Xây dựng qui trình định lượng và khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 7 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT TỐC ĐỘ PHÓNG THÍCH HOẠT CHẤT CỦA THUỐC DÁN CLONIDIN Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mục tiêu: Thuốc dán clonidin trị cao huyết áp có nhiều ưu điểm hơn dạng uống nên đang được quan tâm nghiên cứu phát triển. Hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng chế phẩm này là hàm lượng và độ phóng thích hoạt chất. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng và khảo sát khả năng phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin. Phương pháp: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ thuốc dán. Thăm dò các điều kiện sắc ký về pha động: không có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào một tác nhân tạo cặp ion. Thăm dò quy trình thử độ hòa tan sử dụng phương pháp cánh khuấy trên đĩa ; tiến hành khảo sát các các yếu tố pH môi trường (H3PO4 0,001M; đệm HCl pH 4,5; đệm HCl pH 3,5 ; HCl 0,1 N), tốc độ cánh khuấy (50 vòng/ phút, 100 vòng / phút), thời gian lấy mẫu. Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng thuốc dán clonidin bằng HPLC với các điều kiện sắc ký: cột C18, thành phần pha động gồm 1,21g Natri 1-heptansulfonat trong 600 ml nước: 400 ml methanol và 1 ml acid phosphoric, chỉnh pH=3; phát hiện bằng đầu dò PDA tại bước sóng 210 nm, tốc độ dòng: 1 ml/ phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl.Với phương pháp chiết clonidin từ thuốc dán sử dụng 10 ml cloroform để phá nền dính và 10 ml HCl 0,003% để chuyển clonidin từ dạng base sang dạng acid tan trong HCl 0,003%, lấy lớp acid định lượng. Đã xây dựng được được quy trình thử độ hòa tan: phương pháp cánh khuấy trên đĩa, môi trường 500 ml HCl 0,1 N, tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút, thời gian lấy mẫu 1-2-4-6-8-10-12 giờ Kết luận: Phương pháp định lượng trên được chứng minh là phù hợp để định lượng clonidin trong thuốc dán và trong môi trường thử độ hòa tan. Đồng thời đề tài đã khảo sát được quy trình thử độ hòa tan cho thuốc dán clonidin, quy trình cho kết quả ổn định. Từ khóa: Clonidin, thuốc dán hấp thu qua da, độ hòa tan thuốc dán. ABSTRACT DEVELOPING THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDIN IN TRANSDERMAL PATCHES AND SURVEYING THEIR RELEASE RATE Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Nguyen Thien Hai, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 7 - 13 Objectives: Clonidine patches as an antihypertensive agent have more advantages than oral dosage forms, therefore the development of clonidine patches is regarded. Two important qualitative evaluation factors are the content and release rate of clonidine. This topic is done with the goal: development of the assay method and dissoluion tests for clonidine transdermal patches. Method: Probe conditions extracted clonidine from patches. Exploration phase chromatographic conditions: no buffer solution, using a buffer solution, in addition to an artificial ion pair. The dissolution test was performed using apparatus 5 (Paddle over Disk); and examing the pH of medium (0.001 M H3PO4; HCl buffer pH 4.5; HCl * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 8 buffer pH 3.5; HCl 0.1 N), the paddle speed (50 rpm, 100 rpm), and the sample times. Results: The quantitative test has been developed using HPLC with chromatographic conditions: column C18, the mobile phase consists of 1.21 g sodium 1-heptansulfonat in 600 ml water: 400 ml methanol and 1 ml phosphoric acid, adjust to pH = 3; detected by PDA detector at 210 nm.%); flow rate: 1ml/minute; injected sample volume: 20 µl. The extraction method of clonidine from the patches used 10 ml cloroform and 10 ml and HCl 0.003% (cloroform was used to destroy the adhesive layer, HCl 0.003% was used to change Clonidine base into Clonidine hydrochloride), the acid layer was taken to assay. The dissolution test has been developed using apparatus paddle over disk, 500 ml HCl 0.1 N, 50 rpm, sampled times: 1-2-4-6-8-10-12 hr. Conclusion: The quantitative method has been developed and demonstrated that was suitable to quantify the clonidine in the patches and in the dissolution medium. The topic has also developed the dissolution testing process for clonidine patches Key words: Clonidin, Transdermal patch, Dissolution transdermal patches ĐẶT VẤN ĐỀ Dạng thuốc dán hấp thu qua da (Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày càng được quan tâm phát triển rộng rãi do có rất nhiều ưu điểm hơn dạng uống. Thuốc dán điều trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin để điều trị tăng huyết áp. Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5mg đã được Khoa Dược – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Để phát triển dạng thuốc này thì cần có những chỉ tiêu kiểm soát chất lượng, hai tiêu chí chất lượng quan trọng là: hàm lượng hoạt chất trong thuốc dán và tốc độ phóng thích hoạt chất. Do đó đề tài này được thực hiện với mục tiêu: - Xây dựng quy trình định lựợng thuốc dán clonidin. - Khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Thuốc dán Clonidin 2,5 mg của Khoa dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh. Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 2,5mg/3,5cm2 hạn dùng tháng 05/2013 của công ty Boehringer Ingelhem, Đức. Nguyên liệu Chất chuẩn Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng 04 / 2014 do Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM cung cấp. Hóa chất, dung môi Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1- heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký. Trang thiết bị Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type PTWS3C, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2965, đầu dò dãy diod quang (Waters, Mỹ). Máy đo pH Metrohm 744 (Metrohm, Đức). Máy siêu âm Elma (Elma, Đức). Phương pháp nghiên cứu Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong thuốc dán bằng HPLC với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện sắc ký Clonidin là một chất có tính base, phân cực nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn. Qua tham khảo các tài liệu(1) định lượng clonidin trong thuốc dán điều kiện sắc ký ban đầu được đề nghị như sau: Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 9 Tốc độ dòng: 1 ml/phút Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 210 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Pha động A (không có dung dịch đệm): methanol – nước (40:60) được điều chỉnh đến pH 3 bằng acid phosphoric. Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60) được thêm 1 ml acid phosphoric rồi điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%. Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21g natri 1-heptansulfonat và 1 ml acid phosphoric rồi điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%. Khảo sát 3 hệ pha động trên để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thoả mãn các yêu cầu sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác (nếu có) và có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Khảo sát điều kiện chiết clonidin trong thuốc dán: Cách 1: Dựa theo chuyên luận USP 32 (1) dùng tetrahydrofuran để chiết clonidin trong thuốc dán Cách 2: Chọn cloroform làm dung môi để chiết clonidin trong thuốc dán vì clonidin base rất dễ tan trong cloroform. Nồng độ dung dịch HCl 0,003% đủ để chuyển hết clonidin base sang acid. Chiết clonidin HCl trong miếng thuốc dán bằng cách lắc rung(vortex) với cloroform trong thời gian 5, 10, 15, 20 phút thì thấy diện tích đỉnh của sắc ký đồ tăng lên theo thời gian và sau 20 phút thì diện tích đỉnh của clonidin HCl không có sự khác nhau trong kết quả định lượng. Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid gốc: Hòa tan clonidin HCl chuẩn trong nước cất để được dd chuẩn gốc có nồng độ 0,1 mg/ml và bảo quản ở 0 – 4 oC Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước cất để có dung dịch chuẩn nồng độ 60 µg/ml Mẫu thử Lấy miếng thuốc dán ra khỏi bao bì, cắt miếng thuốc dán có diện tích 1cm2 (1cm x 1cm), loại bỏ lớp bảo vệ bao phủ lên trên bề mặt bắt dính của lớp chứa hoạt chất, cho vào chai có nắp đậy chặt dung tích khoảng 25 ml (đường kính khoảng 2 cm), thêm chính xác 10 ml cloroform. Lắc rung mạnh trong 20 phút. Thêm chính xác 10 ml dung dịch HCl 0,003% (g/ml). Lắc rung mạnh tiếp 5 phút. Để yên ở nhiệt độ phòng từ 20 phút đến 30 phút. Lấy lớp trên (lớp nước acid), lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký. Hàm lượng clonidin, C9H9Cl2N3, tính bằng mg trong một miếng thuốc dán 1 cm2 được tính theo công thức: 6,266 1,230 1000 1 10 ××××= C C T C S S X Trong đó: ST: diện tích pic của clonidin HCl trong mẫu thử. SC: diện tích pic của clonidin HCl trong mẫu chuẩn. CC: Nồng độ clonidin HCl