Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của chế phẩm tai nấm vàng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 487 TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA CHẾ PHẨM TAI NẤM VÀNG Nguyễn Thị Thùy Linh*, Võ Phùng Nguyên* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của sản phẩm Tai Nấm Vàng (TNV) – sản phẩm từ sự kết hợp bốn loại nấm Linh chi, Vân chi, Thái dương và Hầu thủ. Phương pháp: Tác động chống oxy hóa và bảo vệ gan được nghiên cứu trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt cấp tính bằng CCl4. Chuột được cho uống TNV dự phòng 7 hoặc 14 ngày với liều 1,4 g/kg thể trọng x 2 lần/ngày trước khi chuột được gây viêm gan cấp bằng tetraclorua carbon (CCl4) tiêm phúc mô 0,25%, 10 mL/Kg. Các chỉ số sinh hóa ALT, AST, bilirubin huyết thanh và malondialdehyd (MDA), protein carbonyl (PC) mô được xác định để đánh giá tác động của TNV. Giải phẫu bệnh học gan chuột cũng được xem xét. Kết quả: CCl4 gây tăng các men transaminase, bilirubin huyết thanh, MDA và protein carbonyl mô gan ở chuột. Các tác động này bị giảm khi được dùng trước TNV. Các kết quả về xét nghiệm mô bệnh học hỗ trợ thêm cho các kết quả sinh hóa. Kết luận: Tai Nấm Vàng có tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở chuột ở liều cho uống 1,4 g/kg thể trọng, 2 lần/ngày trong 7 và 14 ngày. Từ khóa: Tai nấm vàng TNV, Linh chi, Vân chi, Thái dương, Hầu thủ, chống oxy hóa, bảo vệ gan, malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PC), carbon tetraclorua (CCl4), chuột nhắt ANTIOXIDANT, HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY OF “TAI NAM VANG” Nguyen Thi Thuy Linh, Vo Phung Nguyen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 487 - 493 ABSTRACT Objective: Evaluate the antioxidant, hepatoprotective activity of TAI NAM VANG – a product of the combination of four mushrooms: Ganoderma lucidum (GL), Trametes versicolor (TV), Agaricus blazei (AB) and Hericium erinaceus (HE). Method: Antioxidant and hepatoprotective activity of TNV were studied on the model of acute carbon tetraclorua – induced liver damage in mice. Mice were orally administered TNV at the dose 1.4 g/kg b.w, twice a day for 7 or 14 days as prophylaxis treatment before given intraperitoneally injection of single dose CCl4 0.25%, 10 mL/Kg. Biochemical parameters such as serum ALT, AST, bilirubin; liver tissue malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl (PC) were measured to evaluate antioxidant and hepatoprotective activity of TNV. Liver sections of mice were also histopathological examined. Result: CCl4 treatment induced an increase in serum transaminase, bilirubin and tissue MDA, PC in mice. These effects were reduced by pretreatment with TNV. These biochemical results were supported by histopathological results Conclusion: The study confirms the antioxidant and hepatoprotective activity of TNV given 1,4 g/kg twice for 7 and 14 days in mice. Keywords: Ganoderma lucidum (GL), Trametes versicolor (TV), Agaricus blazei (AB) and Hericium *Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Thị Thùy Linh ĐT: 0984454133 Email: linhviky@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 