Tác dụng kháng Candida albicans in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 324 TÁC DỤNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS IN VITRO VÀ EX VIVO CỦA 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINON Nguyễn Đinh Nga*, Mai Phước Tân*, Quách Lâm Tư Ái** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Để sử dụng 2-methoxy-1,4 naphthoquinon như nguồn nguyên liệu cho tác động kháng nấm cần được chứng minh tác động kháng Candida albicans in vitro, in vivo của hợp chất này. Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát tác động kháng Candida spp. in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4 naphthoquinon so sánh với một số chất đối chiếu như cao BMT, ketoconazol, nystatin và terbinafin. Vật liệu và phương pháp: sử dụng phương pháp pha loãng theo NCCLS-M27-A2; khảo sát tác động của các chất kháng nấm trên dạng biofilm của C. albicans theo hướng dẫn của Gordon Ramage và cs.; xác định MIC ex vivo trên mô hình móng nhiễm C. albicans, biến đổi của mô hình gây nhiễm nấm móng thực nghiệm với T. rubrum và T. mentagrophytes. Kết quả: Kết quả nghiên cứu cho thấy 2-methoxy-1,4 naphthoquinon cho tác động kháng C. albicans in vitro và ex vivo tương đương cao BMT. Kết luận: Có thể sử dụng kết quả từ khảo sát tác động kháng C. albicans dạng biofilm và ex vivo trên mô móng để ước lượng liểu thử nghiệm in vivo của hợp chất này. Từ khóa: Cao Bông móng tay (BMT); 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; nồng độ tối thiểu ức chế in vitro (MIC in vitro); MIC ex vivo. ABSTRACT THE ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS IN VITRO AND EX VIVO OF 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINONE. Nguyen Dinh Nga, Mai Phuoc Tan, Quach Lam Tu Ai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 324 - 328 Background: To use a new substance (2-methoxy-1,4-naphtoquinone) as an antifungal agent, this substance has been determined the antifungal activity in vitro and in vivo. Objective: To determine the antifungal activity in vitro and ex vivo of 2-methoxy-1,4 naphthoquinone, a principle compound of balsam extract, extracted from Impatiens balsamina L. Balsaminaceae which was synthesized against Candida spp compare with balsam extract and some other antifungal agents. Material and methods: The antifungal activity against Candida spp. in vitro of these compounds were determined by the dilution method according to the guidline of NCCLS M27-A2. The MICs of these compounds against Candida albicans biofilms were carried out as the detail techniques of Gordon Ramage and cs. and MICs ex vivo were determined by modified model using the experimental tinea unguium to evaluate the antifungal activity against Trichophyton rubrum and T. mentagrophytes. Outcome: Data received from these experiments show the antifungal activities of 2-methoxy-1,4 naphthoquinone against Candida spp. were equivalent to balsam extract. Conclusion: 2-methoxy-1,4 naphthoquinone could be studied further more in vivo to use as an antifungal agent. *Khoa Dược-Đại học Y Dược TP. HCM *Đại học Mở TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 325 Keywords: balsam extract; 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; MIC in vitro; MIC ex vivo. ĐẶT VẤN ĐỀ Khi khảo sát một chất kháng nấm mới để đưa vào sử dụng, các vấn đề khó khăn mà các nhà nghiên cứu thường gặp là không tìm thấy sự tương đồng giữa tác động in vitro và hiệu quả điều trị lâm sàng, hoặc khó khăn trong việc tiên lượng nồng độ thử nghiệm in vivo từ kết quả in vitro. Cao Bông móng tay (cao BMT) chiết xuất từ cây Bông móng tay (Impatiens balsamina L. Balsaminaceae) với thành phần chính cho tác động kháng nấm là 2-methoxy-1,4 naphthoquinon, đã được chứng minh tác động kháng Candida albicans in vitro khá tốt(5). Tuy nhiên để có thể sử dụng cao BMT làm thuốc kháng nấm, hai vấn đề quan trọng cần phải giải quyết là nguồn nguyên liệu ổn định và hiệu quả kháng nấm in vivo. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi khảo sát tác động kháng Candida albicans in vitro; C. albicans dạng biofilm và MIC ex vivo trên mô hình gây nhiễm bệnh Candida trên mô móng tay của người khỏe mạnh cắt rời của 2-methoxy- 1,4 naphthoquinon (hoạt chất chính cho tác động kháng nấm của Bông móng tay) nguồn tổng hợp, nhằm xác định hướng sử dụng 2- methoxy-1,4 naphthoquinon như nguồn nguyên liệu kháng nấm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Vi nấm 22 chủng Candida albicans và 12 chủng Candida non albicans phân lập từ bệnh nhân nhiễm bệnh Candida niêm mạc. Candida albicans ATCC 10231. Chất kháng nấm 2-methoxy-1,4-naphthoquinon do Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM tổng hợp và cung cấp. Chất đối chiếu Cao Bông móng tay (BMT) chiết từ vỏ quả cây bông móng tay (Impatiens balsamina L. Balsaminaceae) có độ ẩm < 10% (xác định bằng máy đo độ ẩm - Moisture Analyzer offers halogen heating của Bộ môn Dược Liệu – Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP. HCM). Chứa khoảng 70% 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, định lượng bằng phương pháp đo quang. Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lô 50030107, hàm lượng 99,63%. Terbinafin HCl (SHRUTI BULK Drug PVT LTD). Nystatin, lô 4011316, do công ty cổ phần dược phẩm 3/2 cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Tác động kháng Candida albicans và Candida non albicans dạng nấm men (MIC in vitro) của các chất kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp pha loãng, theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2, sử dụng môi trường canh thang Mueller Hinton bổ sung glucose và xanh methylen. Tác động kháng Candida albicans ex vivo được thực hiện trên dạng biofilm của Candida albicans và trên Candida albicans nhiễm nấm móng thực nghiệm. Phương pháp xác định tác động kháng Candida albicans dạng biofilm trên bảng nhựa polystyren: Một trong những đặc điểm liên quan đến độc tính và khả năng kháng thuốc của C. albicans là sự tạo màng sinh học (biofilm) trên các vật liệu trơ. Sự tạo thành biofilm của C. albicans trên bảng nhựa polystyren sẽ tương tự như biofilm do vi nấm tạo thành ở dụng cụ y khoa như ống thông, răng giả, các chất cho hiệu quả kháng dạng biofilm của Candida sẽ có tiềm năng cho hiệu quả in vivo(1,3). Tác động kháng C. albicans dạng biofilm được thực hiện qua các giai đoạn sau: Sự tạo biofilms của C. albicans trên bảng nhựa polystyren, sử dụng môi trường glycin-glucose(2). Sau khi Candida albicans tạo biofilm và gắn dính vào bảng nhựa, rửa giếng 3 lần bằng dung dịch sinh lý-đệm phosphat vô trùng, thấm khô để Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 326 loại bỏ những tế bào nấm men lơ lửng trong môi trường. Dùng kính hiển vi nghịch đảo để khảo sát sự tạo thành biofilm của C. albicans trên bảng nhựa. (vi nấm ở dạng sợi bám dính vào đáy bảng nhựa, không bị mất đi ở giai đoạn rửa). Khảo sát hoạt tính của chất kháng nấm lên dạng biofilm của C. albicans Tác nhân kháng nấm là được pha loãng với môi trường YPG (yeast extract 5 g, pepton 10 g, glucose 20 g; nước cất 1000 ml) thành dãy nồng độ từ cao đến thấp vào các giếng đã có biofilm, cụ thể: 2-methoxy-1,4-naphthoquinon từ 256 µg/ml đến 0,125 µg/ml; cao BMT: 256 µg/ml - 0,125 µg/ml; nystatin: 32 µg/ml – 0,015 µg/ml; ketoconazol: 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml. Ủ ở 37 oC, sau 24-48 h đọc kết quả bằng cách quan sát sự phát triển trở lại của vi nấm gây đục môi trường. Mô hình gây nhiễm Candida albicans lên mô móng tay cô lập(4,6). Móng tay được cắt từ người tình nguyện không sử dụng sơn móng tay hay các chất đánh bóng khác, không bị các bệnh về móng. Móng tay được trữ trong lọ bijou 8 ml, dán nhãn và để trong tủ lạnh đến khi sử dụng. Cắt móng tay thành các mảnh 3 x 3 mm. Khi sử dụng, rửa bằng ethanol 70 %, lắc rung 3 lần, mỗi lần 1 phút và dịch sinh lý vô trùng, lắc rung 2 lần, mỗi lần 1 phút. Sau khi được rửa sạch, móng được để khô tự nhiên trong laminar ở nhiệt độ phòng. Gây nhiễm móng Nấm men C. albicans được hoạt hóa trên thạch YPG, ủ 37 oC. Sau 48 h lấy một vòng cấy nấm phân tán đều trong nước muối sinh lý có bổ sung 0,05 % Tween 80 để đạt 107 CFU/ ml. Số lượng tế bào nấm men được xác định bằng buồng đếm Neubauer. Pha loãng dịch treo nấm trong môi trường thạch nước (thành phần của môi trường thạch nước gồm K2HPO4 0,2%; MgSO4 0,005%; CaCl2 0,005%; agar 1,5%, nước cất 1 lit) sao cho mật độ nấm men là 106 CFU/ ml và cho thạch nước chứa nấm vào đĩa petri vô trùng. Đặt phần nền móng đã được xử lý vào đĩa Petri sao cho phần nền móng tiếp xúc với mặt thạch chứa nấm. Như vậy, Candida albicans chỉ sử dụng móng là nguồn dinh dưỡng duy nhất. ủ đĩa Petri ở 37 oC / 7 ngày. Kiểm tra sự phát triển của Candida albicans trên móng bằng kính hiển vi quang học, ở vật kính x10 và x40. Chuẩn bị chất kháng nấm Các chất kháng nấm được hòa tan trong dung dịch Polyethylen glycol – cồn ethyl (75:25) với nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử nghiệm, rồi được pha loãng 10 lần trong môi trường thạch YPG có bổ sung 0,05 % Tween 80 thành dãy nồng độ thử nghiệm: Terbinafin từ 2 – 0,06 %; Ketoconazole: 2 – 0,06 %; Cao bông móng tay: 0,5 – 0,015 %; 2-methoxy-1,4- naphthoquinon: 0,5 – 0,015 %. Móng sau khi được gây nhiễm nấm được chuyển sang đĩa petri môi trường chứa chất kháng nấm, đặt lưng móng tiếp xúc với môi trường, nền móng hướng lên trên, ủ 37 oC. Sau từ 5 – 7 ngày quan sát sự phát triển của Candida albicans quanh móng bằng mắt thường để xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi nấm. Sau khi đọc kết quả, các móng không thấy có vi nấm phát triển quanh móng sẽ được chuyển đĩa petri có chứa môi trường thạch Sabouraud mới, ủ 37 oC trong 2 ngày để xác định nồng độ tối thiểu diệt nấm (MFC) trên mô móng. KẾT QUẢ Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của Candida albicans và Candida non albicans in vitro của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT và ketoconazol. Kết quả ở bảng 1 cho thấy 2-methoxy-1,4- naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp. in vitro tương đương cao BMT, và tác động trên những chủng C. albicans nhạy trung gian với ketoconazol. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 327 Bảng 1. Tác động kháng Candida spp. của 2- methoxy-1,4-naphthoquinon in vitro Phân bố các chủng theo khoảng MIC (μg/ml) Chủng nấm Chất kháng nấm 16 Ketoconazole 16 5 0 Cao BMT 0 20 1 Candida albicans (n=21) 2-methoxy-1,4- naphthoquinon 0 20 0 Ketoconazole 12 0 0 Cao BMT 0 12 0 Candida non albicans (n=12) 2-methoxy-1,4- naphthoquinon 0 11 1 Tác động kháng Candida albicans dạng biofilm của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT và ketoconazol. Bảng 2. So sánh MIC của các chất kháng nấm trên dạng biofilm và dạng nấm men của C. albicans. Chất kháng nấm MIC biofilm (µg/ml) MIC in vitro (µg/ml) 2-methoxy-1,4-naphthoquinon 32 8 Cao BMT 32 16 Nystatin 3 2 Ketoconazol 0,9 0,06 - 0,125 Ghi chú: Số liệu nhận được là trung bình của 9 lần lập lại thử nghiệm. Kết quả bảng 2 cho thấy, nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans dạng biofilm của ketoconazol là 0,9 µg/ ml, cao hơn nồng độ MIC in vitro khoảng 10 lần. 2-methoxy-1,4-naphthoquinon và cao Bông móng tay có nồng độ ức chế tối thiểu C. albicans dạng biofilm là 32 x 10-3 mg/ml, gấp 2- 4 lần MIC in vitro. Riêng Nystatin là chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC in vitro. Tác động kháng Candida albicans trên mô móng của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT, ketoconazol và terbinafin. Bảng 3. Tác động kháng C. albicans ở mô hình móng của các chất kháng nấm Nồng độ chất thử (mg/ml) Chất thử MIC (in vitro) MIC (ex vivo) MFC (ex vivo) Terbinafin - 5 20 Ketoconazol 0,03 x 10-3 10 20 Cao Bông móng tay 0,016 1,25 2,5 Nồng độ chất thử (mg/ml) Chất thử MIC (in vitro) MIC (ex vivo) MFC (ex vivo) 2-methoxy-1,4- naphtoquinon 0,008 1,25 5 Ghi chú: (-) không thử Các nồng độ MIC và MFC ex vivo được thực hiện với ít nhất 6 mẫu móng tay khác nhau cho mỗi chất kháng nấm. Thí nghiệm được thực hiện song song với lô chứng gồm 6 mẫu móng tay được gây nhiễm nhưng không tiếp xúc với các chất kháng nấm BÀN LUẬN Tác động kháng Candida spp. của 2- methoxy-1,4-naphthoquinon, cao BMT và ketoconazol in vitro: Kết quả ở bảng 1 cho thấy: Tỉ lệ các chủng Candida phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida niêm mạc nhạy với ketoconazol, với khoảng MIC < 8 μg/ml là 16/21, chiếm 76,19%; 5/21 chủng có độ nhạy trung gian với MIC từ 8-16 μg/ml chiếm 23,81%; không có chủng kháng ketoconazol. 