Khảo sát đột biến kháng lamivudine của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mãn tính tại Thành phố Cần Thơ năm 2010

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y tế Công cộng 195 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE CỦA HBV Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MÃN TÍNH TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ NĂM 2010 Nguyễn Thị Hải Yến* , Trần Thị Như Lê*, Cao Minh Nga** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Lamivudine là thuốc thường được lựa chọn để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính vì tính vượt trội về độ an toàn, không tai biến dù điều trị lâu dài cho cả người lớn và trẻ em. Tuy nhiên, thời gian điều trị Lamivudine càng dài thì tình trạng kháng thuốc càng tăng. Những bệnh nhân kháng thuốc này có thể bộc phát HBV-DNA và tăng ALT trở lại, chức năng gan mất bù kể cả bị ung thư gan nguyên phát. Vấn đề đặt ra là nhanh chóng tìm ra các loại đột biến kháng Lamivudine và các yếu tố liên quan để có kế hoạch điều trị thích hợp và nắm được dịch tễ học kháng Lamivudine của bệnh nhân viêm gan B mãn tính. Mục tiêu nghiên cứu: (1) Mô tả tỉ lệ và các kiểu đột biến gen kháng Lamivudine trên bệnh nhân đã điều trị Lamivudine một năm bằng kỹ thuật Realtime PCR. (2) Xác định mối liên quan giữa genotype HBV, giới tính với tình trạng đột biến kháng kháng Lamivudine ở bệnh nhân viêm gan B mãn tính Phương pháp nghiên cứu: Từ những bệnh nhân viêm gan B mãn tính đã và/hoặc đang được điều trị với Lamivudine > 12 tháng. Chúng tôi tiến hành định lượng HBV-DNA, xác định genotype cũng như tìm các vị trí đột biến (rt204V/I và rt180) trên cấu tạo gen polymerase bằng kỹ thuật Realtime PCR với các đoạn mồi và các mẫu dò đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 42 bệnh nhân (nam 69%, nữ 31%). Kiểu gen phổ biến trong mẫu nghiên cứu là kiểu gen B và kiểu gen C (54,8% và 16,7%), một số ít có kiểu gen B-C. Không có sự khác biệt về kiểu gen giữa bệnh nhân nam và nữ (p > 0,05). Đột biến kháng Lamivudine của HBV chiếm 47,6% trong đó đột biến ở vị trí rt204I (chiếm 21,9%), vị trí rt204V + rt204I (chiếm 23,7%) và rt180 + rt204V + rt204I chiếm 2,4%. Kết luận: Tình trạng kháng thuốc của virus viêm gan B ngày càng tăng, đặc biệt là kháng Lamivudine. Trong khi đó kỹ thuật xác định vị trí đột biến kháng Lamivudine ngày một nhiều và chi phí ngày càng thấp do đó các bác sĩ lâm sàng cần áp dụng các xét nghiệm sinh học phân tử để nhanh chóng tìm ra những bệnh nhân viêm gan B mãn tính có khả năng có đột biến kháng Lamivudine để tránh các biến chứng đáng tiếc do HBV gây nên. Từ khóa: HBV, viêm gan B, đột biến, kháng Lamivudine. ABSTRACT DETECTING MUTATIONS OF HEPATITIS B VIRUS THAT HELP THE VIRUS RESISTANT TO LAMIVUDINE AMONG CHRONIC HEPATITIS B PATIENTS IN CAN THO CITY Nguyen Thi Hai Yen, Tran Thi Nhu Le, Cao Minh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 193 - 197 Backgrounds: Lamivudine is the common drug to treat chronic hepatitis B because of its superior safety even long-term treatment for both adults and children. However, the duration of lamivudine * Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Cần Thơ ** Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ: PGS.TS Cao Minh Nga ĐT: 0908361512 Email: pgscaominhnga@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 196 treatment is longer, the drug resistance is more increasing. These patients can be outbreak