Ứng dụng DNA strip trong định danh và tính kháng thuốc của Mycobacterium

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Chuyên Đề Nội Khoa 408 ỨNG DỤNG DNA STRIP TRONG ĐỊNH DANH VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA MYCOBACTERIUM Nguyễn Ngọc Trương*, Raymond Zanda**, Mai Nguyệt Thu Hồng***, Nguyễn Thúy Hương****, Nguyễn Trường Sơn* TÓM TẮT Tổng quan: Trong nghiên cứu này, Chúng tôi đánh giá Genotype MTBDRplus assay phát hiện nhanh vi khuẩn lao và tính kháng thuốc với Isoniazid và Rifampin. Phương pháp thông thường hiện nay việc xác định vi khuẩn lao và tính kháng thuốc cần vài tuần đến vài tháng. Genotype MTBDRplus assay dựa trên kỹ thuật DNA strip: DNA vi khuẩn lao được ly trích tử mẫu đàm đã xử lý, khuếch đại, lai với đoạn dò đặc hiệu được gắn trên thanh giấy, cho phép định danh Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) và tính kháng thuốc của MTBC với Isoniazid và Rifampin, từ mẫu đàm. Mục đích: Đánh giá kết quả Genotype MTBDRplus assay trong định danh MTBC và tính kháng thuốc của MTBC với Isoniazid (INH), với Rifampin (RIF) và lao đa kháng thuốc (cù ng khá ng INH và RIF) (MDR). Phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên 326 mẫu đàm của bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi, từ 08/2013 đến 06/2014 . Mẫu đàm đươc xử lý theo phương pháp NALC NaOH (14). Mỗi mẫu thực hiện: (1)Soi kính hiển vi (KHV) phát hiện vi khuẩn kháng acide alcooh (AFB: Acide Fast Bacilli) sử dụng hai phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen và huỳnh quang, nuôi cấy theo phương pháp môi trường Lowenstein-Jensen (LJ) và Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) và kháng sinh đồ theo phương pháp môi trường MGIT phát hiện tính kháng thuốc Isoniazid và Rifampin; (2)Thực hiện Genotype MTBDRplus asssay để định danh và xác định tính kháng thuốc với Isoniazid và Rifampin của MTBC. Phân tích kết quả dựa vào độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian trung bình thực hiện của từng phương pháp. Kết quả: Phát hiện AFB và MTBC: Soi KHV 220/326 (67.5%) mẫu AFB dương tính, nuôi cấy định danh 226/326 (69.3%) MTBC dương tính. Kết quả Genotype MTBDRplus assay (TUB) 226/326 (69.3%) MTBC dương tính. Genotype MTBDRplus assay cho độ nhạy và độ đặc hiệu xác định MTBC là 99.1%, 98.0% (căn cứ kết quả nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng). Phát hiện tính kháng thuốc: thực hiện 224 kháng sinh đồ kết quả là: 66/224 (29.5%) trường hợp INH kháng, 26/224 (11.6%) trường hợp RIF kháng và MDR 24 (10.7%) trường hợp. Genotype MTBDRplus assay 224 trường hợp kết quả là: 67/224 (30.0%) trường hợp INH kháng, 26/224 (11.6%) trường hợp RIF kháng và MDR 25 (11.2%) trường hợp. Genotype MTBDRplus assay cho độ nhạy và độ đặc hiệu xác định tính kháng thuốc của MTBC với Isonaizid là 98.7%, 98.5%, với Rifampin là 99.5%, 96.2% và lao đa kháng thuốc là 99.2%, 96.7% (căn cứ kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng). Thời gian trung bình từng phương pháp: Thời gian trung bình thực hiện một mẫu: nuôi cấy là 31 ngày, kháng sinh đồ là 11 ngày và Genotype MTBDRplus assay là 6 giờ. Kết luận: Genotype MTBDRplus assay cho kết qủa định danh và xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tương đương với phương pháp nuôi cấy và kháng sinh đồ thông thường nhưng thời gian ngắn hơn nhiều. Độ nhạy