Xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang

Mục tiêu: Việc nghiên cứu định lượng alkaloid trong cây sen đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện(1). Tuy nhiên tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu định lượng alkaloid trong tâm sen bằng kỹ thuật phân tích dụng cụ, ngay cả Dược điển Việt Nam IV vừa phát hành chỉ đề cập phương pháp định lượng alkaloid toàn phần trong lá sen bằng phương pháp phân tích thể tích và không có phương pháp định lượng alkaloid trong tâm sen. Vì thế đề tài này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae ) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector dãy diod quang nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen rất phong phú và có giá trị sinh học này. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen. Qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid được xây dựng và thẩm định bằng kỹ thuật HPLC với detector PDA. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như pH dung dịch đệm phosphat và tỷ lệ dung môi pha động(5). Kết quả: Xây dựng được qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký như sau: cột Phenomenex Lunar RP18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động đẳng dòng bao gồm ACN: nước: đệm phosphat 60 mM, pH 7 (30:45:25), tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector PDA đặt ở 282 nm. Qui trình định lượng đều đạt các chỉ tiêu đánh giá về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính của một qui trình định lượng. Kết luận: Đề tài đã xây dựng được qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen, làm cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm định nguyên liệu và các chế phẩm từ sen, góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu quí, được sử dụng rộng rãi trong nước.

pdf5 trang | Chia sẻ: thuyduongbt11 | Ngày: 14/06/2022 | Lượt xem: 139 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 628 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NEFERIN TRONG CAO CHIẾT ALKALOID TOÀN PHẦN TỪ TÂM SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN. NELUMBONACEAE) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ*, Nguyễn Đức Tuấn**, Trần Hùng** TÓM TẮT Mục tiêu: Việc nghiên cứu định lượng alkaloid trong cây sen đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện(1). Tuy nhiên tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu định lượng alkaloid trong tâm sen bằng kỹ thuật phân tích dụng cụ, ngay cả Dược điển Việt Nam IV vừa phát hành chỉ đề cập phương pháp định lượng alkaloid toàn phần trong lá sen bằng phương pháp phân tích thể tích và không có phương pháp định lượng alkaloid trong tâm sen. Vì thế đề tài này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae ) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector dãy diod quang nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen rất phong phú và có giá trị sinh học này. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen. Qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid được xây dựng và thẩm định bằng kỹ thuật HPLC với detector PDA. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như pH dung dịch đệm phosphat và tỷ lệ dung môi pha động(5). Kết quả: Xây dựng được qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký như sau: cột Phenomenex Lunar RP18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động đẳng dòng bao gồm ACN: nước: đệm phosphat 60 mM, pH 7 (30:45:25), tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector PDA đặt ở 282 nm. Qui trình định lượng đều đạt các chỉ tiêu đánh giá về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính của một qui trình định lượng. Kết luận: Đề tài đã xây dựng được qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen, làm cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm định nguyên liệu và các chế phẩm từ sen, góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu quí, được sử dụng rộng rãi trong nước. Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae; Tâm sen; Alkaloid, Neferin; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF NEFERINE IN TOTAL ALKALOIDS EXTRACT FROM LOTI EMBRYO (NELUMBO NUCIFERA GAERTN. NELUMNONACEAE) BY HPLC WITH PDA DETECTOR Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 628 - 632 Objectives: Several studies on quantitative determination of alkaloids in Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae were conducted in the world(1). In Vietnam, the studies on alkaloids quantitation in Loti embryo by instrumental analysis methods were limited, so far. ‘Pharmacopoeia Vietnamica, editio IV’ has only a monograph in which the total alkaloids in leaf of Nelumbo nucifera Gaertn. was determined by volumetric *Khoa Dược, Trường đại học Y Dược Cần Thơ **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 629 titration. Therefore, assay of neferine in total alkaloids extracts from loti embryo was developed by HPLC with PDA detector. Subjects and Methods: Total alkaloids extracts from loti embryo. Assay of neferine was developed and validated by HPLC