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp. in vitro tương đương cao BMT và tác động trên những chủng C. albicans nhạy trung gian với ketoconazol. Tác động kháng Candida albicans dạng biofilm của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT và ketoconazol. Kết quả khảo sát tác động của các chất kháng nấm trên C. albicans dạng biofilm được tạo trên bảng nhựa polystyren cho thấy: Nystatin là chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC in vitro. Các chất thử nghiệm còn lại đều có nồng độ tối thiểu tác động trên C. albicans dạng biofilm cao hơn MIC in vitro. Ketoconazol là chất kìm nấm cho nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans dạng biofilm cao hơn nồng độ MIC in vitro khoảng 10 lần. 2-methoxy-1,4-naphthoquinon và cao Bông móng tay ức chế được dạng biofilm của C. albicans với nồng độ ức chế tối thiểu cao Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 328 gấp 2-4 lần MIC in vitro, nên là một ứng viên có thể nghiên cứu tiếp theo để sử dụng như nguồn nguyên liệu làm thuốc kháng nấm. Khảo sát tác động kháng C. albicans trên mô móng tay của các chất kháng nấm. So sánh tác động kháng C. albicans in vitro và tác động kháng Candida albicans trên mô móng tay (ex vivo) của ketoconazol, có thể thấy sự khác biệt về nồng độ ức chế nấm giữa hai phương pháp thử rất lớn, MIC ex vivo của ketoconazol cao hơn MIC in vitro khoảng 33 ngàn lần. Nồng độ MIC và MFC ex vivo của ketoconazol phù hợp với nồng độ trong chế phẩm dung ngoài đang lưu hành trên thị trường (kem Nizoral* chứa hoạt chất ketoconazol 2 %). Nồng độ MIC và MFC ex vivo của terbinafin cũng nằm trong khoảng nồng độ của chế phẩm Lamisil* đang lưu hành trên thị trường (kem lamisil* chứa hoạt chất Terbinafin 1 %). Nồng độ MIC và MFC ex vivo của cao Bông móng tay và 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cao hơn MIC in vitro từ 156 – 625 lần. 2-methoxy-1,4- naphthoquinon tuy có MIC in vitro và ex vivo thấp hơn cao Bông móng tay, nhưng MFC ex vivo lại cao hơn gấp đôi, điều này có thể do khả năng thấm vào móng của cao Bông móng tay tốt hơn 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, hoạt chất riêng rẽ. Do có sự khác biệt lớn giữa nồng độ tác động kháng C. albicans của chất thử in vitro và ex vivo, đồng thời có sự phù hợp giữa nồng độ tác động kháng C. albicans ở móng và nồng độ của chất thử trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường nên có thể áp dụng mô hình này để phỏng đoán liều thử nghiệm in vivo của một số chất kháng nấm mới nhằm giảm được thời gian dò liều, giảm số thú thử nghiệm và giảm chi phí. Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM đã cung cấp kinh phí và tạo điều kiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ernst J.E. và Rogers P.D. (2007), Methods in Molecular medicine, Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188, Humana Press Inc, Totowa, NJ, 71-75. 2. Gülhan Vardcer-Ünlü, (1998). A comparison of germ tube production by Candida albicans in three media, Tr. J. of Biology, 22, 2005-2010. 3. Jain N., Kohli R., Cook E., Gialanella P., Chang T., and Fries B.C. (2007), Biofilm formation by and antifungal susceptibility of Candida isolate from urine, Applied and enviromental microbiology, ASM. 1697-1703. 4. Nguyen Đinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Thu Guong (2009). Using the experimental tinea unguium model to evaluate the antifungal activity against Trichophyton of some plant extracts. Pharma Indochina VI-(The development of Indochina Pharmacy in context of Global economic Recession) Proceeding of the sixth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences. 771-775. 5. Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009). Tổng hợp và tác dụng kháng nấm của methyl lawson, thành phần chính của cây bông móng tay. Tạp chí dược học, 49(395), 29-32 6. Yazdanparast S.A. and Bartin C.R. (2006), Athroconidia production in Trichophyton rubrum and new ex vivo model of onychomycosis, Journal of Medical Microbiology, 55, 1577- 1581.