Tổng quan về pectinase và phương pháp thu nhận

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ PECTINASE VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HỆ THỐNG ENZYME PECTINASE Pectinase được phân chia làm 3 nhóm chính (xem bảng 2.1), bao gồm: [44, 45] Nhóm 1: nhóm enzyme thủy phân protopectin – Protopectinase Nhóm 2: nhóm enzyme thủy phân liên kết ester – Esterase Nhóm 3: nhóm depolymer hóa mạch pectin – Depolymerase Protopectinase (PPase) Protopectinase hay pectinosinase là enzyme xúc tác cho phản ứng phân giải protopectin không tan thành pectin hòa tan. Cơ chế phản ứng xúc tác của protopectinase như sau: (không tan) (hòa tan) Dựa trên cơ chế xúc tác, PPase được chia làm 2 loại: Loại A-PPase xúc tác ở vị trí bên trong mạch protopectin (vùng acid polygalacturonic). A-PPase được tổng hợp bởi nấm men như Kluyveromyces fragilis IFO 0288 (PPase-F), Galactomyces reesei L. (PPase-L) và Trichosporon penicillatum (PPase-S) (Whitaker và cộng sự, 1990). Cả 3 loại A-PPase đều có tính chất tương tự nhau và khối lượng phân tử xấp xỉ nhau (khoảng 30 kDa). Trong đó, PPase-F có bản chất protein mang tính acid, còn PPase-L và -S là những protein mang tính kiềm. Các enzyme này xúc tác cho phản ứng thủy phân mạch polygalacturonate làm giảm độ nhớt và tăng nhẹ tính khử của dung dịch phản ứng. [44, 102] Bảng 2.1 Khóa phân loại pectinase [44] Loại B-PPase xúc tác ở vị trí bên ngoài mạch protopectin (vùng liên kết giữa mạch polygalacturonic acid với các thành phần cấu trúc của thành tế bào thực vật). B-PPase được thu nhận từ một số chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis IFO 12113 (Sakai T. và cộng sự, 1988), B. subtilis 3134 (Sakai T. và cộng sự, 1990) và Trametes sp. (Sakai T. và cộng sự, 1993) và được đặt tên tương ứng là PPase-B, -C, -T. Trọng lượng phân tử của 3 loại enzyme PPase-B, -C và –T tương ứng là 45, 30 và 55 kDa. PPase-B và -C có điểm đẳng điện pI khoảng 9.0, trong khi PPase-T có pI là 8.1. Cả 3 loại enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân protopectin từ vỏ trái cây thuộc họ citrus và các mô của một số thực vật khác, giải phóng ra pectin hòa tan. [79, 80, 81] Hoạt tính của PPase được xác định dựa trên lượng pectin hòa tan được giải phóng từ protopectin bằng phương pháp carbazole-sulphuric acid. [44] Pectinesterase (PE) Thuộc nhóm này có 2 loại là pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6). Enzyme pectin methylesterase (PME) xuất hiện phổ biến hơn ở thực vật và vi sinh vật. Trong khi đó, pectin acetylesterase chỉ tập trung chủ yếu ở một số thực vật.[33, 44, 45] Hình 2.1 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân ester của các enzyme pectinesterase 1- Pectin methylesterase Pectin methylesterase (PME) có nhiều tên gọi khác nhau như pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase và pectolipase. Về bản chất, PME thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết ester giữa gốc methoxyl và gốc carboxylic ở vị trí C6 của acid galacturonic trên mạch chính của phân tử pectin. Sản phẩm của phản ứng thủy phân là acid pectinic (có mức độ ester hoác thấp hơn) hoặc acid pectic và methanol. [44] PME được sinh tổng hợp bởi một số vi khuẩn và nấm sợi (Hasunuma và cộng sự, 2003). Người ta thấy rằng các loại PME tổng hợp từ nấm sợi có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân ester ở vị bất kỳ trên mạch pectin. Trong khi đó, PME từ thực vật chỉ có khả năng xúc tác cho phản ứng demethoxyl hóa gốc galacturonic acid tại vị trí đầu không khử ở cuối mạch pectin hoặc ở vị trí ester của gốc galacturoronic nằm kề bên gốc acid galacturonic chưa được ester hóa (Froster, 1988). [29, 33] Hoạt tính PME tăng lên