with PDA detector. Separation efficiency and selectivity were optimized using mobile phase containing acetonitrile, water, and 60 mM phosphate buffer of different basic pH’s in variable ratios(5). Results: A simple HPLC method was developed for quantitative determination of neferine in total alkaloidal extracts from loti embryo with following chromatographic conditions: Phenomenex Lunar RP18 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mobile phase in isocratic mode including mixture of acetonitrile, water, and 60 mM phosphate buffer with pH adjusted to 7 (30:45:25), flow rate of 1 ml/min., detection wavelength of 282 nm. This procedure meets all requirements of system suitability and quantitative method validation such as selectivity, precision, accuracy, and linearity. Conclusion: The validated method enables a reliable statement concerning quantitative determination of neferine in total alkaloids extracts from loti embryo, contributes to control quality of herbal raw materials and pharmaceuticals from Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae. Keywords: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae; Loti embryo; Alkaloid; Neferine, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn) họ Nelumbonaceae là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí chủ yếu là do chứa các alkaloid (neferin, nuciferin, lotusin, liensinin, isoliensinin..) hay các flavonoid (quercetin, kaemferol, rutin..)(2,4). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng sinh học in vivo của tâm và lá sen như: an thần, chống oxi hóa, hạ cholesterol, hạ huyết áp, kháng HIV Việc nghiên cứu định lượng những thành phần này trong cây sen đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện(1). Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu định lượng alkaloid trong tâm sen bằng kỹ thuật phân tích dụng cụ, ngay cả Dược điển Việt Nam IV vừa phát hành cũng chỉ đề cập phương pháp định lượng alkaloid toàn phần trong lá sen bằng phương pháp phân tích thể tích và không có phương pháp định lượng alkaloid trong tâm sen. Vì thế chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae ) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector dãy diod quang” nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen rất phong phú và có giá trị sinh học này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen được thu hái tại Đồng tháp và mua tại nhà thuốc đông dược. Chất đối chiếu Chất đối chiếu neferin sulfat do Trung tâm hóa học cây thuốc, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp. Độ tinh khiết 97,2% tính trên chế phẩm hiện trạng. Hóa chất, dung môi Tất cả các dung môi, hóa chất đều là loại tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích. Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký (Merck, Đức). Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2695, detector PDA 2996 (Waters, Mỹ). Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc hóa học của neferin sulfat là một base hữu cơ ở dạng muối, phân cực và có pKa trung bình nên kỹ thuật sắc ký pha đảo đã được áp dung với hệ dung môi phân cực bao gồm acetonitril, nước và dung dịch đệm phosphat 60 mM có pH trong khoảng 7,0 – 8,0. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 630 Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như pH dung dịch đệm phosphat và tỷ lệ dung môi pha động. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, sẽ khảo sát tính phù hợp của hệ thống, thẩm định phương pháp và ứng dụng qui trình đã được thẩm định để xác định hàm lượng neferin có trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen thu hái ở Đồng Tháp và mua tại nhà thuốc đông dược(3,5). Chuẩn bị mẫu Mẫu đối chiếu: Cân chính xác 10 mg chất đối chiếu neferin sulfat, cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan bằng nước cất 2 lần, bổ sung nước đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch thu được, cho vào bình định mức 25 ml, thêm nước cất 2 lần vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc Millipore 0,45µm. Dung dịch thu được có nồng độ neferin 200 ppm. Mẫu thử: Được chuẩn bị theo sơ đồ 1. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký cố định: Cột Phenomenex Luna RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector PDA, bước sóng phát hiện 282 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu 20 µl. Điều kiện khảo sát Điều kiện khảo sát Pha động (ACN:H2O:đệm phosphat 60 mM) 1 60:40:0 2 70:25:5 3 68:25:7 4 55:35:10 5 30:45:25 Sơ đồ 1. Quy trình chuẩn bị mẫu thử Hình 1. Sắc ký đồ của dung dịch mẫu đối chiếu ở các điều kiện khảo sát. (a): điều kiện 1; (b): điều kiện 2; (c): điều kiện 3; (d): điều kiện 4; (e): điều kiện 5. (a) (b) (c) (d) (e) 1 ml cao đặc tâm sen Cắn alkaloid toàn phần Dịch alkaloid muối Cắn alkaloid toàn phần tinh chế Kiềm hóa với NH4OH 25% Chiết với CHCl3 đến kiệt alkaloid. Cô dịch chiết đến cắn khô Hòa vào H2SO4 2%, lọc qua giấy lọc Kiềm hóa với NH4OH 25%. Chiết với CHCl3 đến kiệt alkaloid. Cô dịch chiết đến cắn Hòa vào 25 ml MeOH, lấy 2 ml dịch MeOH, lọc qua SPE, cho vào bình