Xác định tỷ lệ nhiễm Adenovirus bằng kỹ thuật Realtime PCR và một số đặc điểm dịch tễ ở trẻ em điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương

TCNCYH 115 (6) - 2018 73 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ADENOVIRUS BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ Ở TRẺ EM ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Phùng Thị Bích Thuỷ Bệnh viện Nhi Trung ương Viêm phổi, viêm phế quản phổi và nhiễm virut đường hô hấp cấp là nhóm bệnh phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là trẻ dưới 5 tuổi. Đặc điểm lâm sàng chung là biểu hiện viêm đường hô hấp kèm theo các triệu chứng riêng biệt đặc trưng do từng virut gây ra. Bệnh do nhiễm Adenovirus là bệnh virut cấp tính với hội chứng lâm sàng đa dạng, các trường hợp viêm phổi do Adenovirus thường nặng, có tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Chính vì vậy nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Xác định tỷ lệ nhiễm Adenovi- rus trong năm 2016 ở trẻ em điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương và một số đặc điểm dịch tễ của trẻ có nhiễm Adenovirus. Nghiên cứu thưc hiện với 2409 trẻ có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi điều trị tại các khoa lâm sàng Bệnh viện Nhi Trung ương. Sử dụng kỹ thuật real-time PCR trong việc xác định virut Adenovirus trong mẫu bệnh phẩm dịch hô hấp. Nghiên cứu đã phát hiện 428 trường hợp trẻ dương tính (17,8%). Nhóm tuổi có tỷ lệ cao nhất là trẻ từ 12 tháng đến 60 tháng (42,52%) trong đó đặc biệt trẻ từ 12 đến 24 tháng chiếm 19,15%. Tỷ lệ dương tính ở trẻ nam cao hơn trẻ nữ (64,95% so với 35,05%). Mùa hay gặp nhất là mùa thu đông với khí hậu lạnh và ẩm (60,04%). Đề tài nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ nhiễm virut Adenovirus chiếm đa số trong mùa thu đông ở nhóm trẻ từ 12 đến 60 tháng. Kỹ thuật real-time PCR phát hiện Adenovi- rus có giá trị trong chẩn đoán sớm trong bệnh phẩm lâm sàng thực hiện tại bệnh viện. Từ khoá: realtime PCR, Adenovirus, nhiễm trùng hô hấp trẻ em Địa chỉ liên hệ: Phùng Thị Bích Thủy, Bệnh viện Nhi Trung ương Email: thuyphung.nhp@gmail.com Ngày nhận: 31/7/2018 Ngày được chấp thuận: 05/9/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Virut là nguyên nhân gây viêm phổi, viêm phế quản phổi và nhiễm virut đường hô hấp cấp phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là trẻ dưới 5 tuổi. Một phân tích cộng gộp dựa trên 51 nghiên cứu với 56.091 trẻ viêm phổi phải nhập viện cho thấy có 50,4% trường hợp xác định được căn nguyên là virut, trong đó ghi nhận 5,8% viêm phổi do virut Adenovirus [1]. Ade- novirus là nhóm virut gây ra các bệnh về mắt, đường tiêu hoá, đường tiết niệu, ít gặp ở hệ thần kinh và đặc biệt phổ biến nhất là nhóm các bệnh về đường hô hấp. Tuy không phải tác nhân thường gặp nhưng các trường hợp này thường nặng, có tỷ lệ tử vong cao, để lại di chứng, đặc biệt ở trẻ nhỏ và người suy giảm miễn dịch [2; 3]. Di chứng xảy ra sau nhiễm trùng đường hô hấp do Adenovirus gồm: giãn phế quản, xơ hoá phổi mãn và viêm phổi. Đặc biệt, Adenovirus type 1, 3, 4, 7, 21 thường gây viêm tiểu phế quản tắc nghẽn (dẫn đến hội chứng phổi tăng sáng một bên hay hội chứng Swyer-James), đây cũng là tác nhân chính gây viêm phổi nặng tối cấp ở trẻ nhỏ. Nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do Adenovirus thường gặp vào thu (từ tháng 8 đến tháng 10), đông (tháng 11 đến tháng 1) và đầu xuân (tháng 2 và 3) khi thời tiết giao mùa với khí hậu lạnh, ẩm. Hiện nay, chẩn đoán nhiễm Adenovirus có thể sử dụng một số phương pháp như nuôi 74 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cấy