cùng với mức độ ester hóa của cơ chất. Do đó, PME xúc tác đặc hiệu hơn đối với các phân tử cơ chất được ester hóa mức độ cao. PME không có hoạt tính đối với muối các pectate. Hoạt tính của PME có thể xác định bằng phương pháp chuẩn độ pH tự động (pH-stat) (Whitaker, 1984) hoặc bằng phương pháp chuẩn độ thông thường với NaOH chuẩn tới một giá trị pH cố định. [33, 28] Khối lượng phân tử của hầu hết các enzyme pectinesterase thu nhận từ vi sinh vật và thực vật dao động trong khoảng từ 30-50 kDa (Hadj-Taieb và cộng sự, 2002; Christensen và cộng sự, 2002). Giá trị pH tối ưu cho hoạt động xúc tác của PME này thường nằm trong vùng acid đến trung tính (từ 4.0 đến 7.0), ngoại trừ PME thu nhận từ Erwinia hoạt động tốt nhất ở vùng pH kiềm. Hầu hết các loại PME hoạt động tối ưu trong khoảng nhiệt độ từ 40 đến 60oC và giá trị pI từ 4.0-8.0. Giá trị Km cũng nằm trong khoảng 0.1-0.5 mg/mL. [33] Bảng 2.2 Tính chất của một vài pectinesterase [33] 2- Pectin acetylesterase Pectin acetylesterase (PAE) còn có tên gọi khác là pectin homogalacturonan acetylesterase. Hoạt động của enzyme này phổ biến ở nhiều loại thực vật như cam, cà rốt và đậu mung. PAE tập trung chủ yếu ở phần vỏ ngoài và trong các múi cam. Ở đậu mung (mung bean), PAE được tìm thấy ở một số mô đặc biệt. Trong đó, tập trung nhiều nhất các mô ở phần trụ dưới của lá mầm (hypocotyl), và thấp hơn ở phần lá và rễ. Tuy nhiên, không tìm thấy hoạt tính của PAE ở lá mầm (cotyledon). Hoạt động của PAE cũng được tìm thấy rất rõ ở cà rốt. [28] Depolymerases Depolymerase là nhóm các enzyme pectinase tác dụng chủ yếu lên các hợp chất pectic, gây ra sự phân cắt và làm giảm kích thước phân tử. Người ta có thể phân loại các enzyme thuộc nhóm này bằng nhiều khóa phân loại khác nhau dựa trên cơ chế hoặc tính đặc hiệu cơ chất. Trong phần này, chúng tôi xin giới thiệu khóa phân loại các các enzyme pectin depolymerase dựa vào cơ chế xúc tác làm giảm chiều dài mạch pectin.Theo đó, phản ứng phân giải mạch pectin được thực hiện theo 2 cơ chế (xem hình 2.2): [44, 45] Cơ chế thủy phân (hydrolysis): phân giải liên kết a-1,4 giữa 2 đơn vị galacturonate cần có sự tham gia của phân tử H2O. Các enzyme thuộc loại này gồm có polygalacturonase (PG), polymethylgalaturonase (PMG), rhamnose galaturonase (RG). Cơ chế phản ứng trans-elimination: phân giải liên kết giữa 2 đơn vị galacturonate nhưng không cần sự có mặt của phân tử H2O. Theo cơ chế này, enzyme sẽ tấn công làm bẻ gãy liên kết glycoside ở vị trí C4, và đồng thời với việc khử H ở vị trí C5 hình thành nên nối đôi ở vị trí C4-5 tạo sản phẩm sản phẩm D4:5 galacturonate không bão hòa. Các enzyme thuộc loại này bao gồm polygalacturonate lyase (hay pectin lyase), polymethylgalaturonate lyase (hay pectate lyase), và rhamnogalacturonan lyase. Hình 2.2 Các kiểu phản ứng xúc tác của enzyme thuộc nhóm depolymerase. (a) R=H đối với polygalaturonase, R=CH3 đối với polymethylgalacturonase; (b) R=H đối với polygalacturonate lyase và R=CH3 đối với polymethylgalacturonate lyase. [44] A - Nhóm enzyme thủy phân (hydrolysis) 1- Polygalacturonase (PGase) Polygalacturonase là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glycoside của mạch polygalacturonate (hay pectate) theo 2 cơ chế exo- và endo-. Đây là loại enzyme quan trọng được nghiên cứu nhiều nhất trong hệ thống các enzyme thủy phân pectin. Endo-polygalacturonase (Endo-PGase) Endo-PGase (EC 3.2.1.15) thủy phân các liên kết a-1,4 glycoside ở vị trí ngẫu nhiên trong mạch polygalacturonate (ở dạng homogalacturonan). Sản phẩm của quá trình thủy phân là các đoạn oligogalacturonate. Endo-PGase xúc tác chủ yếu trên cơ chất là pectate và không thể hiện hoạt tính đối với pectin