và độ đặc hiệu xác định MTBC là 99.1% 98.0% và xác định tính kháng thuốc với Isonaizid là 98.7%, 98.5%, với Rifampin là 99.5%, 96.2%, lao đa kháng thuốc là 99.2%, 96.7% từ mẫu đàm, thời gian là 6 giờ,. Genotype MTBDRplus assay là xét nghiệm thực sự tạo thuận lợi trong xác định MTBC và chọn phác đồ điều trị * Bệnh viện Chợ rẫy, ** FV Hospital *** Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, **** Trường Đại học Bách khoa ĐHQG HCM4 Tác giả liên lạc: BS. Mai Nguyệt Thu Hồng ĐT: 0909753294 Emaill: mnth59@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Nghiên cứu Y học Nhiễm 409 thích hợp cho bệnh nhân lao đa kháng thuốc, sớm hơn nhiều so với kết quả phương pháp thông thường. Từ khóa: DNA strip Mycobacterium, Genotype MTBDRplus assay. ABSTRACT APPLICATION OF DNA- STRIP FOR THE IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF DRUG-RESISTANCE OF MYCOBACTERIUM Nguyen Ngoc Truong, Raymond Zanda, Mai Nguyet Thu Hong, Nguyen Thuy Huong, Nguyen Truong Son * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 1 - 2015: 408 - 413 Background: In this prospective study, we assessed the performance of the Genotype MTBDRplus assay for the simultaneous identification of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and its ability for rapid detection of resistance to Isoniazid and Rifampin in sputum samples, compared to serveral weeks to months with conventional methods. Genotype MTBDRplus assay is based on DNA-Strip technology where MTBC DNA is extracted from the specimen, targeted MTBC DNA amplified via PCR and detected on a membrane strip using reverse hybridization and an enzymatic color reaction. The test enables the simultaneous detection of MTBC and its ability to detect resistance to Isoniazid and Rifampin in Sputum samples. Objective: Evaluation of the Genotype MTBDRplus assay for identification of MTBC and its ability to detect resistance to Isoniazid (INH), Rifampin (RIF) and Multidrug-resistant (MDR) in Sputum samples. Methods: 326 sputum samples were collected from patients with clinical suspicions of MTBC by chest X – ray findings from August 2013 to June 2014. Sputum specimens were processed by the WHO standard decontamination method of NALC NaOH method (12). AFB and MTBC detection was determined by (1) Acid Fast Bacilli (AFB) screening by fluorecence microscopy, two conventional culture methods (gold standard) of Lowenstein-Jensen (LJ) and Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) and Drug Sensitivity Testing (DST) using MGIT method to detect INH and RIF resistance (gold standard); (2) The Genotype MTBDRplus assay for the detection of MTBC and its ability to detect resistance to Isoniazid and Rifampin. Statistical analysis were performed for the detection rate of MTBC for each method and the sensitivity, specificity and the average time of each method. Results: Detection of of AFB and MTBC: Mycobacterium by Microscopy results in 67.5% AFB positive, Combined culture method results 69.3% MTBC positive. Genotype MTBDRplus assay 69.3% MTBC positive. The Genotype MTBDRplus assay sensitivity and specificity for the detection of MTBC were 99.1%, 98.0% respectively (against the gold standard of conventional culture). Detection of the drug-resistance: MGIT DST was performed on 224 cases that were MTBC positive: Of these positive