of HBV-DNA and have ALT increased again, decompensated liver function, including primary liver cancer. The question for our scientists is quickly identifying the types of mutations and factors associated with lamivudine resistance mutations in order to plan the appropriate treatment and and have epidemiological understanding of lamivudine-resistant patients chronic hepatitis B. Objectives: To describe the incidence and types of lamivudine resistance mutations of hepatitis B virus (HBV) in patients with long-term lamivudine treatment by Realtime PCR technique and to identify the relationship between HBV genotype and gender with the lamivudine resistance mutations in chronic hepatitis B virus- infected patients. Method: The serum samples were taken from chronic HBV - infected patients who were receiving lamivudine treatment more than 12 months duration. These serum samples were genotyped and detected the mutation position (rt204V/I and rt180) polymerase gene by Realtime PCR technique with primers and probes specific. Result: The study was performed on 42 patients (male 69%, female 31%). Common genotype in the study sample is genotype B and genotype C (54.8% and 16.7%), few have genotype B+C. There was no significant difference of HBV genotypes between male and female patients (p> 0.05). HBV lamivudine resistance mutations were detected in 47.6% of total, of which mutation in position rt204I (21.9%), position rt204I+ rt204V (23.7%) and rt180 + rt204I+ rt204V (2.4%). Conclusions: Resistance of HBV is increasing, especially lamivudine resistance. Meanwhile the technique of detecting lamivudine-resistant mutations is abundant and have low cost so that the clinician should apply the test of molecular biology to quickly identify patients with chronic hepatitis B is capable of lamivudine resistance mutations in order to avoid unfortunate complications caused by HBV. Keywords: HBV, hepatitis B, mutantion, lamivudine resistance. ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan B mạn tính đã trở thành gánh nặng trong cộng đồng: 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới trong khi đó chỉ có 40 triệu người nhiễm HIV. Hằng năm có 1 triệu người chết do virus viêm gan B, 2800 người chết/ ngày, 115 người chết/giờ, nhiều người chết/phút vì ung thư gan nguyên phát và xơ gan(1, 2, 7, 8, 9, 12). Tại Việt Nam ước tính có 7-14 triệu người nhiễm virus viêm gan B mạn tính, 15-20% bệnh nhân viêm gan B mạn tính có nguy cơ bị xơ gan và ung thư gan. Làm thế nào để ngăn chặn tình trạng xơ gan và ung thư gan ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính? Đây là một vấn đề khó khăn đặt ra cho các bác sĩ lâm sàng: Cần lựa chọn biện pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Và Lamivudine là thuốc đầu tay mà các y bác sĩ lựa chọn để điều trị bệnh viêm gan B mạn tính vì tính vượt trội về độ an toàn, không tai biến dù điều trị lâu dài cho cả người lớn và trẻ em. Tuy nhiên, thời gian điều trị Lamivudine càng dài thì tình trạng kháng thuốc càng tăng. Những bệnh nhân kháng thuốc này có thể bộc phát HBV-DNA và tăng ALT trở lại, chức năng gan mất bù kể cả bị ung thư gan nguyên phát. Vì vậy, chúng ta cần nhanh chóng phát hiện ra các loại đột biến và các yếu tố liên quan đến đột biến kháng Lamivudine để có kế hoạch điều trị thích hợp và nắm được dịch tễ học kháng Lamivudine của bệnh nhân viêm gan B mãn tính. Vì vậy chúng tôi đề tài “Khảo sát đột biến kháng