định mức 10 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm Mẫu thử Hòa vào H2SO4 2% lọc qua giấy lọc Dịch alkaloid muối Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 631 Hình 2. Sắc ký đồ mẫu thử ở điều kiện 5. Nhận xét Điều kiện 1: neferin rửa giải sớm, pic bất đối, chiều rộng pic lớn, chiều cao pic thấp. Điều kiện 2 và 3: neferin rửa giải quá sớm và vừa tách khỏi pic tạp. Điều kiện 4: neferin rửa giải quá trễ và tách hoàn toàn pic tạp, chiều cao pic thấp. Điều kiện 5: neferin rửa giải trong khoảng 12 phút, tách hoàn toàn pic tạp, chiều cao pic tăng so với điều kiện 4. Chọn điều kiện 5 với hệ pha động ACN: H2O: đệm phosphat 60 mM (30:45:25) là điều kiện sắc ký thích hợp vì thỏa mãn cả thời gian lưu, hình dạng pic, độ phân giải và độ đáp ứng pic neferin. Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp của hệ thống Bảng 1. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của phương pháp (n=6) Mẫu Giá trị thống kê tR (phút) S Nbk Rs As XTB 11,88 11.841.48 5 7811 10,4 1,3 SD 0,00 148.382 66 0,2 0,0 Đối chiếu RSD 0,01% 1,25% 0,85% 2,00% 1,27% XTB 11,89 36.645.73 9 7801 1,9 1,3 SD 0,02 32.900 75 0,1 0,0 Thử RSD 0,16% 0,09% 0,97% 1,59% 1,13% tR: thời gian lưu; S: diện tích đỉnh; Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến; Rs: độ phân giải; As: hệ số đối xứng. Nhận xét: RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại của mẫu đối chiếu và mẫu thử đều nhỏ hơn 2%. Hệ số đối xứng của pic neferin nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Độ phân giải giữa pic neferin và pic tạp lớn hơn 1,5. Vậy quy trình định lượng neferin đạt tính phù hợp của hệ thống. Tính chọn lọc Hình 3. Sắc ký đồ mẫu trắng (a), pha động (b) và dung dịch mẫu thử (c). Điều kiện sắc ký: như hình 1e. Nhận xét: Kết quả khảo sát tính chọn lọc cho thấy mẫu trắng (methanol) và mẫu pha động không có pic trùng với pic neferin. Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử tương đương với thời gian lưu của pic neferin trong sắc ký của của mẫu đối chiếu. Khi thêm chất đối chiếu neferin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích đỉnh của pic neferin tăng lên so với trước khi thêm. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic cho kết quả pic neferin không có các thành phần khác trong cả mẫu đối chiếu và mẫu thử. Như vậy qui trình định lượng neferin đạt tính chọn lọc của một qui trình định lượng. Độ đúng, độ lặp lại và khoảng tuyến tính Bảng 2. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại và khoảng tuyến tính Neferin Phương trình hồi qui Y = 3086,9x; R2 = 0,9997 Khoảng tuyến tính (μg/ml) 20 - 140 Độ lặp lại (n=6) RSD = 1,89% Độ đúng (n=9) RTB = 98,03 % RTB: tỷ lệ hồi phục trung bình. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 632 Nhận xét: Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ lặp lại. Xác định hàm lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen thu hái tại Đồng Tháp và mua từ nhà thuốc bắc Bảng 3. Kết quả định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen và trong tâm sen (n=6) Đồng Tháp Nhà thuốc bắc Cao chiết Tâm sen Cao chiết Tâm sen Hàm lượng neferin 2,8 mg/ml 0,32% (g/g) 0,95 mg/ml 0,15% (g/g) Hình 4. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (a), mẫu thử tâm sen thu hái tại Đồng tháp (b) và mẫu thử tâm sen mua từ nhà thuốc bắc (c). Điều kiện sắc ký: như hình 1c. Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng phần trăm neferin có trong tâm sen thu hái tại Đồng Tháp cao hơn khi mua tại nhà thuốc đông dược. Trên sắc ký đồ của mẫu thử tâm sen mua từ nhà thuốc đông dược có xuất một pic lạ có diện tích đỉnh lớn hơn pic neferin. Nguyên nhân có thể do mẫu tâm sen này được thu hái lâu và bảo quản không đúng qui định nên dẫn đến làm giảm hàm lượng neferin. KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector dãy diod quang, chúng tôi đã xây dựng được qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen. Phương pháp có tính đặc hiệu, đúng và chính xác, có thể ứng dụng để định tính, định lượng neferin trong nguyên liệu và một số chế phẩm bào chế từ sen cũng như theo dõi độ ổn định và xây dựng qui trình định tính điểm chỉ của chất này trong tâm sen Việt Nam ở các vùng miền và mùa thu hái khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen Yi, Luo Shun-De (2004), “Quantitative analysis of three main alkaloids in plumula nelumbinis and the study on characteristic chromatogram”, Chin Hosp Pharm J, 24(4), pp. 205-208. 2. Đỗ Tất Lợi (2005), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học, tr. 783- 786. 3. Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu (2009), Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược đại học Y- Dược TP.HCM. 4. Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ (1998), “Nghiên cứu thành phần hóa học trong lá sen”, Tạp chí dược học, tháng 6 nǎm 1998, tr 13 - 18. 5. Trịnh Văn Lẩu, Trần Việt Hùng, Phạm Thanh Kỳ (2009), ‘Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh khiết nuciferin, linarin, chlorogenic acid và myricetin từ những cây thuốc để làm chuẩn”, Pharma Indochina VI, tr. 587-592.