488 erinaceus (HE), antioxidant, hepatoprotective, malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PC), carbon tetraclorua (CCl4), mice. ĐẶT VẤN ĐỀ Oxy hóa là một quá trình sinh lý bình thường trong cơ thể, nhưng khi có sự mất cân bằng giữa gốc tự do sinh ra trong quá trình này và các yếu tố bảo vệ nội sinh có thể là nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh khác nhau như: bệnh về thần kinh, ung thư, huyết áp, Chính vì vậy, việc tìm kiếm thêm các nguồn chất chống oxy hóa đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Cho tới hiện nay đã có nhiều dược liệu được chứng minh là có khả năng phòng ngừa, ngăn chặn sự oxy hóa, bảo vệ gan như sữa ong chúa, trà xanh, atiso, các loại nấm Linh chi, Vân chi, Thái dương, Hầu thủ(2,5) Tai Nấm Vàng (TNV) là một chế phẩm bao gồm 4 loại nấm quý: Linh chi, Vân chi, Thái dương, Hầu thủ hứa hẹn đây là một chế phẩm có nhiều công dụng quý, trong đó có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan. Việc nghiên cứu tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của viên TNV sẽ góp phần làm rõ cơ chế tác động của thuốc cũng như đóng góp cho sự phát triển nền y học dân tộc và nhu cầu sử dụng của nhân dân. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino, trọng lượng 22 g ± 2 g, do viện vắc-xin và sinh phẩm Nha trang cung cấp. Chuột được nuôi ổn định trong hộp nhựa (28x25x15cm) 2 ngày trước khi thử nghiệm và được cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống. Nguyên liệu: Chế phẩm viên nang Tai Nấm Vàng do công ty trách nhiệm hữu hạn Giai Cảnh sản xuất và cung cấp với thành phần: Cao khô nấm Thái Dương 17,57 mg Cao khô nấm Vân Chi 17,57 mg Cao khô nấm Hầu Thủ 17,57 mg Cao khô nấm Linh Chi 122,99 mg Tá dược: Magnesi carbonat nhẹ, Aerosil, bột Talc, Magnestearat vừa đủ 460 mg. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát khả năng bảo vệ của viên TNV sử dụng uống dự phòng 7 ngày và 14 ngày liều 1,4 g/kg x 2 lần/ngày trước khi gây độc gan chuột bằng cách tiêm phúc mô CCl4 0,25% 10 mL/Kg khi pha trong dầu olive. Ở mỗi thử nghiệm chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con, gồm lô trắng (uống nước cất ED); lô chứng (uống nước cất, tiêm olive); lô uống TNV, tiêm olive; lô gây độc (uống nước cất ED, tiêm CCl4) và lô thử (uống TNV, tiêm CCl4). Đánh giá Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): được đánh giá thông qua hàm lượng malondialdehyde (MDA) và protein carbonyl (PC) mô gan. Tác động bảo vệ gan được khảo sát ở mức độ mô học và thông qua chỉ số sinh hóa gan men gan ALT, AST và bilirubin huyết thanh. Xác định hàm lượng MDA MDA là một trong các sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử thiobarbituric ở môi trường pH 2-3, nhiệt độ 90- 100 oC trong 60 phút tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. Nếu lượng MDA ở mẫu thử giảm có ý nghĩa thống kê so với mẫu gây mô hình, mẫu thử được xác định là có hoạt tính chống oxy hóa. (2) Tiến hành: Mô gan được nghiền tạo dịch đồng thể 5% trong dung dịch phosphat buffer saline (PBS, pH 7,4). Lấy 200 µl dịch sau ly tâm (9500 vòng/phút x15 phút) thêm 500 µl nước cất, và 100 µl SDS 10% rồi ủ ở 37 oC trong 30 phút. Thêm 