MTBC cases 29.5% Resistant cases to INH, 11.6% resistant cases to RIF and multidrug-resistant (MDR - resistant to RIF and INH) cases were 10.7%. The MTBDRplus assay DST was performed on 224 cases (case (TUB)-positive): 30% Resistant cases to INH, 11.6% resistant cases to RIF and MDR cases were 11.2%. thuốc (căn cứ kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng) .The sensitivity and specificity with Isonaizid were 98.7%, 98.5%, Rifampin were 99.5%, 96.2% and MDR-TB were 99.2%, 96.7%, Genotype MTBDRplus assay to detection of drug resistance (against the gold standard of conventional DST). The average Turn arount Time (TAT): The average TAT for the detection of MTBC by conventional culture methods was 31days. The TAT for DST using the conventional cultures and the MTBDRplus methods was 11 days and 6 hours respectively. Conclusions: Genotype MTBDRplus assay for Sensitivity and specificity for the identification of MTBC was highly comparible and the determination of drug-resistance of MTBC as comparied to the conventional DST method was much shorter by less than 10days. The Genotype MTBDRplus sensitivity and specificity of MTBC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Chuyên Đề Nội Khoa 410 for identified was 99.1%, 98.0% and drug-resistance to Isonaizid was 98.7%, 98.5%, Rifampin was 99.5%, 96.2% and MDR-TB is (99.2%, 96.7%) with a TAT of 6 hours. Genotype MTBDRplus assay application for detection of MDR – TB facilitates rapid and accurate testing to select the appropriate treatment regiments in earliy for TB disease as compared toconventional methods. Key word: DNA strip Mycobacterium, Genotype MTBDRplus assay. MỞ ĐẦU Theo Báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới năm 2013, khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm lao, 12 triệu người hiện mắc lao, 8,6 triệu người mới mắc lao, 1,3 triệu người tử vong do lao.Việt nam đứng hàng thứ 12 trong số 22 quốc gia có tỷ lệ bệnh lao cao nhất thế giới. Hàng năm, Việt nam có khoảng 130.000 người mắc lao mới, 170.000 người mắc bệnh lao, khoảng 3.500 người mắc lao đa kháng thuốc và 18.000 người tử vong do bệnh lao(4). Trước tình bệnh lao gia tăng báo động hiện nay việc phát hiện sớm, điều trị kịp thời hiệu quả, nhằm ngăn chặn sự gia tăng của bệnh lao là việc làm cấp thiết. Kỹ thuật để phát hiện nhanh vi khuẩn lao là DNA Strip chỉ mất 6 giờ. Kỹ thuật DNA strip: DNA vi khuẩn lao được ly trích tử mẫu đàm đã xử lý, khuếch đại, lai với đoạn dò đặc hiệu được gắn trên thanh giấy, cho phép định danh Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) và tính kháng thuốc của MTBC với Isoniazid (gen rpoB) và Rifampin (gen katG, inhA), trực tiếp từ mẫu đàm chỉ trong thời gian 6 giờ(5). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thử Mẫu thử là đàm, được thu nhận từ nhũng bệnh nhân được chẩn đoán bệnh lao phổi. Tổng số mẫu 326, thời gian thực hiện từ 08/2013 đến 06/2014. Xử lý mẫu Mẫu đàm đươc xử lý bằng phương pháp NALC-NaOH (N-Acetyl-L-Cysteine & Sodium Hydroxide)(8). Thực hiện phát hiện vi khuẩn và tính kháng thuốc của MTBC: Thực hiện phát hiện vi khuẩn và tính kháng thuốc của MTBC theo phương pháp thông thường: - Phát hiện vi khuẩn: mẫu đàm đã xử lý, soi kính hiển vi (KHV); cấy 01 tuýp môi trường MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) ủ máy Bactec 960 theo dõi 