Tiêu chuẩn hóa cao chiết và viên nang bổ dương hoàn ngũ thang

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 207 TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT VÀ VIÊN NANG BỔ DƯƠNG HOÀN NGŨ THANG Trương Hữu Nhàn*, Trần Thị Bạch Tuyết*, Phan Quan Chí Hiếu**, Nguyễn Phương Dung**, Bùi Mỹ Linh**, Phạm Thị Mỹ Nhung***, Trần Phúc Vinh*** TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Bài thuốc Bổ dương hoàn ngũ thang (BDHNT) được sử dụng trong điều trị phục hồi liệt vận động sau đột quị dưới dạng thuốc sắc. Để việc sử dụng thuốc được tiện lợi hơn, bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình phước đã bào chế dưới dạng viên nang. Đề tài này được tiến hành để khảo sát các thông số lý hóa, xác định sự hiện diện của các dược liệu, định lượng saponin, protein toàn phần trong cao chiết và thành phẩm để làm cơ sở cho các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng tiếp theo. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao chiết và viên nang BDHNT được cung cấp bởi Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình phước. Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định sự hiện diện của các nguyên liệu trong chế phẩm. Áp dụng phương pháp cân để định lượng saponin, protein toàn phần trong cao chiết và chế phẩm. Kết quả: Cao chiết và viên nang BDHNT đạt các yêu cầu về độ ẩm, độ tro, pH, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, độ rã, độ đồng đều khối lượng quy định trong Dược điển Việt Nam IV. Trên hình ảnh sắc ký đồ của chế phẩm cho thấy có sự hiện diện của 6 loại dược liệu. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao chiết và viên nang BDHNT lần lượt là 80mg/1 g và 40 mg/viên. Hàm lượng protein toàn phần trong cao chiết và viên nang BDHNT lần lượt là 180mg/1 g và 90 mg/viên. Kết luận: Đã áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và phương pháp cân trong tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng viên nang BDHNT. Từ khóa: Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang, phương pháp sắc ký lớp mỏng, saponin toàn phần, phương pháp cân. ABSTRACT STANDARDIZATION OF BO DUONG HOAN NGU THANG EXTRACT AND CAPSULE Truong Huu Nhan, Tran Thi Bach Tuyet, Phan Quan Chi Hieu, Nguyen Phuong Dung, Bui My Linh, Pham Thi My Nhung, Tran Phuc Vinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 207 –212 Background – Objectives: Bo Duong Hoan Ngu Thang (BDHNT) is a traditional remedy that have been used in the rehabilitation of motor deficit after stroke. To increase user-friendly, Traditional Medicine Hospital in Binh Phuoc province have changed this remedy into capsule. This study was conducted for determining technical standards and analysing main chemical components from Bo Duong Hoan Ngu Thang extract and capsule. Materials & Methods: BDHNT extract and capsules were supplied by Traditional Medicine Hospital in Binh Phuoc provice. Thin layer chromatography method was used to dertermine the presence of herbal medicines in BDHNT extract and capsules. Results: BDHNT extract and capsules are fit to standards of humidity, ashes, pH, heavy metal residues, * Bệnh viện Y học Cổ truyền tỉnh Bình Phước ** Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược Tp. HCM *** Công ty Cổ phần Dược phẩm Khang Minh Tác giả liên lạc: BS Trương Hữu Nhàn, ĐT: 0913109196 Email: truonghuunhan63@yahoo.com.