500 µl HCl 0,1N, lắc kỹ 15 phút. Ly tâm lấy 1 ml dịch, thêm vào 250 µl TBA 0,5%. Đun cách thủy ở 95 oC trong 60 phút rồi để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo quang ở Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 489 bước sóng 532 nm. Tất cả các giai đoạn từ lấy mẫu gan, cân cho đến nghiền mẫu đều được tiến hành ở nhiệt độ 0-4 0C. Xác định hàm lượng protein carbonyl Protein carbonyl, một sản phẩm được tạo ra trong quá trình oxy hóa protein, khi cho phản ứng với 2,4-dinitrophenylhydrazin tạo tủa. Hòa tan tủa trong guanidinchlorid cho dung dịch màu vàng, đo quang ở bước sóng 370 nm (3). Tiến hành: nghiền mẫu gan tạo dịch đồng thể 6,7% trong dung dịch đệm PBS pH 6,5. Ly tâm lấy dịch. Tất cả các giai đoạn từ lấy mẫu, cân cho đến nghiền mẫu đều được tiến hành ở nhiệt độ 0-4 0C. Bảng 1. Hỗn hợp phản ứng định lượng protein carbonyl Thành phần Ống chứng (μl) Ống thử (μl) 100 mM PBS (pH 7,2) 80mM FeSO4.7H2O 8 mM FeCl3.6H2O 4 M KCl 0,4 M MgCl2.2H2O Mẫu thử 320 20 20 20 20 200 320 20 20 20 20 200 Nước cất 120 120 Tổng cộng 720 720 Ủ hỗn hợp ở 30 oC trong 30 phút, cho vào hỗn hợp 720 µl TCA 20%, ly tâm lấy cắn. Thêm vào ống chứng 720 µl HCl 2 N, ống thử 720 µl 2,4- DNPH 0,2%, lắc nhẹ trong 60 phút. Thêm vào mỗi mẫu 720 µl TCA 20%, vortex 10 giây, ly tâm (3000 vòng x 15 phút), lấy cắn. Rửa cắn 3 lần với 1,5 ml dung dịch ethanol/ethyl acetat (1:1), để khô. Hòa tan trong 1,8 ml guanidinchloride 6 M, ly tâm, lấy dịch đo quang ở bước sóng 370 nm. Xác định hàm lượng protein toàn phần (Phương pháp Bradford) Tiến hành: Phản ứng tạo màu của protein và Coomassie(1). Pha mẫu đo quang theo bảng 2 ở bước sóng 595 nm. Bảng 2. Thành phần hỗn hợp phản ứng định lượng protein toàn phần Thành phần Ống trắng Ống thử Nước Coomassie Dịch gan 500 μl 500 μl 0 μl 498 μl 500 μl 2 μl Tổng cộng 1ml 1ml Khảo sát mô học: Mẫu mô gan ở các lô được xử lý nhuộm theo phương pháp Hematoxylin-eosin tại Bộ môn giải phẫu bệnh - Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh. Xét nghiệm sinh hóa: Mẫu máu đựng trong ống không có chất chống đông dùng để xét nghiệm các thông số thuộc chức năng của gan tại phòng xét nghiệm sinh hóa - Bệnh viện Chợ Rẫy, TP. Hồ Chí Minh trên máy xét nghiệm sinh hoá Hitachi 717, thuốc thử của hãng Biolabo (Pháp). Phân tích thống kê: Dữ liệu được trình bày dưới dạng Mean (Số trung bình) ± SEM (sai số chuẩn của số trung bình). Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phương pháp Mann-Whitney với phần mềm Minitab 14. P<0,05 được xem là khác nhau có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 490 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tác động chống oxy hóa Haøm löôïng protein toaøn phaàn (mg/ml) 0 5 10 15 20 25 A 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 y= 0,0 391 x + 0,0 65 R 2 = 0 ,99 88 A Haøm löôïng MDA (nmol/ml) 0 20 40 60 80 A 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 y = 0, 032 3x R 2 = 0,9 995 B Hình 1. Đường chuẩn protein toàn phần (A) và MDA (B) Thử nghiệm 7 ngày Bảng 3. Hàm lượng MDA và PC trong thử nghiệm 7 ngày với CCl4 0,25% Lô MDA (nmol/mg protein) HTCO (%) PC (nmol/mg protein) HTCO (%) Nước cất, dầu olive (n=7) 1,206 ± 