có chỉ số methoxyl hóa cao (bảng 2.6). [44, 101] Endo-PG thường có nguồn gốc từ nấm sợi, vi khuẩn và một số loài nấm men. Chúng cũng được tìm thấy ở một số thực vật bậc cao và một vài giun ký sinh trên thực vật (Sakai và cộng sự, 1993). Các loài vi sinh vật thường được nghiên cứu thu nhận endo-PG gồm có Aureobasidium pullulans, Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, Neurospora crassa, Rhizopus stolonifer, Aspergillus sp., Thermomyces lanuginosus, Peacilomyces clavisporus. Endo-PG cũng đã và đang được nghiên cứu thu nhận từ các vi sinh vật tái tổ hợp di truyền. [44, 81] Bảng 2.3 Ảnh hưởng của mức độ ester hóa đến hoạt tính của endo-PGase [101] Các phân tử endo-PG thường có khối lượng khoảng 30-80kDa, và giá trị pI dao động giữa 3.8 đến 7.6. Hầu hết các endo-PG có pH tối thích nằm trong vùng acid từ 2.5-6.0 và nhiệt độ tối thích từ 30-55oC (theo Singh và Rao, 2002; Takao và cộng sự, 2001). Giá trị Km của các endo-PG thường vào khoảng 0.14-2.7mg/mL ứng với cơ chất là muối pectate. [33, 34, 101] Hoạt tính xúc tác của các endo-PGase có thể được xác định một cách gián tiếp bằng phương pháp đo khả năng làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin trong một đơn vị thời gian khi cố định các điều kiện còn lại của phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất). [44, 97] Exo-polygalacturonase (Exo-PGase) Ngược lại với các endo-PGase, exo-polygalacturonase (EC 3.2.1.67) lại xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết a-1,4 glycoside từ ngoài mạch polygalacturonate vào tính từ đầu không khử. Sản phẩm của quá trình thủy phân bởi xúc tác exo enzyme là các di- và mono-galaturonates. [44, 101] Exo-PGase có thể phân làm 2 loại exo-PG từ nấm sợi và từ vi khuẩn. Loại exo-PGase có nguồn gốc từ nấm sợi có khuynh hướng tạo ra sản phẩm cuối cùng là monogalacturonic acid trong khi exo-PGase từ vi khuẩn thường chỉ tạo ra acid digalacturonic. Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu thu nhận exo-PGase gồm có: Erwinia carotovora, Agrobacteriumtumefaciens, Bacteroides thetaiotamicron, E. chrysanthemi, Alternaria mali, Fusarium oxysporum, Ralstonia solanacearum, Bacillus sp.. Khối lượng phân tử và pI của các exo-PGase dao động trong khoảng 30-50kDa và 4.0-6.0 tương ứng. Nhiệt độ tối thích nằm trong khoảng từ 50 đến 70oC (xem bảng 2.4). pH tối thích cho các enzyme này dao động trong khoảng rộng tùy thuộc vào loài vi sinh vật cụ thể. [44, 33, 34, 99]. Người ta thường xác định hoạt tính các exo-PG bằng phương pháp đo hàm lượng đường khử (acid galaturonic) giải phóng trong 1 mL dịch thủy phân trong một đơn vị thời gian khi cố định các điều kiện còn lại của phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất). [44, 97] 2- Polymethylgalacturonase (PMG) Khác với PG, PMG xúc tác cho phản ứng thủy phân cơ chất pectic có mức độ methoxyl hóa rất cao. Do đó, acid pectic và các dẫn xuất của pectate không phải là đối tượng tấn công của enzyme này. Hiện nay, có rất ít các công trình nghiên cứu về tính chất của PMG vì những khó khăn do vấn đề tinh sạch và khó xác định hoạt tính loại enzyme này. [45, 33, 34] Aspergillus được xem là giống vi sinh vật chủ yếu sản xuất ra PMG. PMG từ A. niger hoạt động tối ưu trong vùng pH từ 4 đến 7, và cơ chất chủ yếu cho enzyme này xúc tác phải là pectin có mức độ ester hóa rất cao (khoảng 95%) (Koller và Neukom, 1967). Từ việc phân tích các sản phẩm thủy phân dung dịch pectin, các tác giả trên đã dự đoán rằng, Aspergillus chỉ có thể sinh tổng hợp được endo-PMG. [33, 34] Bảng 2.4 Tính chất của một vài polygalacturonase [44] (–) chưa xác định tính chất 3- Rhamnogalaturonase Rhamnogalacturonase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết glycoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử pectin (rhamnogalacturonan). Sản phẩm cuối cùng của phản ứng thủy phân là các oligomer chứa các đơn vị rhamnose và galaturonic acid. Enzyme này thường xuyên có mặt trong các chế phẩm thương mại của enzyme pectinase. [33, 101] B - Nhóm enzyme trans-eliminase 1- Pectin lyase (polymethylgalacturonate lyase hay pectin transeliminase) Albersheim và các cộng sự (1966) là những người đầu tiên tìm thấy sự xuất hiện của enzyme này từ A. niger. Cho đến nay, người ta chỉ biết được một loại pectin lyase hay polymethylgalacturonate lyase (PMGL) phân cắt mạch pectin theo kiểu endo. Enzyme này phân giải mạch chính của phân tử pectin ở vị trí bất kỳ hình thành nên sản phẩm có chứa liên kết đôi là D4:5 oligomethylgalacturonate không bão hòa và polymethylgalaturonate. [45, 101] Hình 2.3 Cơ chế xúc tác phản ứng của pectin lyase và pectate lyase Khác với polygalaturonate lyase hay pectate lyase, các pectin lyase không cần hoạt hóa bởi ion calcium (ngoại trừ PMGL thu nhận từ Fusarium). Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy khi có mặt của ion Ca2+ thì hoạt tính của PMGL có thể tăng lên [44]. Bên cạnh đó, Soriano (2005) và Hayashi (1997) cùng các cộng sự đã xác định được khối lượng phân tử của PMGL nằm trong khoảng 30-40 kDa, duy chỉ có trường hợp PMGL từ Aureobasidium pullulans và Pichia pinus có khối lượng phân tử rất cao (xấp xỉ 90 kDa). [40, 92] Thông thường, pH cho PMGL hoạt động tối ưu nằm trong vùng acid đến trung tính (từ 4 đến 7) (Soriano và cộng sự, 2005; Silva và cộng sự, 2005). Điểm đẳng điện của hầu hết PMGL xấp xỉ 3.5 và giá trị Km trong khoảng từ 0.1 đến 5.0 mg/mL tùy theo loại cơ chất sử dụng (Sakiyama và cộng sự 2001; Moharib và cộng sự, 2000). [40, 64, 82, 87] 2- Pectate lyase (pectate transeliminase hay polygalacturonate lyase) Pectate lyase hay polygalacturonate lyase (PGL) xúc tác cho phản ứng phân giải mạch polygalaturonate theo cơ chế trans-elimination. Cơ chất thích hợp cho enzyme tác dụng là acid pectic hay muối pectate và các pectin có mức độ methoxyl hóa thấp. Trong tự nhiên, có 2 loại PGL được tìm thấy ở dạng endo và exo. Trong đó, dạng endo-PGL phong phú và phổ biến hơn so với dạng exo-PGL. [45, 101] PGL được tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn và một số nấm sợi gây bệnh cho cây. Thường gặp nhất là Colletotrichum lindemuthionum, Bacteroides thetaiotaomicron, Erwinia carotovora, Amucala sp., Pseudomonas syringae pv. Glycinea, Colletotrichum magna, E. chrysanthemi, Bacillus sp., Bacillus sp. DT-7, C. gloeosporioides. [44] PGL thuộc loại enzyme lưỡng cấu tử và nó đòi hỏi phải có ion calcium làm thành phần cộng tố (cofactor) (Margo P. và cộng sự, 1994). Khối lượng phân tử của các enzyme này thường nằm trong khoảng 30-50 kDa (McCarthy và cộng sự, 1985; Truong và cộng sự, 2001). Giá trị pH tối thích và nhiệt độ tối thích để enzyme này hoạt động tương ứng là 8.0-10.0 và 30-40oC. Một số loài vi sinh vật chịu nhiệt có thể tổng hợp nên PGL có nhiệt độ tối thích cao (từ 50 đến 75oC). [33, 34, 44, 58] Ngoài ra, trong số các enzyme lyase, còn có một loại enzyme khác có tên là oligogalacturonate lyase (EC 4.2.2.6). Enzyme này có tác dụng làm bẽ gãy mạch của các oligogalacturonate bão hòa và không bão hòa theo cơ chế trans-elimination từ vị trí đầu không khử. Kết quả là làm giải phóng ra các monomer chứa nối đôi ra khỏi cơ chất. Oligogalacturonate lyase được sinh tổng hợp chủ yếu từ Erwinia và Pseudomonas sp., và có pH tối ưu là 7.0. [44] Bảng 2.5 Tính chất của một vài lyase [44] Chú thích: PGL: polygalacturonate lyase, PMGL: polymethyl galacturonate lyase Một số