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 208 bacterial contamination mentioned in VietNam Pharmacopea IV. All 6 medicinal herbals in BDHNT remedy were shown on thin layer chromatography plaques. The total saponins of extract and capsules were 80 mg/1 g and 40 mg/capsule. The total protein of extract and capsule were 180 mg/1 g and 90 mg/capsule. Conclusion: Used thin layer chromatography and balanced methods to standardise and evaluate quality of BDHNT extract and capsule. Keywords: Bo Duong Hoan Ngu Thang, thin layer chromatography method, balanced method, total saponin. ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quị là một nhóm bệnh gây tử vong cao và tàn tật nặng nề khá phổ biến. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật có thể làm giảm tỉ lệ tử vong trên số BN đột quị, song song đó thì sự sống sót tàn phế tăng(7). Bệnh nhân sau đột quị thuộc loại đa tàn tật. Tùy theo tình trạng khiếm khuyết thần kinh, những nội dung phục hồi chức năng sau đột quị thường là phục hồi nhận thức, phục hồi trí nhớ, phục hồi vận động. Nội dung phục hồi chức năng vận động thường phổ biến và được quan tâm nhiều vì có liên quan chặt chẽ đến hoạt động sống và lao động hàng ngày của các bệnh nhân(6). Bài thuốc BDHNT (gồm các dược liệu Hoàng kỳ, Đương quy vĩ, Xích thược, Đào nhân, Xuyên khung, Hồng hoa, Địa long) có xuất xứ từ bộ sách Y lâm cải thác, chuyên chữa chứng bệnh bán thân bất toại, khẩu nhãn oa tà, trở ngại ngôn ngữ,... sau trúng phong của YHCT (di chứng liệt nửa người, miệng méo, mắt xếch, nói ngọng... do đột quị – theo quan niệm tây y)(10),... Tại Việt Nam, một số tài liệu khoa học có đưa ra việc sử dụng bài thuốc BDHNT để phối hợp với các phương pháp khác nhằm điều trị phục hồi liệt vận động trên bệnh nhân sau đột quị(2,6,9,5,8). Dạng bào chế cổ truyền của bài thuốc BDHNT là thuốc sắc nên có một số bất lợi, như: mùi, vị thuốc khó uống; bảo quản, dự trữ các dược liệu thường khó khăn, dễ bị ẩm mốc; mất nhiều thời gian và ngày càng không phù hợp với nhịp sống công nghiệp. Một chế phẩm sử dụng an toàn, có hiệu quả, tiện lợi trong phục hồi chức năng vận động trên bệnh nhân sau đột quị là cần thiết. Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Bình Phước đã chuyển dạng bài thuốc này thành viên nang. Nghiên cứu này được thực hiện để tiêu chuẩn hóa chất lượng cao chiết và viên nang BDHNT, là một tiền đề cần thiết cho những thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng tiếp theo. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Các dược liệu (Hoàng kỳ, Đương quy vĩ, Xích thược, Xuyên khung, Đào nhân, Địa long, Hồng hoa) đạt các tiêu chuẩn theo DĐVN IV(3), riêng chỉ tiêu soi bột dược liệu Hoàng kỳ đạt yêu cầu theo Dược điển Trung Quốc (2005)(4). Cao khô BDHNT dưới dạng cao khô: bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi thơm dược liệu. Mỗi 1 g bán thành phẩm chứa: Hoàng kỳ 3463 mg, Đương quy vĩ 577 mg, Xuyên khung 288 mg, Xích thược (rễ) 433mg, Đào (hạt) 288 mg, Hồng hoa 288 mg, Địa long (Giun đất) 288 mg, magnesi stearat vừa đủ. Viên nang BDHNT (lô sản xuất 020211NC, ngày sản xuất 15/02/2011). Thành phần dược liệu cho 1 viên nang số 0 gồm: Hoàng kỳ 2000 mg, Đương quy vĩ 333mg, Xuyên khung 166,6 mg, Xích thược (rễ) 250 mg, Đào (hạt) 166,6 mg, Hồng hoa 166,6 mg, Địa long (Giun đất) 166,6 mg, magnesi stearat vừa đủ. Trang thiết bị, dụng cụ Tủ sấy Memmert, lò nung Carbolite CSF 1200 (Anh) FLF 11/14, bếp cách thuỷ Memmert ULM-500, kính hiển vi Olympus CH-20, cân phân tích Statorius, máy đo độ ẩm Shimadzu EB 340 MOC (Nhật), máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu, cân Mettler AE 200, đèn tử ngoại Camag, lò nung Heraeus, tủ sấy JSON 20, máy chụp hình Panasonic, bộ dụng cụ sắc ký lớp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 209 mỏng, bản mỏng silica gel GF254, bộ dụng cụ phá mẫu và chưng cất đạm. Phương pháp nghiên cứu Xác định độ mất khối lượng do làm khô (DĐVN IV, Phụ lục 9.6): dùng 2 g chế phẩm đi thử nghiệm, nhiệt độ 105oC trong 30 phút. Xác định cắn không tan trong nước: thực hiện với 1 g chế phẩm, pha và lọc trong bình nón 200 ml, rửa cắn trên giấy lọc cho đến khi giấy lọc không màu. Làm khô giấy lọc ở nhiệt độ 105oC trong 4 giờ. Xác định độ tro toàn phần, tro không tan trong acid, tro sulfat, tro tan trong nước (DĐVN IV, phụ lục 9.8, 9.7, 9.9, 9.10): dùng 1g chế phẩm. Xác định độ pH (DĐVN IV, phụ lục 6.2): dùng dung dịch 10% chế phẩm. Xác định kim loại nặng (DĐVN IV, phương pháp 3, phụ lục 9.4.8). Xác định giới hạn nhiễm khuẩn (DĐVN IV, phụ lục 13.6, trang PL-258): phương pháp đĩa thạch(3). Xác định độ rã (DĐVN IV, phụ lục 11.6): thực hiện phép thử độ rã của viên nén và viên nang. Xác định độ đồng đều về khối lượng (DĐVN IV, phụ lục 9.6): phương pháp 2. Định tính bằng phương pháp SKLM (DĐVN IV, Phụ lục 5.4): xác định sự hiện diện của Hoàng kỳ, Xích thược, Đương quy vĩ, Xuyên khung, Hồng hoa, Địa long. Định lượng Định lượng saponin toàn phần (1) Cân chính xác khoảng 5g chế phẩm cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 50 ml methanol (TT), đun sôi hồi lưu cách thủy 30 phút. Để nguội, lọc lấy dịch methanol. Chiết tiếp bã 2 lần nữa, mỗi lần với 30 ml methanol trong 15 phút. Gộp các dịch chiết methanol đem bốc hơi cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn với 20 ml nước cho vào bình chiết, tráng cốc với 10 ml nước. Lắc kỹ bình chiết với n - butanol đã bão hòa nước 3 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch n-butanol cho vào 1 cốc đã cân bì, đem bốc hơi cách thủy đến cắn. Sấy cắn ở 100 – 105 oC trong 4 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân nhanh. Tính tỷ lệ cắn (hàm lượng saponin toàn phần) trong 1 gam theo công thức: m a gmgX )/( Trong đó: X : Hàm lượng saponin toàn phần trong 1 g; a : Khối lượng cắn thu được sau khi sấy (mg); m : Khối lượng mẫu đem chiết đã trừ độ ẩm (mg). Định lượng protein (tiến hành theo phương pháp 1, phụ lục 10.9, DĐVN IV): Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm cho vào bình Kjeldahl, tiến hành vô cơ hóa và chưng cất. Dùng dung dịch acid sulfuric 0,1N (CĐ) và dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ). Công thức tính: X (mg/g) = (b-a) x 1,4 x 6,25/P Trong đó: a, b : Thể tích dung dịch natri hydroxyd 0,1N (CĐ) đã dùng cho mẫu thử và mẫu trắng (ml); P : Khối lượng bột đem đi thử nghiệm đã trừ độ ẩm (mg). KẾT QUẢ Tiêu chuẩn hóa các chỉ tiêu lý hóa của cao chiết và viên nang BDHNT Bảng 1. Độ ẩm của cao và viên nang BDHNT Chế phẩm Số lần lặp lại thí nghiệm Độ ẩm trung bình (%) Tiêu chuẩn Cao BDHNT 2 4,3 ≤ 5 Viên nang BDHNT 2 4,2 ≤ 5 Độ ẩm của cao và viên nang BDHNT đạt yêu cầu quy định trong Dược điển Việt Nam dành cho cao khô và viên nang. Bảng 2. Độ tro, cắn không tan trong nước, pH, giới hạn kim loại nặng của cao BDHNT Chỉ tiêu Cao BDHNT Tiêu chuẩn Tro toàn phần (%) 8,55 ≤ 10 Tro không tan trong acid (%) 5,0 ≤ 6 Tro sulfat (%) 4,8 ≤ 6 Tro tan trong nước (%) 1,9 ≤ 4 Cắn không tan trong nước (%) 24,85 ≤ 26 pH của dung dịch 10% 4,35 4,0 – 5,5 Giới hạn kim loại nặng (ppm) < 20 ≤ 