Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Hesperidin và Diosmin trong viên nén bao phim DIOSFLON

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 570 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HESPERIDIN VÀ DIOSMIN TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM DIOSFLON Nguyễn Hà Mỹ Thùy*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng chế phẩm DIOSFLON có chứa diosmin 450 mg và hesperidin 50 mg. Phương pháp: Dùng dimethyl sulfosid (DMSO) chiết diosmin và hesperidin ra khỏi chế phẩm và dùng phương pháp HPLC để định lượng hai họat chất này. Kết quả: Quy trình định lượng HPLC đã xây dựng và thẩm định cho phép định lượng đồng thời hesperidin và diosmin với hệ số R2hesperidin= 0,9998, R2diosmin =0,9999, độ chính xác với RSD hesperidin=0,54%; RSD diosmin=0,08%; độ đúng với tỷ lệ phục hồi 99,02 % với diosmin và 102,21 % với hesperidin. Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời diosmin và hesperidin bằng phương pháp HPLC đáng tin cậy và khả thi, có thể ứng dụng vào kiểm nghiệm. Từ khóa: diosmin, hesperidin, HPLC, DIOSFLON. ABSTRACT SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF DISOMINE AND HESPERIDINE IN DIOSFLON FILM-COATED TABLETS Nguyen Ha My Thuy, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 570 - 573 Objectives: Study of a simultaneous quantititative method for DIOSFLON film-coated tablets containing diosmine 450 mg and hesperidine 50 mg. Method: Extraction of disomine and hesperidine by using dimethyl sulfoxyd (DMSO) prior to application to HPLC. Results: The validated HPLC procedure allowed to analyze quantitatively hesperidine và diosmine in the product. Conclusions: The established HPLC method is reliable and applicable for simultaneous quantitative determination of disomine and hesperidine in ratio 9:1. Key words: Diosmine, hesperidine, HPLC, DIOSFLON. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh suy tĩnh mạch là một bệnh khá phổ biến hiện nay, thể hiện qua các chứng vỡ mao mạch, trĩ và số triệu chứng tim mạch khác(3). DAFLON® một sản phẩm khá phổ biếncủa hãng dược phẩm Servier chứa hai họat chất là diosmin 450 mg và hesperidin 50 mg với tỷ lệ là 9: 1 có tác dụng chính trong diều trị suy tĩnh mạch mạn tính. Hiện nay nhu cầu việc điều trị bệnh này ngày càng tăng, trong khi đó thuốc ngọai nhập giá rất đắt. Vì vậy việc nghiên cứu các chế phẩm có chứa hai họat chất này càng được nhiều công ty dược Việt Nam quan tâm. Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm đồng thời hai họat chất này vẫn gặp nhiều khó khăn. Đề tài này nhằm mục đích xây dựng 1 quy *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vnn.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 571 trình kiểm nghiệm đồng thời diosmin và hesperidin trong viên DIOSFLON chứa 2 flanonoid nói trên với tỷ lệ 9:1. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim DIOSFLON 500, là sản phẩm nghiên cứu của Ban NCKH-TV, được sản xuất tại Cty dược Roussel Việt Nam. Chất đối chiếu, hóa chất, dung môi Chất đối chiếu: diosmin hàm lượng tính theo khan 95%, độ ẩm 6,41 % (Mekophar), hesperidin hàm lượng nguyên trạng 80% (Merck). Dung môi, hóa chất: methanol HPLC (Merck), acid acetic, DMSO PA, nước cất. Thiết bị Máy HPLC Shimadzu 20-AD, cột Eurosphere LC 18 (150 x 4,6 mm, 5μm) Phương pháp nghiên cứu Qua nhiều khảo sát trên các tỷ lệ dung môi khác nhau chúng tôi chọn được pha động với tỷ lệ như sau acicid acetic: methanol:nước (30:32:65), Detector-UV 275 nm, thể tích bơm 20 μl, nhiệt độ cột 25 0C, tốc độ dòng 1,2 ml. Với điều kiện trên, 2 píc hesperidin và diosmin tách rõ đẹp trên sắc đồ HPLC. Chiết hai họat chất ra khỏi chế phẩm bằng DMSO, tiến hành pha loãng sao cho hàm lượng mẫu chế phẩm và mẫu đối chiếu có hàm lượng là diosmin chuẩn 450 μg/ml, hesperidin chuẩn 50 μg/ml. Tiến hành xác định đường hồi quy tuyến tính, độ đúng và độ chính xác(1). KẾT QUẢ Sắc ký đồ HPLC thể hiện phân lập đồng thời hesperidin và diosmin Hình 1. Sắc ký đồ HPLC mẫu chế phẩm(trên) và mẫu đối chiếu (dưới). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 572 Tính tương thích hệ thống Tiến hành tiêm lần lượt mẫu dung dịch thử 6 lần, chúng tôi thu được kết quả tính như sau. Bảng 1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống hỗn hợp diosmin-hesperidin 9:1 Tên tR S N AF hesperidin 7,940 883605 8944 0,802 hesperidin 7,891 888244 9052 0,799 hesperidin 7,862 883745 9090 0,790 hesperidin 7,839 885908 9134 0,812 hesperidin 7,845 880872 9128 0,821 hesperidin 7,822 884077 9075 0,806 Trung bình 7,866 884408 9070 0,812 RSD % 0,54 0,28 0,77 1,390 Tên tR S N AF K’ Rs diosmin 17,379 7165011 11039 0,791 1,189 7,331 diosmin 17,211 7172023 11051 0,792 1,181 7,317 diosmin 17,141 7145204 10992 0,800 1,180 7,306 diosmin 17,064 7168565 11012 0,805 1,177 7,302 diosmin 17,077 7158432 11039 0,809 1,177 7,308 diosmin 17,018 7148269 11091 0,810 1,176 7,308 Trung bình 17,148 7159584 11037 0,801 1,180 7,312 RSD % 0,77 0,15 0,31 1,038 0,416 0,143 Nhật xét: RSD của các lần tiêm lập lại < 2% nên quy trình định lương hesperidin và diosmin đạt tốt tính tương thích hệ thống. Khảo sát tính tuyến tính. Khảo sát 3 dung dịch chuẩn với tương ứng 5 nồng độ hesperdin khác nhau ta thu được kết quả như sau Bảng 2. Kết quả khảo sát tính tuyến tính hesperidin. Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 12,5 200738 25 465534 50 944875 62,5 1198620 125 2390525 Hình 2. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh hesperidin. Nhận xét: có tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh phương trính hồi quy có dạng y=19396x-26707, với R2 = 0,9998, P=0,07>α=0,05. Bảng 3. Kết quả khảo sát tính tuyến tính diosmin. Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 112.5 1483571 225 3482268 450 6979013 562.5 8919336 1125 17943958 Hình 3. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh diosmin. Nhận xét: có tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh phương trính hồi quy có dạng y=16196x-255365, với R2 = 0,9999, P=0,03<α=0,05. y = 19396x - 26707 R2 = 0.9998 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 0 50 100 150 Diện tích đỉnh Nồng độ / l y = 16196x - 255365 R2 = 0.9999 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 0 500 1000 1500 oä l) Diện tích đỉnh Nồng độ µg/ml Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 573 Khảo sát độ lặp lại Thực hiện định lượng mẫu chế phẩm DIOSFLON dựa trên điều kiện HPLC đã khảo sát với nồng độ 450 μg/ml, hesperidin 50 μ g/ml. Bảng 0. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hàm lượng diosmin và hesperidin STT HL diosmin so với trên nhãn (mg) HL hesperidin so với trên nhãn (mg) 1 451,8 49,74 2 452,0 49,87 3 451,4 49,26 4 451,0 49,57 5 451,6 49,19 6 452,0 49,60 TB 452,6 49,52 SD 0,38 0,27 RSD 0,08 0,54 Nhận xét: Kết quả cho độ lặp lại tốt. Khảo sát độ đúng Độ đúng được xác định bằng cách thêm chuẩn. Thêm một lương chất chuẩn tương ứng với 80, 100, 120 % nồng độ họat chất tìm thấy trong mẫu thử. Tiến hành trên 3 mẫu thử riêng biệt tương ứng với từng nồng độ, chúng tôi thu được kết quả sau. Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng đối với diosmin. STT HL thêm vào (mg) HL tìm thấy (mg) % HL tìm thấy % HL TB tìm thấy 1 362,1 358,7 99,06 2 362,1 352,5 97,35 3 362,1 364,9 100,77 99,06 4 452,6 463,9 102,50 5 452,6 452,9 100,07 6 452,6 431,2 95,27 99,28 7 543,1 542,3 99,85 8 543,1 549,2 101,1 9 543,1 527,1 97,05 99,33 Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng đối với hesperidin STT HL thêm vào (mg) HL tìm thấy (mg) % HL tìm thấy % HL TB tìm thấy 1 39,6 39,9 100,76 2 39,6 40,4 102,02 3 39,6 41,1 103,79 102,19 4 49,5 49,2 99,39 5 49,5 49,2 99,39 6 49,5 49,1 99,19 99,32 7 59,4 60,0 101,01 8 59,4 61,1 102,86 9 59,4 60,9 102,53 102,13 Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có độ đúng cao. Tỷ lệ tìm thấy 99,02 % ở diosmin và 101,21 % ở hesperidin cho thấy phương pháp phù hợp và đảm bảo định lượng đúng và đồng thời hesperidin, diosmin. KẾT LUẬN Các kết quả thực nghiệm cho thấy quy trình HPLC đã xây dựng cho phép định lượng đồng thời hesperidin và diosmin trong viên nén bao phim DIOSFLON 500 chứa 450 mg diosmin và 50 mg hesperidin với độ chính xác cao, độ đúng tốt, khoảng tuyến tính rộng với độ tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích píc đã khảo sát. Ngoài ra, cách tiến hành cũng đơn giản, nhanh chóng. Do đó, phương pháp này có thể ứng dụng để định lượng đồng thời diosmin và hesperidin trong các chế phẩm tương tự. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng cao áp ứng dụng và nghiên cứu Dược liệu và hóa hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Y học, Chi nhánh TP. Hồ Chí Minh 2. Jobiell (2002), Facts and Comparisons the Preview of Natural Products, Second Edition. Acaeamic Press, San Diego, California, pp 1-22. 3. USP XXIX, Dissolution (pp 2673 – 2682); In vitro and in vivo evaluation of dosage forms (pp2924 – 2929); In vivo bioequivalence guidances (pp 2929 – 2968).