tế bào, phát hiện kháng nguyên trực tiếp, hoặc real-time PCR. Hầu hết các type Adeno- virus đều phát triển tốt khi nuôi cấy tế bào, tuy nhiên phương pháp này thường đòi hỏi từ 2 đến 7 ngày thường áp dụng ở các cơ sở nghiên cứu và do đó không thể giúp ích cho chẩn đoán căn nguyên sớm tại bệnh viện. Kỹ thuật miễn dịch thường phát hiện ở giai đoạn muộn sau 7 - 10 ngày nhiễm Adenovirus hạn chế trong chẩn đoán sớm. Real-time PCR là kỹ thuật sinh học phân tử cho kết quả nhanh (4 - 6 giờ) với độ nhạy, độ đặc hiệu cao (trên 97%) [4], có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong việc chẩn đoán sớm, mang lại hiệu quả điều trị cao, giảm chi phí và thời gian nằm viện cho người bệnh, đặc biệt ở đối tượng trẻ em. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với các mục tiêu xác định Adenovirus trong mẫu bệnh phẩm dịch hô hấp của bệnh nhi bằng việc sử dụng kỹ thuật real-time PCR và tìm hiểu một số đặc điểm dịch tễ ở trẻ nhiễm Adenovirus điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 2409 trẻ có độ tuổi từ 01 tháng đến 15 tuổi có chẩn đoán nhiễm trùng đường hô hấp nghi do Adenovirusvới các triệu chứng như sốt, viêm long đường hô hấp trên, biểu hiện viêm phổi: ho, suy hô hấp s.điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Thời gian thực hiện nghiên cứu: Từ tháng 01 năm 2016 đến tháng 12 năm 2016. Nghiên cứu mô tả, hồi cứu dựa trên thu thập số liệu bằng thống kê số liệu theo hồ sơ bệnh án của bệnh nhi đã điều trị tại bệnh viện Nhi Trung ương. 2. Vật liệu và phương pháp Mẫu bệnh phẩm: Dịch tỵ hầu, dịch nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản phế nang của bệnh nhi tại các khoa lâm sàng được chuyển tới khoa Nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm để thực hiện xét nghiệm real time PCR Adenovvirus Mẫu dịch hô hấp sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA/DNA tổng số (MagNA Pure LC Total Nucleic acid Isolation Kit- Roche) trên hệ thống máy tách chiết tự động MagNA Pure LC 2.0 (Roche). Quá trình chạy real-time PCR được thực hiện trên hệ thống ABI 7500 Fast xác định Adenovirus [5].Trình tự mồi xuôi: GCC ACG GTG GGG TTT CTA AAC TT, mồi ngược: GCC CCA GTG GTC TTA CATGCA CAT C. Probe: FAM – TGC ACC AGA CCC GGG CTC AGG TAC TCC GA – TAMRA. Thành phần phản ứng gồm: 0,625µl nồng độ 10pM primer mỗi loại 0,5 µl nồng độ 10pM probe, 12,5 µl 2X PCR master mix (Qiagen), 5µl DNA và H2O được bổ sung trong tổng phản ứng 25µl. Chương trình phản ứng: 500 - 2 phút, 950 - 15 phút và 45 chu kỳ của 950 - 15 giây và 580 - 1 phút. Mẫu chứng dương chúng tôi sử dụng từ plasmid của trường đại học Goth- enburg - Thụy Điển và mẫu chứng âm là thành phần nước trong hỗn hợp phản ứng PCR. Xét nghiệm real-time PCR chẩn đoán Adenovirus sử dụng các mồi oligonucleotide và probe thủy phân đánh dấu kép (dual la- beled hydrolysis probes) (Taqman) theo nguyên lý real-time PCR nhằm phát hiện định tính in vitroAdenovirus. Taqman probe được gắn với một reporter ở đầu 5’ và một quencher ở đầu 3’. Khi ở trạng thái nguyên vẹn, reporter không phát ra huỳnh quang do hiệu ứng của quencher. Tuy nhiên, trong suốt TCNCYH 115 (6) - 2018 75 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC quá trình phản ứng PCR, Taqman probe sẽ gắn với mạch khuôn DNA bổ sung và tiếp đó sẽ bị phân hủy bởi DNA polymerase, giải phóng ra reporter từ quencher, nhờ đó phát ra III. KẾT QUẢ 1. Kết quả phân tích real-time PCR phát hiện Adenovirus tín hiệu huỳnh quang cho máy real-time PCR. Thời gian ước tính cho việc chạy mẫu khoảng 125 phút, kết quả được đọc và phân tích trên hệ thống máy real-time ABI 7500 Fast. Hình 1. Kết quả phân tích real-time PCR phát hiện Adenovirus Trên đồ thị này, số chu kỳ PCR được thể hiện trên trục x và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng, tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được thể hiện trên trục y. Giá trị ngưỡng được biểu hiện là đường thẳng nằm ngang, mẫu dương tính biểu hiện bằng đồ thị hình sin vượt trên giá trị ngưỡng, ngưỡng phát hiện tương đương với giá trị chù kỳ ở trục x. mẫu âm tính là những đường dưới giá trị ngưỡng. Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả trên mẫu bệnh phẩm dịch hô hấp của 2409 bệnh nhi. Chứng âm và chứng dương được chạy cùng trong mỗi lần thực hiện. Các mẫu có tín hiệu tương tự mẫu chứng dương vượt qua tín hiệu nền và dưới chu kỳ 38 được xem là dương tính với virut Adeno (hình 1). 2. Tỷ lệ nhiễm Adenovirus trên những bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp Biểu đồ 1. Tỷ lệ phát hiện trẻ dương tính với Adenovirus 76 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 2. Tỷ lệ trẻ nhiễm Adenovirus theo giới tính Theo kết quả biểu đồ 2, trong tổng số 428 trẻ phát hiện dương tính với Adenovirus có 278 trẻ nam và 150 trẻ nữ. Như vậy tỷ lệ trẻ nam nhiễm virut adeno cao hơn hẳn trẻ nữ (64,95% so với 35,05%). 4. Phân bố trẻ dương tính Adenovirus theo mùa Biểu đồ 3. Phân bố trẻ dương tínhAdenovirus theo mùa Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, trong 428 bệnh nhi được chẩn đoán nhiễm trùng đường hô hấp thì phát hiện được 93 trường hợp dương tính vào mùa xuân, 78 trường hợp vào mùa hạ, mùa thu và đông đều xấp xỉ 130 trường hợp. Áp dụng kỹ thuật real-time PCR chúng tôi đã phát hiện được 428 trường hợp trẻ dương tính, chiếm 17,8% trên tổng số 2409 mẫu bệnh phẩm dịch hô hấp (biểu đồ 1). Dựa trên số liệu dương tính với Adenovirus nghiên cứu tiến hành tìm hiểu một số đặc điểm dịch tễ ở trẻ nhiễm Adenovirus điều trị tại bệnh viện Nhi Trung ương. 3. Tỷ lệ trẻ nhiễm Adenovirus theo giới tính TCNCYH 115 (6) - 2018 77 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 4. Sự phân bố trẻ dương tính với Adenovirus theo nhóm tuổi Bảng 1 và hình 5 mô tả sự phân bố trẻ nhiễm Adenovirus theo từng nhóm tuổi, chúng tôi thấy rằng trẻ có tỷ lệ Adenovirus dương tính cao nhất là từ 12 tháng đến 60 tháng với 182/428 trẻ (chiếm 42,52%) đặc biệt trong đó trẻ từ 12 tháng đến 24 tháng là 82 trẻ (19,15%). Ở 2 nhóm trẻ dưới 6 tháng và từ 6 tháng đến 12 tháng tỷ lệ phát hiện thấp hơn 100/428 trẻ và 126/428. Tỷ lệ trẻ mắc thấp nhất ở nhóm trẻ trên 60 tháng (4,69%). 5. Phân bố trẻ dương tính Adenovirus theo nhóm tuổi Bảng 1. Phân bố trẻ dương tính vớiAdenovirustheo nhóm tuổi Dưới 6 tháng 6 - 12 tháng 12 - 60 tháng Trên 60 tháng Tổng Số trẻ (N) 100 126 182 20 428 Tỷ lệ (%) 23,36 29,43 42,52 4,69 100 IV. BÀN LUẬN Real-time PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện và định lượng sự tích luỹ DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. So với PCR truyền thống, real-time PCR có ưu điểm lớn là khả năng xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Hơn nữa, dữ liệu real-time PCR có thể được đánh giá trực tiếp mà không cần điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm, loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp so với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới. Theo tác giả Ko DH và cộng sự khi sử dụng real-time PCR đa mồi phân tích 3446 ca nhiễm khuẩn đường hô hấp tại Hàn Quốc năm 2017 cho thấy tác nhân Adenovirus chiếm 12,5% [6]. Tác giả Jonnalagadda nghiên cứu các tác nhân gây viêm phổi nặng ở 406 trẻ tại Ecuador cho thấy có đến 15,3% trẻ dương tính