Tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc tủy răng người

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 10 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI Trần Lê Bảo Hà*, Đoàn Nguyên Vũ*, Tô Minh Quân*, Nguyễn Thị Nhật Uyên*, Lê Thị Ngọc Hương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ*, Phan Kim Ngọc*, Nguyễn Thị Thư**, Đặng Vũ Ngọc Mai**, Hoàng Đạo Bảo Trâm**, Hoàng Tử Hùng** TÓM TẮT Mở đầu: Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện tủy răng là mô có chứa tế bào gốc. Tế bào gốc tủy răng là một nguồn tế bào dễ thu nhận vì không xâm lấn, có tiềm năng tăng sinh và biệt hóa cao, có thể được lưu trữ trong nhiều năm, tương tác tốt với nhiều loại vật liệu sinh học. Đối tượng và phương pháp: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu nhận và khử trùng mô tủy răng người. Sau đó, tế bào tủy răng được phân lập và nuôi cấy. Sự hiện diện của quần thể tế bào gốc trong hỗn hợp tế bào sau nuôi cấy được xác định bằng phương pháp khảo sát sự tăng sinh và kỹ thuật Flow cytometry. Đồng thời, ngà răng cũng được sử dụng làm khung nâng đỡ cho tế bào gốc tủy răng. Kết quả: Kết quả cho thấy, chúng tôi đã thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc tủy răng người. Quần thể tế bào sau nuôi cấy biểu hiện các marker là CD13, CD44, CD90, CD105, CD166. Tế bào gốc tủy răng có khả năng tăng sinh trên bề mặt ngà đã xử lí bằng hóa chất. Kết luận: Với những kết quả đã đạt được, tế bào gốc tủy răng hứa hẹn sẽ là nguyên liệu quan trọng cho những nghiên cứu trong kỹ nghệ mô cũng như trong lĩnh vực nha khoa tái tạo. Từ khóa: Bề mặt ngà, nuôi cấy sơ cấp, flow cytometry, tế bào gốc, tủy răng người. ABSTRACT APPLIED POTENTIAL OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS Tran Le Bao Ha, Doan Nguyen Vu, To Minh Quan, Nguyen Thi Nhat Uyen, Le Thi Ngoc Huong, Nguyen Thi Ngoc My, Phan Kim Ngoc, Nguyen Thi Thu, Dang Vu Ngoc Mai, Hoang Dao Bao Tram, Hoang Tu Hung * Y hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 – No.1 – 2012: 10 - 17 Background: Recently, scientists have found that dental pulp tissue contains stem cells. Dental pulp stem cells as a source of cells are easy to obtain for non-invasive, has the highly potential to grow and differentiate, can be stored for many years, interact well with many types of biomaterials. Materials and method: In this research, we performed the experiments to collect and disinfect human dental pulp tissue. Then, dental pulp cells are isolated and cultured. The presence of stem cell populations in cultured cells is determined by proliferation assay and Flow cytometry. Simultaneously, dentin was used as a scaffold for the dental pulp stem cells. Results: Results shown that we are successful in collection and culture of human dental pulp stem cells. Populations of cultured cells are positive for expression of CD13, CD44, CD90, CD105, CD166 markers. Dental pulp stem cells can proliferate on chemically treated dentin surface. Conclusion: With the results achieved, dental pulp stem cells promises to be an important material for research in tissue engineering as well as in dental regeneration. *Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia-thành phố Hồ Chí Minh **Đại học Y Dược, thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.Trần Lê Bảo Hà ĐT: 0988575507 Email: tlbha@hcmus.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học 11 Keywords: dentin surface, primary culture, flow cytometry, stem cells, human dental pulp. MỞ ĐẦU Trên thế giới, tế bào gốc tủy răng đã được nuôi cấy thành công chỉ trong vài năm gần đây và có khả năng ứng dụng rất cao. Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập tế bào tủy răng của nhiều loài khác nhau. Các nghiên cứu này đã chứng minh tế bào gốc tủy răng có khả năng tăng sinh cao và biệt hóa thành dạng tế bào khoáng hóa trong môi trường thích hợp (Nakashima, 1991; Nakashima et al., 1994; Kettunen et al., 1998; Buchaille et al., 2000; Yokose et al., 2000). Các tế bào tủy răng được xác định là có biểu hiện một số marker của tế bào gốc như STRO-1 (Shi, Gronthos, 2003; Shi et al., 2005), CD146 (Gronthos et al., 2003; Miura et al., 2004) và Oct4 (Huang et al., 2006). Bên cạnh những nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng, các khung nâng đỡ ba chiều như alginate, collagen, polymer, sứ cũng được phát triển nhằm ứng dụng trong nha khoa tái tạo (Kumabe et al., 2006; Zhang et al., 2006; Young et al., 2002; Gronthos et al., 2002). Trong đó, khung nâng đỡ ngà răng được chứng minh có khả năng cảm ứng tế bào gốc tủy răng biệt hóa thành nguyên bào ngà (Huang et al., 2006). ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Răng cối nhỏ và răng khôn còn nguyên vẹn, không bị sâu thối tủy của người tình nguyện được thu từ Khoa Răng Hàm Mặt, Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh và Khoa Nội Nha, Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh. Răng được chứa trong lọ có dung dịch bảo quản. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào tủy răng Sau khi tách khỏi răng, mẫu tủy được cắt thành những mảnh nhỏ (2x2x1 mm) và được nuôi trong đĩa 35mm (Nunc) với môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung 10% FBS (huyết thanh thai bò-Gibco), 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin. Xác định tính gốc của tế bào tủy răng người Đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt chai nuôi cấy Các tế bào được cấy chuyền sang đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/cm2. Mật độ tế bào được xác định mỗi ngày bằng buồng đếm tế bào cùng với thuốc nhuộm trypan blue. Phương pháp Flow cytometry Các tế bào ở lần cấy chuyền thứ tư được thu nhận bằng trypsin/EDTA 0,25%, điều chỉnh mật độ tế bào đạt 106 tế bào/ml. Huyền phù tế bào trong 1ml Facs Flow và nhuộm với 10µl kháng thể trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (CD13-PE, CD44-PE, CD90-FITC, CD105-PE, CD166-PE, CD34-FITC, CD45-FITC, BD Sciences, San Jose, CA). Làm lạnh mẫu trong 15 phút ở 40C. Tiến hành đánh giá marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử dụng phần mềm Cell Quest Pro. Khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người trên khung nâng đỡ ngà răng Khung nâng đỡ ngà răng được tạo ra từ răng khôn người. Bề mặt của những khung nâng đỡ ngà sẽ được xử lý lần lượt với các hóa chất citric axit 19% trong 1 phút, EDTA 17% trong 10 phút để loại bỏ lớp mùn ngà. Hiệu quả của phương pháp xử lý bề mặt khung nâng đỡ ngà được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét. Khung nâng đỡ ngà răng được đặt trong đĩa 96 giếng với môi trường nuôi cấy. Sau đó, các tế bào gốc tủy răng ở lần cấy chuyền thứ tư được cấy lên bề mặt ngà với mật độ 104 tế bào/cm2. Sự tăng sinh của tế bào được xác định bằng phương pháp MTT ở các ngày nuôi cấy thứ 2, 4, 6, 8, 10. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 12 Xử lý số liệu Số liệu thu nhận được xử lý theo chương trình Statgraphic 7.0 của Trường Đại học Michigan (Mỹ). KẾT QUẢ Kết quả nuôi sơ cấp mô tuỷ răng Vào ngày nuôi cấy thứ 7, bắt đầu xuất hiện các tế bào trải; các tế bào có nhiều hình dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mô Trong những ngày nuôi cấy sau đó, các dạng tế bào dần dần thu hẹp lại; dạng tế bào chiếm ưu thế là dạng tế bào trải rộng, nhân lớn hình oval và có nhiều đuôi bào tương. Ngày thứ 21, các tế bào bắt đầu hợp dòng, trải thành một lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa nuôi, đây là thời điểm thích hợp để thu nhận tế bào (Hình 1). Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt chai nuôi cấy Đồ thị 1 cho thấy sau khi được cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến ngày 6, đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó giảm nhanh đến ngày 9. Kết quả xác định marker tế bào gốc Các tế bào tủy răng nuôi cấy ở thế hệ thứ tư được đánh giá sự biểu hiện marker bề mặt bằng Flow cytometry. Kết quả cho thấy, các tế bào ứng viên dương tính mạnh với các marker CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%), CD105 (91,95%), CD166 (98,18%) và âm tính với các marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%) (Hình 2). Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người trên bề mặt ngà Kết quả đánh giá hiệu quả xử lý bề mặt ngà Dựa vào kết quả chụp kính hiển vi điện tử quét, chúng tôi nhận thấy rằng bề mặt ngà chưa xử lý bị bao phủ hoàn toàn bởi lớp mùn ngà nhưng khi được xử lý thì lớp mùn ngà đã được loại bỏ hoàn toàn và để lộ ra các ống ngà trên bề mặt (Hình 3). C D A B Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học 13 Hình 1. Tế bào mọc lan ra từ mảnh mô sau các ngày nuôi cấy. A. Mảnh mô tủy răng trong đĩa nuôi (100X); B. Tế bào tủy răng sau 7 ngày nuôi cấy (100X); C. Tế bào tủy răng sau 15 ngày nuôi cấy (100X); D. Tế bào tủy răng sau 21 ngày nuôi cấy (100X). Số tế b ào (x 1 04 tế b ào /c m 2 ) Thời gian Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 14 Đồ thị 1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy. Hình 2. Kết quả phân tích Flow cytometry của tế bào tủy răng ứng viên. Hình 3. Hình chụp bề mặt ngà răng bằng kính hiển vi điện tử quét. A. Bề mặt ngà răng chưa xử lý (1000X); B. Bề mặt ngà răng đã xử lý (2000X). Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người trên khung nâng đỡ ngà răng A B Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học 15 Đồ thị 2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời gian nuôi cấy. Kết quả khảo sát bằng MTT cho thấy tế bào gốc tủy răng người có khả năng bám dính và tăng sinh tốt trên khung nâng đỡ ngà răng đã xử lý. BÀN LUẬN Tế bào gốc tủy răng Các nhà khoa học đã chứng minh đây là một nguồn tế bào gốc có tiềm năng ứng dụng điều trị lâm sàng giống như các nguồn tế bào gốc đã được tìm ra trước đây. Sở dĩ, tế bào gốc tủy răng nhận được sự quan tâm đặc biệt là do chúng có nhiều ưu điểm nổi bật. Thứ nhất, nguồn tế bào này có thể được thu nhận trong suốt đời sống của mỗi người; đặc biệt thu nhận tốt nhất ở răng sữa khi nguồn gen chưa chịu nhiều tác động của môi trường bên ngoài. Thứ hai, việc thu nhận nguồn tế bào này ít gây xâm lấn đối với bệnh nhân, diễn ra như một quá trình tự nhiên (rụng răng ở trẻ em). Thứ ba, việc sử dụng nguồn tế bào này không vướng phải các vấn đề về đạo đức, tôn giáo giống như tế bào gốc phôi. Đây cũng là một nguồn tế bào gốc có tiềm năng biệt hóa cao có thể được ứng dụng điều trị nhiều mô và cơ quan khác của cơ thể. Shi và đồng tác giả (2003) đã phát hiện dòng tế bào gốc răng sữa người có thể dễ dàng được bảo quản và sử dụng cho các liệu pháp điều trị trong tương lai. Các tế bào này xuất hiện ở tuần thứ sáu của quá trình phát triển phôi người; chúng có khả năng tăng trưởng và tiềm năng biệt hóa cao hơn những nguồn tế bào gốc trưởng thành khác. Abbas và đồng tác giả (2008) đã chứng minh rằng tế bào gốc từ tủy răng có nguồn gốc từ mào thần kinh. Tế bào gốc tủy răng có biểu hiện các marker tế bào có nguồn gốc phôi Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81CD44 và các marker tế bào gốc trung mô CD90, CD146, CD166, CD73, CD105, CD44, CD49b (Kerkis et al., 2006; Jo et al., 2007; Baghaban et al., 2009; Erdal Karaöz et al., 2009). Kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh rằng tế bào tủy răng có khả năng bám dính và tăng sinh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Ngoài ra, các tế bào nuôi cấy biểu hiện các marker CD13, CD44, CD90, CD105, CD166 đây là các marker của tế bào gốc trung mô. Từ các kết quả thu được, chúng tôi thấy rằng quần thể tế bào gốc trung mô từ tủy răng người đã có sự đồng nhất ở thế hệ nuôi cấy thứ tư và các tế bào này vẫn duy trì được đặc tính gốc trong quá trình nuôi cấy in vitro. Ngoài ra, các protein biểu hiện trên bề mặt của tế bào gốc tủy răng cho thấy chúng không chỉ có khả năng biệt hóa thành các tế bào cơ bản thuộc lớp trung mô như nguyên bào ngà, nguyên bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ, tế bào cơ mà còn có khả năng chuyển biệt hóa thành các tế bào chức năng không thuộc lớp trung mô như tế bào β ở tuyến tụy, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim, tế bào giống tế bào gan (Kerkis et al., 2006; Huang et al., 2006; Baghaban et al., 2009; Jinhua et al., 2010). Tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc tủy răng Thời gian M ật đ ộ qu an g (O D ) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 16 Tế bào gốc tủy răng có thể dùng để tái tạo xương và sửa chữa khiếm khuyết sọ mặt. Những nghiên cứu in vitro và in vivo đều cho thấy rằng các tế bào gốc trưởng thành từ răng có khả năng tái tạo chân răng nếu có được nhân tố tăng trưởng và khung nâng đỡ phù hợp. Liệu pháp tái tạo ít gây tổn thương cho bệnh nhân hơn là phẫu thuật cấy ghép; những nghiên cứu trên mô hình động vật đã cho thấy hiệu quả điều trị và hoạt động chức năng của mô cấy ghép sinh học trội hơn rất nhiều so với phương pháp implant và các phương pháp truyền thống khác. Tế bào gốc tủy răng có khả năng tăng sinh vô hạn, đa tiềm năng nên chúng sẽ là nguồn tế bào gốc quan trọng để tái tạo và sửa chữa các khiếm khuyết sọ mặt, mất răng và tổn thương xương. Do có khả năng sản xuất và tiết ra các yếu tố thần kinh, tế bào gốc tủy răng cũng có khả năng điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh và sửa chữa những tế bào thần kinh vận động sau đột quỵ hay chấn thương. Tế bào gốc từ răng khôn có khả năng tiết ra chất giúp duy trì sự sống của dây thần kinh sau chấn thương. Trong tương lai, tế bào gốc từ răng có thể được ứng dụng nhằm tái tạo tế bào thần kinh cho những bệnh nhân chấn thương cột sống. Tế bào gốc tủy răng có thể được cấy ghép vào buồng tủy để tái tạo tủy mới cho những chiếc răng bị sâu, giảm thiểu việc điều trị nội nha. Cordeiro và đồng tác giả (2008) đã đánh giá đặc điểm hình thái của mô được hình thành khi cấy ghép tế bào gốc răng sữa vào giá thể có khả năng phân hủy sinh học; sau đó, đưa phức hợp này lên lát cắt ngà răng người và cấy vào chuột suy giảm miễn dịch. Kết quả cho thấy rằng cấu trúc mô được hình thành gần giống với tủy sinh lý. Trong những nghiên cứu gần đây, De Mendonça Costa A (2008) đã phân lập các tế bào gốc từ tủy răng người để tái tạo khiếm khuyết xương sọ có kích thước lớn ở chuột. Kết quả cho thấy rằng tổn thương ở chuột được chữa lành, ông cho rằng đây là một nguồn tế bào gốc đầy hứa hẹn nhằm tái tạo khiếm khuyết trong phẫu thuật sọ mặt. Liệu pháp tế bào gốc đã được đề nghị ứng dụng điều trị nhiều căn bệnh như Parkinson, đa xơ cứng, bệnh gan, tiểu đường, tim mạch, tự miễn, rối loạn cơ xương, tái tạo thần kinh sau chấn thương não hay tủy sống, ứng dụng điều trị gãy xương, ung thư và phẫu thuật cột sống. Khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào gốc tủy răng Các polymer tự nhiên có tính tương hợp sinh học cao và không gây ra các phản ứng thải loại khi ghép vào bệnh nhân. Collagen là một protein quan trọng trong cơ thể người. Nó cũng là thành phần chủ yếu của tủy răng và chất nền ngà răng. Do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng collagen làm khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào tủy răng. Zhang và đồng tác giả (2006) đã chứng minh chất nền collagen kích thích tế bào gốc tủy răng bám dính và tăng sinh tốt. Kumabe và đồng tác giả (2006) đã đưa tế bào tủy răng vào giá thể alginate; sau đó cấy dưới da bụng chuột. Sau 6 tuần cấy ghép, trong giá thể xuất hiện những thể khoáng hóa. Các polymer tổng hợp đang được sử dụng phổ biến do có những ưu điểm như có thể được tổng hợp và kiểm soát các đặc tính hóa lý (cấu trúc, độ bền, kích thước lỗ và tỉ lệ thoái biến). Young và đồng tác giả (2002) đã nuôi cấy tế bào gốc tủy răng trên ba loại khung nâng đỡ từ polymer tổng hợp polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactide-co-glycolide) (PLGA); kết quả cho thấy có sự hình thành phức hợp ngà tủy bên trong khung