trong dung dịch chuẩn (µg/ml) 230,1: phân tử lượng của clonidin 266,6: phân tử lượng của clonidin HCl Thẩm định qui trình định lượng Gồm tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Qui trình thử độ hòa tan thuốc dán Dựa trên USP 32 và một số tài liệu tham khảo khác (2,3) về thử độ hòa tan thuốc dán Các điều kiện, yếu tố xác định Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type PTWS3C. Thiết bị kiểu cánh khuấy trên đĩa (thiết bị loại 5 theo USP 32). Mặt kính (d = 8cm), lưới (d = 8cm), kẹp Thể tích môi trường: 500ml Nhiệt độ: 32 ± 0,5 oC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 10 Khoảng cách từ bề mặt dưới cánh khuấy đến bề mặt lưới: 25 ± 2mm Thể tích lấy mẫu: 2ml. Các yếu tố cần khảo sát Môi trường: H3PO4 0,001 M, HCl (pH =4,5), HCl (pH= 3,5), HCl 0,1 N Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút và 100 vòng/phút Thời điểm lấy mẫu: 1- 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12giờ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký được thể hiện qua hình 1. (a) (b) (c) (d) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C và chiết clonidin trong thuốc dán bằng cloroform (d) với pha động C. Nhận xét: Với pha động A, pic clonidin xuất hiện rất sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút. Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58 phút nhưng bị kéo đuôi. Pha động C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 10 phút, pic clonidin tách hoàn toàn pic tạp và có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vì vậy pha động C được lựa chọn. Khảo sát điều kiện chiết clonidin trong thuốc dán Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký cho thấy khi chiết clonidin trong thuốc dán bằng tetrahydrofuran thì mẫu còn lẫn nhiều tạp và pic clonidin chưa tách hẳn khỏi pic tạp (Hình 2).Còn khi chiết clonidin trong thuốc dán bằng cloroform thì loại được phần lớn tạp và pic clonidin tách hoàn toàn khỏi pic tạp (Hình 1d). Do đó chọn cách xử lí thuốc dán bằng cách chiết với cloroform được lựa chọn. Thẩm định qui trình định lượng clonidin trong thuốc dán Khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6) Kết quả phân tích lặp lại 6 lần mẫu thuốc thử được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6) Diện tích pic (µAu x giây) Thời gian lưu (phút) Hệ số đối xứng (As) Số đĩa lý thuyết (N) Độ phân giải (Rs) TB RSD 6699881 1,41% 10,6239 1,65% 1,1115 0,45% 11264 0,64% 5,45 0,95% Nhận xét: RSD của các thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý thuyết, độ phân giải đều có RSD < 2%, chứng tỏ qui trình có tính phù hợp hệ thống. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 11 Hình 1d. Sắc ký đồ mẫu thuốc dán khi chiết với clororm Hình 2. Sắc ký đồ mẫu thuốc dán khi chiết với tetrahydrofuran Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả cho thấy: phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau (hình 3), thời gian lưu của pic trong mẫu thử (hình 1d) tương đương với thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu trắng (hình 4) không có pic trùng với pic clonidin, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic cho thấy pic clonidin trong mẫu thử tinh khiết (hình 5). Do đó, có thể khẳng định qui trình phân tích có tính đặc hiệu. Hình 3: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b) Hình 4: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 5: Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic clonidin HCl trong mẫu thử (a) (b) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 12 Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác Chỉ tiêu thẩm định Clonidin HCl Phương trình hồi qui Ŷ = 119744 X ; R2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính (µg/ml) 5 – 150 Độ đúng (tỷ lệ hồi phục, n=9) Tỷ lệ hồi phục ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng 97,51 102,39% chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đúng cao trong phạm vi khảo sát. Độ chính xác Kết quả phân tích các mẫu thử khác nhau ở cùng nồng độ tại 3 ngày khác nhau. Mỗi ngày sắc ký 6 mẫu thử khác nhau đều cho độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, vậy qui trình đạt độ chính xác liên ngày. Độ chính xác trong ngày và khác ngày (n=18) Độ lặp lại (n=6 Kết quả phân tích 6 mẫu thử khác nhau ở cùng nồng độ cho độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,23% < 2%, vậy qui trình phân tích đạt yêu cầu độ lặp