enzyme khác liên quan đến quá trình phân giảI pectin Ngoài các enzyme vừa kể trên, trong thực tế, người ta còn tìm thấy một số enzyme khác cũng liên quan đến quá trình phân giải các hợp chất pectic nhưng sự xuất hiện của chúng ít phổ biến. Các enzyme này chủ yếu tác dụng lên phần vùng có cấu trúc phân nhánh (hairy structure) hay vùng mở rộng của phân tử pectin. [99] Các enzyme này bao gồm rhamnogalaturonan acetylesterase, rhamnogalacturonan galacturonohydrolase, rhamnogalacturonan rhamnohydrolase, rhamnogalacturonan lyase, endogalactanase, feruloyl esterase, a-L-arabinofuranosidase và endoarabanase. [99, 101] THU NHẬN PECTINASE TỪ VI SINH VẬT Hiện nay, việc thu nhận chế phẩm pectinase được thực hiện chủ yếu từ vi sinh vật. Trong số các enzyme thuộc hệ thống pectinase, polygalacturonase là enzyme được quan tâm nhiều nhất và có phạm vi ứng dụng rộng lớn không những trong công nghiệp thực phẩm mà còn trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Chọn giống vi sinh vật Như đã giới thiệu ở phần 1.2.3.1, polygalacturonase có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm cả vi khuẩn, nấm men và nấm sợi. Tuy nhiên, hầu hết các chế phẩm enzyme thương mại hiện nay đều được sản xuất từ nấm sợi, đặc biệt là giống Aspergillus. Các chế phẩm pectinase được sản xuất từ các loài khác nhau thì có những tính chất khác nhau (de Vries và cộng sự, 2001). [24, 99] Việc lựa chọn nguồn nấm sợi sinh tổng hợp polygalacturonase còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như tốc độ sinh trưởng, hiệu suất sinh tổng hợp enzyme, phương pháp nuôi cấy (canh trường bề mặt hay bề sâu), thành phần môi trường nuôi cấy (cơ bản, phổ biến và kinh tế), điều kiện nuôi cấy (liên quan đến pH và độ bền nhiệt của enzyme), đặc điểm về genotype của chủng sử dụng (chủng dại, chủng thuần, chủng đột biến, chủng tái tổ hợp di truyền). [67, 99] Môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase 1- Nguồn Carbon Pectinase thuộc loại enzyme cảm ứng. Điều này có nghĩa là pectinase chỉ có thể được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật khi có mặt của chất cảm ứng, trong trường hợp này chính là pectin, trong môi trường nuôi cấy. Vì thế, khi thiết lập môi trường nuôi cấy để thu nhận pectinase thì cơ chất pectin là thành phần bắt buộc phải bổ sung vào. [8, 10, 52] Người ta có thể bổ sung nguồn chất cảm ứng là pectin vào môi trường nuôi cấy dưới 2 dạng: [28; 99] Bổ sung chế phẩm pectin đã được tinh sạch. Bổ sung pectin từ các nguyên liệu giàu pectin như: táo, cà rốt, bã mía, bã củ cải đường, vỏ của một số loại quả citrus, … Thời gian (giờ) Thời gian (giờ) Hình 2.4 Sản xuất pectinase từ A. niger trong canh trường nuôi cấy bề sâu với cơ chất pectin và các nguồn carbon khác: (l), pectin; (¡), pectin+glucose; (n), pectin+acid galacturonic; (o), pectin+sucrose. A, Endo-polygalaturonase; B, Exo-polygalaturonase. [91] Như đã biết, pectinase là một hệ thống gồm nhiều loại enzyme khác nhau tác dụng lên cơ chất là pectin. Vì vậy, thành phần cấu tạo của pectin sẽ ảnh hưởng đến việc tạo thành các loại enzyme với hàm lượng khác nhau. Một ví dụ điển hình là polymethylgalacturonase và pectin esterase chỉ có thể được tổng hợp với hoạt tính cao khi trong môi trường có chứa pectin có mức độ methoxyl hóa cao. Ngược lại, khi nuôi cấy trong môi trường chứa pectin có mức độ methoxyl hóa thấp thì lại kích thích cho sự sinh tổng hợp polygalacturonase và pectate lyase. [32] Ngoài pectin ra, trong một số trường hợp, người ta cũng có thể kết hợp bổ sung một số thành phần cơ chất khác đóng vai trò là nguồn chất dinh dưỡng cho tế bào sinh trưởng và tăng sinh khối. Các chất này có thể là các loại mono-, di- hoặc trisacc