nâng đỡ. Vật liệu sứ đã được ứng dụng rộng rãi trong kỹ nghệ mô xương và nha khoa phục hồi (răng sứ, mão). Trong ứng dụng lâm sàng cho thấy loại vật liệu này có nhiều ưu điểm như kích thích tế bào bám dính và khoáng hóa, liên kết tốt với mô xung quanh khi cấy ghép và giúp lành vết thương nhanh hơn kim loại. Gronthos và đồng tác giả (2002) đã chứng minh một lớp giống ngà răng được hình Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học 17 thành khi cấy khung nâng đỡ sứ có mang tế bào gốc tủy răng trên chuột suy giảm miễn dịch. Ngoài ra, các nhà khoa học đã nghĩ tới việc sử dụng ngà răng làm khung nâng đỡ nuôi cấy tế bào gốc tủy răng và đạt nhiều kết quả đáng kể. Batouli và đồng tác giả (2003) nuôi cấy tế bào tủy răng người trên bề mặt ngà; sau đó, cấy vào chuột suy giảm miễn dịch, thì nhận thấy có một cấu trúc giống như ngà được hình thành trên bề mặt ngà. Huang và đồng tác giả (2006) chứng minh khung nâng đỡ ngà răng có khả năng cảm ứng tế bào gốc tủy răng biệt hóa thành nguyên bào ngà. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh khung nâng đỡ ngà răng có khả năng kích thích tế bào gốc tủy răng bám dính và tăng sinh tốt. Đây là tiền đề cho việc phát triển phương pháp điều trị mới nhằm ứng dụng nguồn tế bào gốc này để tái tạo tủy răng giống tự nhiên. Ngân hàng tế bào gốc tủy răng Thời gian gần đây, ngân hàng tế bào gốc tủy răng rất được phổ biến và nhận được sự quan tâm đặc biệt của nhiều công ty trên thế giới. Các phòng thí nghiệm BioEden (Austin, Texas) ở Mỹ, International laboratories ở Anh (khu vực Châu Âu) và Thái Lan (khu vực Đông Nam Á) với những kế hoạch mở rộng sang Nga, Úc và Trung Đông. Các công ty cũng tham gia thành lập ngân hàng tế bào gốc tủy răng như StemSave và Store-A-Tooth ở Mỹ Tại Nhật Bản, ngân hàng tế bào gốc tủy răng đầu tiên được thành lập tại Đại học Hiroshima với tên là “Three Brackets” (Suri Buraketto) vào năm 2005. Đại học Nagoya (Kyodo, Nhật Bản) cũng thành lập một ngân hàng vào năm 2007. Trường Đại học Y Taipei (TMU) phối hợp với Đại học Hiroshima mở ngân hàng răng quốc gia vào tháng 9 năm 2008 với mục tiêu lưu trữ răng cho cấy ghép tự nhiên và cung cấp nguồn tế bào gốc tủy răng. KẾT LUẬN Chúng tôi đã nuôi cấy và xác định thành công sự hiện diện của quần thể tế bào gốc trung mô trong hỗn hợp tế bào tủy răng người nuôi cấy. Thêm nữa, các tế bào này có khả năng tăng sinh tốt trên bề mặt ngà răng. Việc thu nhận và lưu trữ những tế bào gốc tủy răng như nguồn tế bào dự trữ cho tương lai khi con người cần đến chúng nhất. Lời cảm ơn: Chúng tôi chân thành cảm ơn Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp mẫu răng để tiến hành thí nghiệm này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abigail ST, Paul TS (2004) The Cutting Edge of Mammalian Development: How the Embryo Makes Teeth. Nat Rev Genet 5: 499-508. 2. Baghaban Eslaminejad MR, Nazarian H, Shariati M,Vahabi S (2009) Human Dental Pulp Stem Cells: The Culture Optimization for Increased Growth. IJHOSCR 3: 5-13. 3. Batouli S, Miura M, Brahim J, Tsutsui TW, Fisher LW, Gronthos S, Robey PG, Shi S (2003) Comparison of stem- cell-mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent Res 82: 976-981. 4. Conan SY, Shinichi T, Joseph PV, Masaki H, John DB, Pamela CY (2002) Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds. J Den Res 81: 695-700. 5. George TJH, Wataru S, James C, Sang HP (2006) In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods ang culturing enviroment. Cell Tissue Res 10: 1-23. 6. Gronthos S, Brahim J, li W, Fisher LW, Cherman N, Boyed A, DenBesten B, Robey PG, Shi S (2002) Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res 81:531-535. 7. Jinhua Y, Huixia H, Chunbo T, Guangdong Z, Yuanfei L, Ruoning W, Junnan S, Yan J (2010) Differentiation potential of STRO-1+ dental pulp stem cells changes during cell passaging. BMC Cell Biol 11: 32-39. 8. Jinhua Y, Zhihong D, Junnan S, Huihong Z, Xin N, Heng Z, Yucheng L, Yan J (20