lại. Kết quả khảo sát thử độ hòa tan thuốc dán clonidin: Môi trường H3PO4 0,001M thì chỉ độ phóng thích clonidin trong thuốc thử tăng, còn clonidin trong thuốc dán đối chiếu catapres giảm theo thời gian. Môi trường đệm HCl pH= 4,5 và đệm HCl pH= 3,5 thì không thấy có pic clonidin, chỉ xuất hiện một pic tạp nên không định lượng được clonidin trong hai môi trường này (Hình 6). Hình 6: Sắc ký đồ thử đồ hòa tan của thuốc dán clonidin trong môi trường HCl pH= 4,5(a) và đệm HCl pH= 3,5(b) ở thời điểm 12h Môi trường HCl 0,1N thì độ phóng thích của clonidin trong thuốc thử và thuốc đối chiếu đều tăng. Về khảo sát tốc độ cánh khuấy tăng lên 100 vòng/phút so với tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút thì độ phóng thích hoạt chất giữa hai tốc độ quay cho kết quả định lượng khác nhau không có ý nghĩa. Đồng thời do thể tích môi trường thử độ hòa tan sử dụng là 500ml nên chọn tốc độ quay của cánh khuấy là 50 vòng/phút để hạn chế thủy động cao có thể tạo dòng xoáy bào mòn nhanh đến tá dược nền dính polymer có trong thành phần thuốc dán. Miếng thuốc dán được ngâm trong môi trường dung dịch HCl 0,1N liên tục 12h nên có thể sau 12h môi trường bị phân hủy làm ảnh hưởng đến hoạt chất bởi tá dược nền dính có trong thuốc dán cũng được phóng thích làm môi trường bị đục có thể làm kết quả định lượng clonidin bị sai. Độ phóng thích clonidin trong thuốc dán được khảo sát đến 12h cũng chứng minh được tác động kéo dài của miếng thuốc dán. Từ các kết quả khảo sát trên ta thiết lập thông số thử độ hòa tan như sau: Máy đo độ hòa tan: PHARMATEST TYPE PTWS3C. Thiết bị: cánh khuấy trên đĩa (thiết bị loại 5) gồm có mặt kính đồng hồ đường kính 8 cm, tấm lưới thép không rỉ đường kính 8cm, cỡ mắt lưới khoảng 0,1 mm, đường kính sợi lưới khoảng 0,02mm.Gỡ bỏ lớp bảo vệ miếng thuốc dán, dán nhẹ mặt dính của miếng thuốc lên tấm lưới rồi cố định vào mặt kính đồng hồ bằng kẹp sao cho miếng thuốc dán nằm ở giữa mặt kính và miếng lưới, bề mặt phóng thích hoạt chất hướng lên trên. Môi trường thử độ hòa tan: 500 ml HCl 0,1N Nhiệt độ thử nghiệm: 32°C ± 0,5°C. Tốc độ quay: 50 vòng/ phút. Thả hệ mặt kính - thuốc dán - lưới vào bình hòa tan sao cho mặt kính đồng hồ thật phẳng và song song với cạnh đáy của cánh khuấy, hạn chế không để có bọt khí trên bề mặt miếng thuốc dán. Hạ cánh khuấy xuống sao cho khoảng cách (a) (b) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 13 từ cạnh đáy cánh khuấy đến bề mặt đĩa cố định ở 25 ± 2 mm. Thời điểm lấy mẫu: 1- 2 - 4 - 6 - 8 – 10 - 12 giờ. Thể tích mẫu lấy định lượng: 2 ml môi trường hòa tan, lọc qua màng lọc 0,45 µm, ta có dung dịch thử. Tiến hành định lượng theo quy trình ở trên Dung dịch chuẩn: xây dựng đường chuẩn bằng cách pha dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid ở 3 nồng độ khác nhau (sao cho nồng độ định lượng được giới hạn trong đường chuẩn này). Lọc qua màng lọc 0,45µm. Sắc ký đồ về phương pháp thử độ hòa tan thuốc dán đã xây dựng được thể hiện (Hình 7) Hình 7: Sắc ký đồ thử đồ hòa tan của thuốc dán clonidin trong thuốc thử (a) và thuốc đối chiếu Catapres (b) trong môi trường HCl 0,1N ở thời điểm 12h Ứng dụng qui trình thử độ hòa tan thuốc dán Clonidin(n=6) và thuốc đối chiếu Catapres(n=6) Hình 8. Đồ thị biểu diễn sự phóng thích theo thời gian của thuốc dán clonidin 2,5 mg và thuốc dán Catapres 2,5 mg KẾT LUẬN Đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng và khảo sát độ hòa tan của clonidin trong thuốc dán bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Qui trình định lượng clonidin đã được thẩm định về tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Quy trình đã được ứng dụng để xác định phần trăm phóng thích clonidin trong thuốc dán thử nghiệm và thuốc dán đối chiếu Catapres. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. United States Pharmacopoeia 32 (2009). The United States Pharmacopeial Convention, 557-563. 2. AAPS Pharm Sci Tech (2003). FIP/AAPS Guidelines to Dissolution/in Vitro Release Testing of Novel/Special Dosage Forms. 3. Shah VP, Tymes NW, Skelly JP (1989). In vitro release profile of clonidin transdermal therapeutic systems scopolamine patches. Pharmaceutical research. 6, 346-351. Ngày nhận bài báo : 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo : 25.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014 C lo n id in H C l Thời gian (giờ) P h ầ n t ră m c lo n id in p h ó n g t h íc h (b)(a)