0,049 1,701 ± 0,162 Nước cất, CCl4/olive 0,25% (n=6) 2,895 ** ± 0,158 0 4,378 ## ± 0,169 0 TNV, dầu olive (n=6) 1,198 ± 0,114 1,917 ± 0,094 TNV, CCl4/olive 0,25% (n=8) 1,709 ** ± 0,122 41 3,123 ## ± 0,107 28,7 Trắng (n=6) 1,102 ± 0,069 1,889 ± 0,062 Thử nghiệm 14 ngày Bảng 4. Hàm lượng MDA và PC trong thử nghiệm 14 ngày Lô MDA (nmol/mg protein) HTCO (%) PC (nmol/mg protein) HTCO (%) Nước cất, dầu olive (n=7) 1,109 ± 0,220 2,201 ± 0,495 Nước cất, CCl4/olive 0,25% (n=7) 2,307 ** ± 0,042 0 4,784 * ± 0,377 0 TNV, dầu olive (n=7) 0,897 ± 0,044 2,134 ± 0,214 TNV, CCl4/olive 0,25% (n=8) 1,171 ## ± 0,158 49,2 3,356 # ± 0,385 29,8 Trắng (n=6) 0,925 ± 0,062 2,372 ± 0,127 Hoạt tính chống oxy hóa của lô thử được so với lô gây độc, nếu coi HTCO ở lô gây độc là 0% thì HTCO ở lô thử là: Sau 7 ngày dùng TNV bảo vệ, HTCO ở MDA là 41%, HTCO ở PC là 28,7%, (p<0,01). Sau 14 ngày dùng TNV bảo vệ, HTCO ở MDA là 49,2% (p<0,01), HTCO ở PC là 29,8% (p<0,05). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 491 LoâH aøm lö ôïn g M D A (n m ol /m g pr ot ei n) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ## ** ED olive n= 7 TNV olive n= 7 TNV CCl4/olive n= 8 traéng n= 6 ED CCl4/olive n=7 A Loâ H aøm lö ôïn g PC (n m ol /m g pr ot ei n) 0 1 2 3 4 5 6 * # ED olive n= 7 TNV olive n= 7 TNV CCl4/olive n= 8 traéng n= 6 ED CCl4/olive n=7 B Hình 2. Hàm lượng MDA (A), PC (B) trong thử nghiệm 14 ngày *: p<0,05; **: p<0,01: khác biệt có ý nghĩa so với lô nước cất, olive #: p<0,05; ##: p<0,01: khác biệt có ý nghĩa so với lô nước cất, CCl4/olive 0,25%. Từ các kết quả thực nghiệm cho thấy chế phẩm Tai Nấm Vàng đã thể hiện khả năng chống oxy hóa sau 7 ngày sử dụng và càng rõ khi sử dụng kéo dài trong 14 ngày. Tác động bảo vệ gan Xét nghiệm sinh hóa Thử nghiệm 7 ngày Bảng 5. Kết quả xét nghiệm chức năng gan trong thử nghiệm 7 ngày Men gan (U/L) Bilirubin (mg/dL) Lô ALT AST TP TT GT Nước cất, dầu olive (n=7) 54,29 ± 4,02 183,29 ± 9,15 0,271 ± 0,029 0,157 ± 0,020 0,114 ± 0,014 Nước cất, CCl4/olive 0,25% (n=6) 2364 ## ± 548 1901** ± 441 0,333 ± 0,03 0,217 ± 0,031 0,117 ± 0,017 TNV, dầu olive (n=6) 48,7 ±3,55 161 ± 9,67 0,300 ± 0,026 0,183 ± 0,017 0,117 ± 0,017 TNV, CCl4/olive 0,25% (n=8) 335 $ ± 82,7 353,8 & ± 77,5 0,313 ± 0,023 0,175 ± 0,016 0,138 ± 0,018 Trắng (n=6) 57,86 ± 4,49 164,6 ± 12,5 0,271 ± 0,018 0,157 ± 0,020 0,114 ± 0,014 Thử nghiệm 14 ngày Bảng 6. Kết quả xét nghiệm chức năng gan trong thử nghiệm 14 ngày Men gan (U/L) Bilirubin (mg/dL) Lô ALT AST TP TT GT Nước cất, dầu olive(n=7) 60 ± 12 167,14 ± 6,06 0,371 ± 0,029 0,186±0,014 0,186±0,026 Nước cất, CCl4/olive 0,25% (n=7) 4884 ## ± 689 3947 ** ± 610 0,442 ± 0,020 0,243±0,020 0,200± 0,031 TNV, dầu olive(n=7) 62,86 ± 9,18 170 ± 10,5 0,400 ± 0,022 0,200 ± 0 0,200 ± 0,022 TNV, CCl4/olive 0,25% (n=8) 422 && ± 75,4 446,3 $$ ± 66,4 0,413± 0,044 0,225± 0,016 0,188 ± 0,035 Trắng (n=6) 58,67 ± 5,33 174,5 ± 13,2 0,333 ±0,042 0,150 ± 0,022 0,183 ± 0,040 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 492 Loâ H aøm lö ôïn g m en g an (U /L ) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 ALT AST $$ ** && ## ED olive n= 7 TNV olive n= 7 TNV CCl4/olive n= 8 traéng n= 6 ED