với virut adeno. Tại Châu Mỹ La Tinh nói chung và Ecuador nói riêng, viêm phổi cộng đồng vẫn là nguyên nhân chính gây tử vong và bệnh tật ở trẻ em và có rất ít các nghiên cứu khảo sát nguyên nhân dẫn đến viêm phổi tại nơi này [7]. Ở Việt Nam, tác giả Do AHL năm 2011 cùng cộng sự nghiên cứu trên 309 60 tháng 200 20 182 126 100 150 100 50 0 78 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC trẻ từ 2 tháng đến 13 tuổi tại khu vực phía Nam cũng phát hiện tỷ lệ trẻ nhiễm virut adeno là 5% [8]. Như vậy có thể thấy, việc phát hiện kịp thời các tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, tránh để lại biến chứng nguy hiểm là thực sự cần thiết, đặc biệt ở đối tượng trẻ nhỏ. Nghiên cứu của chúng tôi tương ứng với kết quả nghiên cứu của một số tác giả như Gilles Guerrier năm 2012 cho thấy có đến 58% trẻ mắc là nam giới [9]. Năm 2016 Ljubin- Sternak S khi nghiên cứu về nguyên nhân và đặc điểm lâm sàng trong nhiễm trùng hô hấp ở trẻ em tại Croatia thì tỷ lệ tương ứng giữa trẻ nam/trẻ nữ là 1,4/1 năm 2010 và 1,5/1 năm 2015 [10]. Hiện nay chưa có tài liệu thống kê về nguyên nhân nhiễm Adenovirus theo giới tính tuy nhiên có thể lý giải tại Việt Nam nguyên nhân nam giới chiếm tỷ lệ cao hơn nữ giới được xem là do yếu tố mất cân bằng giới tính với tỷ lệ nam giới ngày càng tăng và đặc biệt trong số 2409 trẻ nhập viện thì tỷ lệ nam cũng vượt trội hơn hẳn so với nữ (1,85/1). Nghiên cứu cho thấy nhiễm Adenovirus chủ yếu vào mùa thu và đông, nguyên nhân một phần do tính chất khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa đặc trưng của nước ta. Khi thời tiết giao mùa từ thu sang đông với khí hậu lạnh, ẩm thấp thì cũng thấy rằng trong những tháng này, có sự song song về bệnh nhân bị nhiễm trùng hô hấp cấp tăng cao. Hơn nữa tỷ lệ xác định được virut dương tính trong các bệnh nhân nhiễm trùng hô hấp cũng cao hơn hẳn. Tác giả Gilles Gurrier năm 2012 cũng đưa ra kết quả nghiên cứu rằng sự phân bố chung của virut đạt đỉnh là vào mùa thu đông [9]. Trẻ trong giai đoạn từ 0 đến 6 tháng phát hiện dương tính với Adenovirus, có thể thấy do ở lứa tuổi này bản thân trẻ chưa có miễn dịch chủ động, chủ yếu do kháng thể từ mẹ truyền sang, lượng IgA trong dịch tiết trên bề mặt niêm mạc phế quản của trẻ còn chưa hoàn chỉnh nên khả năng chống chịu rất kém. Những trường hợp viêm phổi do Adenovirus trong thời kỳ này thường nặng và có thể tử vong [11]. Từ 12 tháng đến 60 tháng là giai đoạn trẻ mắc cao nhất bởi ngoài đáp ứng miễn dịch chưa tốt, trẻ còn chịu ảnh hưởng thêm bởi các yếu tố nguy cơ bên ngoài như lây nhiễm từ nhà trẻ, trường học, môi trường sinh sống. Đa phần trẻ em đều có thể bị mắc bệnh lại do bị nhiễm týp Adenovirus khác. Hiện đến nay vẫn chưa có nghiên cứu rõ về vai trò và thời gian miễn dịch sau khi mắc Adenovirus, tuy nhiên có đến 70-80% trẻ trên 5 tuổi có kháng thể trung hòa kháng nguyên Adenovirus type 1 và 2, 50% với type 5, gần 100% người lớn đã có kháng thể đặc hiệu với nhiều týp Adenovirus [11]. V. KẾT LUẬN Kỹ thuật realtime PCR là có giá trị trong chẩn đoán nhanh, chính xác phát hiện Adeno- virus trong dịch hô hấp đã được triển khai thành xét nghiệm thường quy tại bệnh viện Nhi Trung ương. Nghiên cứu đã phát hiện được 428 trẻ nhiễm Adenovirrus (chiếm 17,8%) trong tổng số 2409 trường hợp nhiễm trùng hô hấp điều trị tại bệnh viện Nhi Trung ương. Dựa trên số liệu dương tính với Adeno- virus cho thấy một số đặc điểm dịch tễ như sau: nhóm trẻ có tỷ lệ nhiễm Adenovirus cao nhất từ 12 - 24 tháng trong số trẻ dưới 60 tháng. Tỷ lệ trẻ nam được phát hiện dương tính cao hơn trẻ nữ. Mùa hay gặp nhất là mùa thu đông với khí hậu lạnh và ẩm. Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi Trung ương nơi thực hiện và thu thập số liệu nghiên cứu này. TCNCYH 115 (6) - 2018 79 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ivana L (2013). Viral etiology of hospital- ized acute lower respiratory infections in chil- dren under 5 years of age – a systematic re- view and meta-analysis. Croat Med J, 54, 122 - 134. 2. Jung-Y. H (2001). Lower Respiratory Tract Infections due to Adenovirus in Hospital- ized Korean Children: Epidemiology, Clinical Features and Prognosis. Clinical Infectious Diseases, 32, 1423 - 1429. 3. John C.H (1992). Adenoviruses in the Immunocompromised Host, Clinical microbiol- ogy review, 262 - 274. 4. Sağlık I1(2013). Investigation of adeno- viruses in children with lower respiratory tract infections. Mikrobiyol Bul, 47(2), 282 - 294. 5. Albert Heim (2003). Rapid and quantita- tive detection of human adenovirus DNA by real-time PCR, J.Med.Virol, 70, 228 - 239. 6. Ko DH (2017). Analysis of Respiratory Viral Infections Detected Using Multiplex Real- Time PCR in Hwaseong, Korea from 2013 to 2015, Clin lab, 63(5), 1003 - 1007. 7. Jonnalagadda (2017). Etiology of severe pneumonia in Ecuadorian children. Plos one, 12(2). 8. Do AHL (2011). Viral Etiologies of Acute Respiratory Infections among Hospitalized Vietnamese Children in Ho Chi Minh City 2004 - 2008. Plos one, 6(3). 9. Gilles Guerrier, MD (2012). Acute viral lower respirsatory tract infections in Cambo- dian children: Clinical and epidemiologic char- acteristics. 10. Ljubin-Stenark S (2016). Etiology and Clinical Characteristics of Single and Multiple Respiratory Virus Infections Diagnosed in Croatian Children in Two Respiratory Sea- sons, Journal of pathogens 11. Cherry JD (2014). Adenoviruses. Text- book of pediatric infectious diseases, 7th ed, WB Saunders. Philadelphia, 1888 - 1911. Summary DETERMINATION OF ADENOVIRUS INFECTION IN CHILDREN BY REAL TIME PCR AND DESCRIPTION OF ITS CHARACTERISTICS AT THE NATIONAL PEDIATRICS HOSPITAL Pneumonia, bronchopneumonia and acute respiratory infections are common in children, es- pecially children under 5 years old. The clinical characteristics of the disease are inflammation of the respiratory tract accompanied by specific symptoms characterized by each virus. Adenovirus infection is an acute virus infection coupled with a variety of clinical syndromes such as severe cases of Adenovirus pneumonia and high mortality rates, particularly in children and people with immunodeficiency. The purpose of this study is to determine the rate of Adenovirus infection in 2016 in children treated at the National Hospital of Pediatrics. The study detected 428 Adenovirus infection in 2409 children from 1 month to 15 years old who were admitted at the Clinical depart- ment of the National Pediatrics Hospital. We use real-time PCR technique to identify Adenovirus in respiratory specimens. The study found 428 positive cases (17.8%). The highest rates are in children from 12 months to 60 months old (42.52%), especially children 12 to 24 months account- ing for 19.15%. The prevalence of positive is higher in boys than that of girls (64.95% versus 35.05%). The most common season is cold and humid winter (60.04%). The study showed that the prevalence of adeno-infected children is predominantly in the winter-fall period for children aged from 12 to 60 months. Real-time PCR positive detection techniques for Adenovirus have early diagnostic value in the hospital setting. Key word: real time PCR, Adenovirus, respiratory infection for children