Lamivudine của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mãn tính tại TP. Cần Thơ năm 2010” với mục tiêu: 1. Mô tả tỉ lệ và các kiểu đột biến gen kháng Lamivudine trên bệnh nhân đã điều trị Lamivudine một năm bằng kỹ thuật Realtime Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y tế Công cộng 197 PCR. 2. Xác định mối liên quan giữa genotype HBV, giới tính với tình trạng đột biến kháng kháng Lamivudine ở bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Loại hình nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích. Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn mẫu: - Tất cả bệnh nhân đã được đã được chẩn đoán viêm gan B mãn tính đang được điều trị bằng Lamivudine  1 năm. - Không đồng nhiễm với các tác nhân virus gây viêm gan khác. - Bệnh nhân tự nguyện chấp nhận tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ: - Bệnh nhân viêm gan B cấp - Bệnh nhân viêm gan B mãn điều trị Lamivudine < 1 năm - Đồng nhiễm HCV, HDV, HIV - Đang có những bệnh viêm gan khác: Viêm gan do rượu, do thuốc, viêm gan tự miễn.. Cỡ mẫu: n = 42. Thời gian và địa điểm thu thập mẫu: từ 5/2010 – 9/2010 tại TP Cần Thơ. Phương pháp nghiên cứu - Định lượng HBV bằng kỹ thuật Realtime- PCR - Định genotype HBV và xác định đột biến kháng Lamivudine bằng kỹ thuật Realtime PCR tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. - Nhập và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm về đối tượng nghiên cứu Bảng 1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu (n=42) Đặc tính Tần số Tỉ lệ (%) Đặc tính Tần số Tỉ lệ (%) Nam 29 69,0 Giới Nữ 13 31,0 B 23 54,8 C 7 16,7 B+C 5 11,9 Genotype HBV Không xác định 7 16,7 Đột biến kháng Lamivudine 20 47,6 Hình 1: Kết quả khảo sát đột biến kháng Lamivudine của HBV Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân Bảng 2: Sự phân bố kiểu gen theo giới tính (n=30) B C Kiểu gen HBV N Tỉ lệ (%) N Tỉ lệ (%) Nam (n=21) 16 76,19 5 23,81 Nữ (n=9) 7 77,77 2 22,23 χ2 = 0,009, P = 0,925 - OR = 0,914 (KTC 0,142-5,902) Nhận xét: Sự phân bố genotype HBV ở bệnh nhân nam và nữ khác biệt không có ý nghĩa thống kê với (p > 0,05). Tỉ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine Bảng 3: Các loại đột biến kháng Lamivudine (n=20) Các loại đột biến N Tỉ lệ (%) rt204I 9 21,9 rt204I + rt204V 10 23,8 rt180 + rt204I + rt204V 1 2,4 Nhận xét: Chúng tôi chỉ xét trên số bệnh nhân có genotype B và C. Qua kỹ thuật Realtime PCR 2 vị trí đột biến rt204V/I và rt180 được ghi nhận: 9 trường hợp đột biến tại một điểm (chiếm 21,9%), 10 trường hợp có đột rt204I rt180 rt204V Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 198 biến tại 2 điểm (23,8%) và 2,4% bệnh nhân có đột biến tại 3 điểm. Xác định mối liên quan giữa genotype HBV với tình trạng kháng Lamivudine Bảng 3: Mối liên quan giữa genotype HBV với tình trạng kháng Lamivudine Đột biến Không đột biến Kiểu gen HBV N Tỉ lệ (%) N Tỉ lệ (%) B 11 47,8 12 52,8 C 5 71,4 2 28,6 χ2 = 1,202 , P = 0,273 OR = 0,367 (KTC 0,059-2,292) Nhận xét: Mối liên quan giữa genotype HBV với tình trạng đột biến kháng Lamivudine khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) BÀN LUẬN Về đặc tính mẫu nghiên cứu (Bảng 1) Tổng cộng có 42 bệnh nhân tham gia nghiên cứu trong đó nam chiếm đa số 69%, nữ chiếm 31%. Kiểu gen phổ biến của người dân Đồng Bằng sông Cửu Long là 2 kiểu gen B và C, kiểu gen B chiếm số đông 54,8% và kiểu gen C chiếm 16,7%; tương tự như nhiều kết quả nghiên cứu khác ở