application of COLD‐PCR for improved detection  of KRAS mutations in clinical samples. Mod Pathol.;22(8):1023‐ 31.  Ngày nhận bài báo      08‐06‐2013  Ngày phản biện nhận xét bài