42 ngày và 02 tuýp môi trường Lowenstein Jensen (LJ) ủ tủ ấm 35oC theo dõi 08 tuần(8). Khi máy Bactec báo có vi khuẩn mọc trong MGIT hoặc quan sát thấy khuẩn lạc hình bông cải thì thực hiện nhuộm Ziehl- Neelsen(ZN). Nếu kết quả ZN là vi khuẩn kháng acid alcool (AFB) dạng thừng (cording), thực hiện GenProbe định danh MTBC(10,8). - Phát hiện tính kháng thuốc: kết quả nuôi cấy là MTBC, thực hiện theo phương pháp trong môi trường MGIT (SIRE) gồm: Streptomycin, Isoniazid, Rifampicin và Ethambutol trên máy Bactec 960 từ canh cấy MGIT hay khuẩn lạc LJ(12). Kết quả kháng đồ được máy Bactec 960 báo tính kháng thuốc của từng kháng sinh. Trong nghiên cứu này chú trọng kết quả kháng sinh đồ của INH và RIF. Thực hiện phát hiện vi khuẩn và tính kháng thuốc của MTBC bằng Genotype MTBDRplus assay Thực hiện mù từ mẫu đàm đã được xử lý: DNA vi khuẩn lao được ly trích, khuếch đại, lai với đoạn dò đặc hiệu được gắn trên thanh giấy, đọc kết quả so thanh giấy với bảng chuẩn(5). - Ly trích DNA: 0,5 ml cặn lắng, ủ cách thủy 90oC trong 20 phút, Ultrasonic 15 phút, Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. - Khuếch đại (PCR): 45μl mix (35 μl PNM, 05 μl 10x buffer PCR, 02 μl MgCl2,03 μl H2O, 0.2 μl HotStar Taq DNA polymarase) và 05 μl DNA. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Nghiên cứu Y học Nhiễm 411 - Lai phát hiện: biến tính DNA, lai trong dung dịch đệm trên Twincubator ở 45 oC, phát hiện và đọc kết quả so thanh giấy với bảng chuẩn. Phát hiện MTBC Genotype MTBDRplus assay (TUB) xuất hiện vạch tương ứng và tính kháng thuốc với INH và RIF của MTBC được xác định khi trên thanh giấy không xuất hiện ít nhất một đoạn dò hoang dại hay xuất hiện ít nhất một đoạn dò đột biến. 4. Phân tích so sánh kết quả dưa vào độ nhạy, độ đặc hiệu và thời gian trung bình của từng phương pháp(11). KẾT QUẢ Trong nghiên cứu 326 mẫu đàm thực hiện soi KHV, nuôi cấy kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay cho kết quả như sau: Phát hiện vi khuẩn - Soi KHV: 220/326(67.5%) mẫu AFB dương tính và 106/326 mẫu AFB âm tính. - Nuôi cấy định danh: 226/326 (69,3%) MTBC dương tính ,79 MTBC âm tính và 21 Non- Tuberculous Mycobateria (NTM). - Kết quả Genotype MTBDRplus assay định danh (TUB): 226/326 (69,3%) MTBC dương tính, 100/326 MTBC âm tính. Bảng 1: Kết quả soi KHV, nuôi cấy và Genotype MTBDRplus assay: Kết quả (+) Kết quả (-) Soi KHV (n=326) 220(67.5%) 106 Nuôi cấy (n=326) 226(69.3%) 100 (79+21) Genotype MTBDRplus assay (n=326) 226(69.3%) 100 (+): dương tính, (-): âm tính Phát hiện tính kháng thuốc của vi khuẩn - Kháng sinh đồ phương pháp môi trường MGIT: thực hiện 224 kết quả với INH 158/224 nhạy, 66/224 kháng, với RIF 198/224 nhạy, 26/224 kháng và MDR 24 trường hợp. - Genotype MTBDRplus assay: thực hiện 224 mẫu với INH 157/224 nhạy, 67/224 kháng ;với RIF 198/224 nhạy, 26/224 kháng và MDR là 25 trường hợp. Thời gian trung bình thực hiện từng phương pháp Thời gian trung bình thực hiện một mẫu nuôi cấy là 31 ngày, kháng sinh đồ là 11 ngày và Genotype MTBDRplus assay là 6 giờ. - Phương pháp thông thường: Nuôi cấy(31)+ Kháng sinh đồ(11) → Kết quả 42 ngày - Genotype MTBDRplus assay: ly trích, khuếch đại, lai → Kết quả 06 giờ BÀN LUẬN Từ kết quả của 326 mẫu đàm có thể phân tích kết quả như sau: Trong kết quả 326 trường hợp soi KHV, nuôi cấy kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus có: - 217 trương hợp cả ba phương pháp đều dương tính và 97 trường hợp cả ba phương pháp cùng âm tính. - 07 trường hợp nuôi cấy (+) ,MTBDRplus assay (+), soi KHV (-) và trường hợp 01 trường hợp nuôi cấy (+), Genotype MTBDRplus assay (-), soi KHV(-) trường hợp này cũng do AFB trong mẫu thử quá ít(10,9,8,12). Bảng 2: Kết quả phát hiện vi khuẩn của soi KHV, nuôi cấy và Genotype MTBDRplus assay: Nuôi cấy (+) (n=226) Nuôi cấy (-) (n=100) MTBDRplus assay(+) MTBDRplus assay(-) MTBDRplus assay(+) MTBDRplus assay(-) Soi KHV(+) (n=220) 217 1 1 1 Soi KHV(-) (n=106) 7 1 1 97 Tổng cộng (n=326) 224 2 2 98 - 01 trường hợp nuôi cấy (-) ,Genotype MTBDRplus assay (+), soi KHV(+) đây là trường hợp bệnh nhân đang điều trị nên vi khuẩn đã chết(2,6,8,5). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Chuyên Đề Nội Khoa 412 - 01 trường hợp nuôi cấy (-), Genotype MTBDRplus assay (-), soi KHV(+) trường hợp này AFB là NTM(2,8,12,5 ). Bảng 3: Kết quả nuôi cấy và Genotype MTBDRplus assay (TUB) Nuôi cấy (+) Nuôi cấy (-) MTBDRplus assy TUB(+) (n=226) 224 2 MTBDRplus assy TUB(-) (n=100) 2 98 Tổng cộng (n=236) 226 100 Độ nhạy: 99,1% Giá trị tiên đoán dương tính (PPV): 99,1% Độ đặc hiệu: 980% Giá trị tiên đoán dương tính (NPV): 98,0% Độ nhạy và độ đặc hiệu (99,1%; 98,0%) Genotype MTBDRplus assay để phát hiện MTBC (căn cứ kết quả nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng). Bảng 4: Kết quả 224 trường hợp kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay: Kháng sinh đồ (n=224) INH RIF S (n=158) R (n=66) S (n=198) R (n=26) Genotype- MTBDR- plus assay (n=224) INH S(n=157) 156 1 R(n=67) 2 65 RIF S(n=198) 197 1 R(n=26) 1 25 Độ nhạy và độ đặc hiệu với Isonaizid là (98.7%, 98,5%), với Rifampin là (99.5%, 96.2%), và lao đa kháng thuốc là (99,2%, 96,7% ) Genotype MTBDRplus assay để phát hiện tính kháng thuốc (căn cứ kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng). Nhìn chung kết quả phát hiện tính kháng thuốc giữa thử nghiệm kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay không khác biệt nhiều.Trong 224 mẫu thử so sánh giữa kết kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay: 02 trường hợp INH kết quả kháng sinh đồ nhạy nhưng Genotype MTBDRplus assay kháng và 01 trương hợp RIF kháng sinh đồ nhạy mà Genotype MTBDRplus assay lại kháng trường hợp này gen ở trạng thái lặn vì kết quả kháng sinh đồ thể hiện kiểu hình còn Genotype MTBDRplus assay phát hiện gen(6,9). Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu khác Kết quả tham khảo nghiên cứu của bắc Ấn độ: thực hiện 120 mẫu đàm với hai phương pháp kháng sinh đồ thông thường và Genotype MTBDRplus assay (Correlation with conventional DST and GenoType® MTBDRplus assay)(7). Bảng 5: Kết quả của nghiên cứu này và nghiên cứu của Ấn độ Nghiên cứu Ấn Độ INH RIF MDR INH RIF MDR Độ nhạy (%): 98.7 99.5 99.2 96.3 95.8 97.7 Độ đặc hiệu(%): 98.5 96.2 96.7 98.4 98.5 99.1 PPV (%): 99.4 99.5 99.2 98.1 97.8 97.7 NPV (%): 97.0 96.2 96,7 96.7 97.2 99.1 Phương pháp soi KHV độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, Phương pháp này chì phát hiện AFB chứ không phân biệt là MTBC hay NTM, vi khuẩn còn sống hay chết và có kháng thuốc hay không kháng thuốc . Nuôi cấy cho kết quả rất nhạy và chính xác, thời gian trung bình là 31 ngày. Kháng sinh đồ cho kết quả rất chuẩn thể hiện đúng tính kháng thuốc của vi khuẩn và thực hiện được nhiều loại kháng sinh nhưng phải phụ thuộc thời gian nuôi cấy. Thời gian trung bình kháng sinh đồ là 11ngày. Genotype MTBDRplus assay dể thực hiện, an toàn sinh học, giá thành thấp so với phương pháp thông thường, cho kết quả định danh và tính kháng thuốc với INH, với RIF của MTBC, từ mẫu đàm trong 06 giờ . Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Nghiên cứu Y học Nhiễm 413 KẾT LUẬN Genotype MDRTBplus assay, kỹ thuật DNA strip, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh đáng tin cậy trong vòng 6 giờ, cho kết quả định danh và tính kháng thuốc MTBC với INH, với RIF của MTBC, từ mẫu đàm. Genotype MTBDRplus assay cho độ nhạy và độ đặc hiệu xác định MTBC là (99.1% 98.0%) (căn cứ kết quả nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng) và xác định tính kháng thuốc của MTBC với Rifampin là (99.5%, 96.2%), với Isonaizid là (98.7%, 98,5%), lao đa kháng thuốc là (99,2%, 96,7%) (căn cứ kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng). Có thể kết luận rằng Genotype MDRTBplus assay thực sự tạo thuận lợi phát hiện MTBC và chọn phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân lao đa kháng thuốc, sớm hơn nhiều so với phương pháp thông thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bang D., Andersen A. B., and Thomsen V. O.. (2006). Rapid genotypic detection of rifampicin and isoniniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis directly in clinical speccimens. J. Clin. Microbiol.44:2605-2608. 2. Brossier F., Veziris N., Truffot-Pernot C., et al. (2006). Performance of the Genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to Rifampin and Isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculoasis with low and high-level resistance. J. Clin. Microbiol Oct, 44(10):3659-64. 3. Caws M., Phan Minh Duy, Dau Quang Thọ, Nguyen Thi Ngọc Lan, Đai Viet Hoa, and Farrar J (2006).. Mutation Prevalent among Rifampin and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates from a Hospital in Vietnam, J. Clin. Microbio, July, p.2333 - 2337. 4. Chương trình chống lao quốc gia (2014). Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia và phương hướng hoạt động, Hà Nội 4/3/2014. 5. Hain Lifescience GmbH Germany, Mycobacterium tuberculosis, GenoType® MTBDRplus assay nghiajpn@yahoo.comHeep M., Brandstatter B., Rieger U., Lehn N.,Richter E., Russch-Gerdes S., and Niemann S.. (2001) Frequency of rpoB mutations inside and outside the cluster I region in rifampin-resistant clinical Mycobaterium tuberculosis isolate. J Clin. Microbiol. 39:107-110. 6. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, and Richter E. (2007) Evaluation of the Genotype MTBDRplus Assay for Rifampin and Isoniazid Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Specimens. Forschungszentrun Borstel, Germay. 7. Indian Council of Medical Research, New Delhi (Extramural ICMR Project Sanction No. 5/8/5/4/2007-ECD-I), Correlation with conventional DST and GenoType® MTBDRplus assay. 8. Kent PT, Kubica GP (1985) Puublic Health Mycobacteriology AGuide For Level III Laboratory, Divsion of Laboratory Training and Consultation, Laboratory Program Office, 1985. 9. Neonakis IK, Gitti Z, Baritaki S, et al (2009). Evaluation of Genotype Mycobacteria Direct Assay in Comparion with Gen-Probe Mycobacterium tuberculo