trong nước(3, 4, 5, 6). Có 2,4% bệnh nhân mang kiểu gen hỗn hợp B và C, tương đồng với kết quả nghiên cứu của Lê T. Đỗ Quyên tại TP. Hồ Chí Minh(6) (3,3%) với cùng thời điểm và kỹ thuật real-time PCR xác định kiểu gen HBV.16,7% bệnh nhân không phát hiện được genotype do số lượng copies/ml HBV-DNA < 1000 copies/ml. Về đột biến kháng Lamivudine của HBV Lamivudine là 1 loại thuốc được sử dụng sớm nhất trong điều trị viêm gan B và kháng thuốc cao nhất, 15-30% sau một năm và tỉ lệ tăng dần theo thời gian, sau 5 năm là 70%. Trong đó đột biến quan trọng nhất là kiểu đột biến rt204V/I (tại vùng YMDD) do xúc tác vùng domain C của sao chép ngược HBV polymerase bởi sự thay thế valine, isoleucin cho methionin. Đột biến khác có thể xảy ra tiếp tục đó là đột biến L180M và A181T/V nằm ở vùng B. Các đột biến bù trừ có thể là L80V/I, I169T, V173L, T184S, Q215S. Đột biến M204I có thể tìm thấy đơn lẻ nhưng M204V lại thường liên kết với những thay đổi ở vùng A và B. Đột biến kháng Lamivudine có làm giảm độ nhạy của HBV đối với Lamividine từ 100 đến 1000 lần và thường có kháng chéo với các loại đồng phân L-nucleotide khác. Nghiên cứu của chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát 2 vị trí đột biến rt204V/I và rt180, kết quả nghiên cứu ghi nhận: Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine của HBV tại TP. Cần Thơ trong nghiên cứu của chúng tôi khá cao: 47,6%, cao hơn hẳn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước (34,9% - 14% và 17%)(7,11,12). Điều này đặt ra cho các bác sĩ lâm sàng một câu hỏi liệu bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại TP. Cần Thơ đã tuân thủ tốt phác đồ điều trị chưa? Hay có yếu tố nào thúc đẩy tình trạng kháng thuốc Lamivudine của HBV ở những bệnh nhân sống ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Để sáng tỏ vấn đề này chúng ta cần phải tiếp tục nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ dẫn đến tình trạng kháng thuốc Lamivudine của người dân vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các kiểu đột biến kháng Lamivudine Vị trí đột biến Hồ Tấn Đạt(4) Phạm Lệ Hoa(11) Chúng tôi rt204I 12,3% 21,9% rt204I + rt204V 24,7% 23,8% rt180 + rt204I + rt204I 0,8% 2,4% Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Lệ Hoa(11), trong tất cả các loại đột biến thì đột biến 2 điểm là phổ biến nhất rt204I + rt204V (24,75% và 23,8%). Đột biến ba điểm chiếm tỉ lệ thấp hơn (đột biến rt180 + rt204I + rt204V chỉ chiếm 0,8% trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt(4) và 2,4% trong nghiên cứu của chúng tôi) Các yếu tố liên quan đến đột biến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y tế Công cộng 199 Hiện tại qua khảo sát chúng tôi ghi nhận giới tính của bệnh nhân liên quan với đột biến kháng Lamivudine một cách không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Điều này cũng phù hợp với kết quả khảo sát của tác giả Phạm Lệ Hoa(11). Kiểu gen phổ biến của bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Cần Thơ là kiểu gen B và C và mối liên quan giữa đột biến với kiểu gen cần nghiên cứu thêm ở một cỡ mẫu lớn hơn và thời gian nghiên cứu lâu hơn để có được kết luận chính xác. KẾT LUẬN 1. Kiểu gen chiếm đa số trong mẫu nghiên cứu là kiểu gen B và C 71,5%, trong đó kiểu gen B chiếm 54,8% và kiểu gen C chiếm 16,7%. Kiểu gen phối hợp B-C chỉ chiếm 11,9%. 2. Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine của HBV trong mẫu nghiên cứu chiếm 46,7%, trong đó chiếm đa số là đột biến 2 điểm rt204V + rt204I (chiếm 23,8%) sau đố là đột biến 1 điểm rt204I (21,9%) và đột biến 3 điểm chiếm tỉ lệ thấp hơn 2,4%. 3. Không tìm thấy mối liên quan giữa giới tính, kiểu gen với tình trạng đột biến ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anna S. K. Lok and Brian J. McMahon (2004). Chronic Hepatitis B: Update of Recommendations. Hepatology, Vol 39, No. 3. 2. Bottecchia M, Souto FJ, O KM, Amendola M, Brandao CE, Niel C, Gomes SA (2008). Hepatitis B virus genotypes and resistance mutation in patients under long-term lamivudine therapy characterization of genotype G in Brazil. BMC Microbiol. Jan 22;8:11. 3. Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga, Phạm Hoàng Phiệt, Kenji Abe (2003). Kỹ thuật định týp gen siêu vi viêm gan B bằng multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mãn tính. Y học TP Hồ Chí Minh. Chuyên đề Y học cơ sở, tập 7, phụ bản số 1:145-150. 4. Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Nguyễn Thanh Tòng (2007). Xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của siêu vi viêm gan B bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Chuyên đề Nội khoa, tập 11, phụ bản của số 1, tr 153-158. 5. Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Bảo Toàn, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Duy Khánh, Cao Minh Nga, Vũ Thị Tường Vân (2009). Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR và realtime RT- PCR trong xác định kiểu gene của virus gây viêm gan siêu vi B và C. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tuyển tập Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc khu vực phía Nam năm 2009. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. Tr.: 382-386. 6. Lê Thị Đỗ Quyên (2010). Đặc điểm kiểu gen cả siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính. Luận văn Thạc sỹ Y học. Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 7. Libbrecht E, Doutreloigne J, Van De Velde H, Yuen MF, Lai CL, Shapiro F, Sablon E (2007). Evolution of primary and compensatory lamivudine resistance mutations in chronic hepatitis B virus – infected patients during long-term lamivudine treatment, assessed by a line probe assay. J Clin Microbio. 45 (12)3935-41. Epub 2007 Oct 3. 8. Masaadeh HA, Hayajneh WA, Alqudah EA (2008). Hepatitis B virus genotypes and lamivudine resistance mutation in Jordan. World J Gastroenterol. 2008 Dec 21; 14(47): pp 7231-4. 9. Nguyễn Hữu Chí (2009). Điều trị bệnh viêm gan siêu vi B mãn tính. Nhà xuất bản Y học. Tr.: 120-154. 10. Nguyễn Sử Minh Tuyết, Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2010). Phát hiện đột biến rtL180 và rtM204V/I kháng Lamivudine ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính bằng kỹ thuật Real-time PCR. Y Học thành phố Hồ Chí Minh. Hội nghị khoa học kỹ thuật Đại học Y Dược TP. HCM lần thứ 27 – 15/01/2010. Phụ bản của tập 14 * Số 1. Tr.: 508 – 512. 11. Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Hữu Chí, Cao Ngọc Nga, Nguyễn Thị Cẩm Hường, Phạm Hùng Vân (2008). Đặc tính kháng Lamivudine trên bệnh nhân viêm gan B mạn không đáp ứng với điều trị tại bệnh viện nhiệt đới. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Chuyên đề Hóa sinh và sinh học phân tử, tập 11, phụ bản * Số 3. Tr.: 38-46. 12. Sharon A, Chu CK (2008). Understanding the molecular basis of HBV drug resistance by molecular modeling. Antiviral Res. 2008 Dec; 80(3): 339-53. Epub Aug 31.