CCl4/olive n=7 ^^ @@ A Loâ H aøm lö ôïn g bi lir ub in (m g/ dL ) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 bilirubin TP bilirubin TT bilirubin GT ED olive n= 7 TNV olive n= 7 TNV CCl4/olive n= 8 traéng n= 6 ED CCl4/olive n=7 B Hình 3. Hàm lượng men gan (A) và bilirubin (B) trong thử nghiệm 14 ngày với CCl4 0,25% ##, **, ^^, @@: p<0,01 khác biệt có ý nghĩa so với lô nước cất, olive &&, $$: p<0,01 khác biệt có ý nghĩa so với lô nước cất, CCl4/olive 0,25% Sau 7 ngày dùng TNV bảo vệ, men gan lô thử đã giảm xuống 5 – 7 lần so với lô gây độc (p<0,05). Sau 14 ngày dùng TNV bảo vệ, men gan lô thử đã giảm xuống 9 – 11 lần so với lô gây độc (p<0,01). Hàm lượng bilirubin trong huyết thanh không bị ảnh hưởng bởi CCl4 0,25%. Kết quả giải phẫu bệnh gan chuột Hình 4. Kết quả giải phẫu bệnh mô gan chuột Ở lô gây độc, gan bị viêm hiện diện nhiều ổ hoại tử quanh các tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, một số nơi khoảng cửa thấm nhập nhiều tế bào viêm và hoại tử. Sử dụng TNV bảo vệ trong 7 và 14 ngày đều làm giảm tình trạng viêm, hoại tử, số lượng ổ viêm ít hơn và các ổ viêm thu nhỏ hơn so với lô gây độc, mức độ cải thiện tình trạng viêm, hoại tử ở thử nghiệm 14 ngày tốt hơn thử nghiệm 7 ngày. Kết quả xét nghiệm sinh hóa và giải phẫu vi thể hoàn toàn phù hợp với kết quả của hai thử nghiệm chống oxy hóa đo MDA và PC. Khả năng bảo vệ tế bào gan của chế phẩm đã thể hiện hiệu quả cao trong việc chống lại quá trình oxy hóa gây tổn thương tế bào gan. Thời gian thử nghiệm càng dài thì kết quả bảo vệ càng rõ, có lẽ TNV có nguồn gốc từ dược liệu nên cần thời gian đủ dài để thể hiện được tác động tốt nhất. Lô nước cất, CCl4 0,25% (tế bào gan hoại tử ) Lô TNV, CCl4 0,25% (tế bào gan hoại tử điểm) Lô nước cất, tiêm olive Lô TNV, tiêm olive Lô trắng (tế bào gan bình thường) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 493 KẾT LUẬN Chế phẩm viên nang Tai Nấm Vàng thể hiện tác động bảo vệ tế bào gan chống lại các gốc tự do sinh ra từ CCl4 gây tổn thương tế bào gan. Thông qua kết quả các thử nghiệm chống oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình gây viêm bằng CCl4 0,25%, viên nang Tai Nấm Vàng đã thể hiện khả năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan sau 7 ngày với liều 1,4 g/kg thể trọng chuột x 2 lần/ngày. Kết quả nghiên cứu này hi vọng sẽ đóng góp một phần nhỏ trong quá trình phát triển nền y học dân tộc cũng như trong việc cải thiện, nâng cao sức khỏe cho nhân dân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bradford MM. (1976.) A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, pp. 95, 248-254. 2. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr. 831-833. NXB Y Học, Hà Nội. 3. Levine R. L., Garland D., Oliver C. N., Amici A., Climent I., Lenz A., Ahn B., Shaltiel S., and Stadtman E. R. (1990), Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins, Methods Enzymol, pp. 186, 464-478. 4. Lê Xuân Thám (1996), Nấm Linh chi - cây thuốc quí, tr. 12-20. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật 5. Okhawa H, Oheshi N, Yagi K. (1979), Assay for lipid peroxides in animal tissue with thiobarbituric acid reaction, Anal Biochem, pp. 351-354..