20 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 210 Độ tro, cắn không tan trong nước, pH của dung dịch 10%, giới hạn kim loại nặng của cao BDHNT đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam. Bảng 3. Độ rã, độ đồng đều khối lượng của viên nang BDHNT Chỉ tiêu Số lần lặp lại thí nghiệm Trung bình Tiêu chuẩn Thời gian rã (phút) 6 19,67 ± 0,52 ≤ 30 Khối lượng bột thuốc trong nang (g) 20 0,5773 ± 0,0179 % so với khối lượng trung bình 20 99,62 ± 3,09 ±7,5% Thời gian rã và độ đồng đều khối lượng của viên nang BDHNT đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam IV. Định tính cao và chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Bảng 4. Sắc ký đồ của cao và viên nang BDHNT so với nguyên liệu đối chiếu Nguyên liệu Hệ dung môi khai triển Phát hiện Số vết của nguyên liệu đối chiếu Số vết của cao và viên nang Số vết trùng giữa nguyên liệu với cao và viên nang Hoàng kỳ CH3Cl-MeOH-H2O (65:35:10 lớp dưới) Phun acid sulfuric 10%, sấy 100 0 C. Quan sát ở ánh sáng thường và đèn UV =366nm 6 8 6 Địa long n-BuOH-CH3COOH- H2O (40:10:10) Phun ninhydric 0,1% / 90%, sấy105 0 C 7 8 7 Xuyên khung CH3Cl -MeOH-NH4OH (9:1:1 giọt) Phun dung dịch Dragendorff, phun tiếp acid sulfuric hoặc soi UV =366nm 1 1 1 Hồng hoa n-BuOH-CH3COOH- H2O (4:1:5) Ánh sáng thường 2 2 1 Đương quy Toluen-EtOAc (9:1) soi UV =366nm 3 3 3 Xích thược CH3Cl-EtOAc-MeOH- HCOOH (40:5:10:0,2) Dung dịch vanillin 1%/acid sulfuric 10% 7 8 6 Trên sắc ký đồ của chế phẩm cho thấy sự hiện diện của Hoàng kỳ, Đương quy, Xích thược, Xuyên khung, Hồng hoa, Địa long trong cao và viên nang BDHNT. Chứng tỏ phương pháp chiết xuất và bào chế mới giữ được các thành phần chủ yếu của công thức cổ truyền. Định lượng saponin và protein toàn phần trong cao và viên nang BDHNT Bảng 5. Hàm lượng saponin toàn phần, protein toàn phần trong cao và viên nang BDHNT Chỉ tiêu Cao BDHNT (mg/1g) Tiêu chuẩn (mg/1g) Viên nang BDHNT (mg/viên) Tiêu chuẩn (mg/viên) Saponin toàn phần 126,1 ≤ 80 62,0 ≤ 40 Protein toàn phần 190,5 ≤ 180 98,8 ≤ 90 Mỗi gam cao khô chứa ít nhất 80 mg saponin và 180 mg protein toàn phần. Mỗi viên nang chứa ít nhất 40 mg saponin và 90 mg protein toàn phần. Giới hạn nhiễm khuẩn của cao và viên nang BDHNT Bảng 6. Giới hạn nhiễm khuẩn của cao và viên nang BDHNT Chỉ tiêu Cao BDHNT Viên nang BDHNT So với tiêu chuẩn DĐVN IV Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được (CFU/g) ≤ 10 4 ≤ 10 4 Đạt Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại được (CFU/g) ≤ 10 2 ≤ 10 2 Đạt Tổng số Enterobacteria ≤ 500 ≤ 500 Đạt Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa 0 0 Đạt Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 211 Giới hạn nhiễm khuẩn của cao và viên nang BDHNT đạt mức 4 theo quy định của Dược điển Việt Nam. BÀN LUẬN Chế phẩm BDHNT đạt các tiêu chuẩn cần thiết của dạng bào chế viên nang theo các quy định hiện hành, là một trong những tiền đề cơ bản để tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng trong đánh giá tính an toàn và hiệu quả của thuốc một cách chính xác và khách quan. Dựa vào cơ sở liều dùng của thuốc sắc BDHNT của tác giả Hoàng Bảo Châu(6), có thể dự kiến liều dùng cho mỗi bệnh nhân là 18 viên/ngày (người cân nặng trung bình 50 kg). Liều này tương đương với thang thuốc 58,5 g, gồm có: Hoàng kỳ 36 g, Đương quy vĩ 6 g, Xuyên khung 3 g, Xích thược 4,5 g, Đào (hạt) 3 g, Hồng hoa 3 g, Địa long 3 g. Như vậy, so với dạng cổ truyền, dạng bào chế mới tiện dụng hơn, giảm được 117 lần khối lượng thuốc sử dụng hàng ngày cho người bệnh.Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề nghị một số tiêu chuẩn chất lượng cho viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang (bảng 7) như sau: Bảng 7. Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ dương hoàn ngũ thang Chỉ tiêu Yêu cầu chất lượng Tính chất Viên nang số 0, bột thuốc trong nang màu nâu, mùi thơm dược liệu Độ rã Không được quá 30 phút Độ đồng đều khối lượng ± 7,5% KLTB bột thuốc có trong nang Mất khối lượng do làm khô Không được quá 9,0% (kl/kl) Định tính Hoàng kỳ Địa long Xuyên khung Hồng hoa Đương qui vĩ Xích thược Định lượng saponin toàn phần protein Mỗi viên không được ít hơn: 40,0 mg 90,0 mg Giới hạn nhiễm khuẩn Phải đạt yêu cầu qui định theo DĐVN IV KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được từ thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:- Cao chiết Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang đạt các yêu cầu cao khô về độ ẩm, độ tro, độ pH, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn theo các yêu cầu quy định trong Dược điển Việt Nam IV.- Viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang đạt các yêu cầu về độ ẩm, độ rã, độ đồng đều khối lượn, giới hạn nhiễm khuẩn theo quy định của Dược điển Việt Nam IV.- Trong cao chiết và viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang có sự hiện diện của 6 dược liệu Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đương qui, Địa long, Xích thược, Xuyên khung. - Hàm lượng saponin toàn phần không được ít hơn 80 mg/1g cao khô và không được ít hơn 40 mg/1 viên BDHNT.- Hàm lượng protein toàn phần không được ít hơn 180 mg/1g cao khô và không được ít hơn 90 mg/1 viên BDHNT.Những kết quả này là một trong minh chứng cho thấy viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang sau chuyển dạng vẫn giữ được các thành phần tương tự như dạng bào chế cổ truyền.Những kết quả thu được từ nghiên cứu này góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang, phục vụ cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo và có triển vọng đóng góp với cộng đồng một lựa chọn mới trong điều trị phục hồi vận động sau đột quị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng dược liệu, Trung tâm Thông tin Thư viện Đại học Dược Hà Nội, tr.141. 2. Bộ Y tế (2007), Bệnh học và điều trị nội khoa (kết hợp đông – tây y), Nxb Y học Hà Nội, tr. 411. 3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam (lần xuất bản thứ 4), Nxb Y học Hà Nội, tr. 182-183, 756, 762-763, 767-768, 782-783, 788, 933- Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 212 935, PL 129-131, 144, 176-177, 182-183, 189-190, 221, 226-227, 258. 4. Chinese Pharmacopoeia Commission (2005), Pharmacopoeia of The People’s Republic of China. People’s Medical Publishing House, pp. 194-195. 5. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội, tr. 67, 656, 706, 977-978. 6. Lê Đức Hinh và nhóm chuyên gia (2008), Tai biến mạch máu não - Hướng dẫn chẩn đoán và xử trí, Nxb Y học Hà Nội, tr. 596-598. 7. Nguyễn Văn Đăng (2006), Tai biến mạch máu não, Nxb Y học Hà Nội, tr.9. 8. Thường Hỷ Lê Niên (2008), 410 phương thang đông y thực dụng, Nxb Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh, tr. 43. 9. Trần Văn Kỳ (2008), 205 bài thuốc đông y cổ truyền chọn lọc, Nxb Thanh Niên. 10. Vương Thanh Nhậm, Nguyễn Văn Nghĩa (2004), Y lâm cải thác, Nxb Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh, tr. 7, 9, 95-97.