Đề tài Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên heo

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua luôn tận tình giảng dạy, giúp đỡ và động viên. - TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - ThS. Nguyễn Kim Dung cùng các anh chị thuộc phòng kiểm dịnh Vacxin, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ trong thời gian thực hiện đề tài tại viện. - Anh Lê Quốc Thắng đã tạo điều kiện cho chúng tôi bố trí thí nghiệm tại trại. - Các Thầy Cô bộ môn Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã tận tình giúp đỡ. - Bạn Châu Thanh Duy, anh Vũ Lại Xuân Hiệp cùng tập thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Chân thành cảm ơn. Tháng 8 năm 2005 Trƣơng Thị Thảo Uyên iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP- VT2eB TRÊN HEO” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên heo. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm. Sau đó thu kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phƣơng pháp: trung hòa độc tố trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là loại kháng nguyên an toàn với heo. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trƣớc khi thử nghiệm và không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh. - Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lƣợng kháng thể để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và trung hòa độc tố trên tế bào vero. v MỤC LỤC Tiêu đề ............................................................................................................ Trang Trang bìa .................................................................................................................. i Trang tựa ................................................................................................................. ii Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii Tóm tắt ................................................................................................................... iv Mục lục ................................................................................................................... v Danh sách các bảng ............................................................................................. viii Danh sách các hình ................................................................................................ ix 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................... 1 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU ........................................................................ 1 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 2 2.1 VACXIN ..................................................................................................... 2 2.1.1 Lịch sử ra đời vacxin ............................................................................ 2 2.1.2 Đáp ứng miễn dịch .............................................................................. 2 2.1.2.1Kháng nguyên ........................................................................... 2 2.1.2.2 Kháng thể ................................................................................. 3 2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch ...................................................... 4 2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch ......................... 7 2.1.3 Phân loại ....................................................................................................... 9 2.1.3.1 Vacxin sống .............................................................................. 9 2.1.2.2 Vacxin vô hoạt ....................................................................... 10 2.1.2.3 Vacxin phân tử ....................................................................... 10 2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e .............................................................. 12 2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB .................................................... 14 2.3 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY .................................................................. 14 2.3.1 Nguyên tắc .................................................................................................. 14 2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch ...................................................................................................................... 16 vi 2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO .............................................................................................................. 16 2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào Vero ...................................................................... 16 2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố .............................................. 17 2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc tố verotoxin trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero ...................................... 17 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................................ 18 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................... 18 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 18 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ........................................................................ 18 3.3.1 Sinh vật thí nghiệm ............................................................................ 18 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................... 18 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................ 19 3.4 PHƢƠNG PHÁP ...................................................................................... 20 3.4.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................ 20 3.4.2 Cách pha dịch tiêm ............................................................................. 20 3.4.3 Lấy máu .............................................................................................. 20 3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony ........................ 21 3.4.5 Xác định liều TCID50 ............................................................................................................... 22 3.4.5.1Chuẩn bị dịch độc tố ............................................................... 22 3.4.5.2Chuẩn bị tế bào vero ............................................................... 22 3.4.5.3Xác định liều TCID50 .............................................................................................. 23 3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố ................................................ 25 3.5 Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 26 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 27 4.1 CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA HEO SAU KHI TIÊM VACXIN ................. 27 4.2 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH ....................................................................... 27 4.2.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28 ..................................... 27 4.2.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB ........................................................ 28 4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN ......................................... 27 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY vii TẾ BÀO ......................................................................................................... 30 4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt .................... 30 4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt ................... 31 4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero .............. 33 4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid ........................................... 33 4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid ....................................... 33 4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt ........ 33 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 36 5.1 KẾT LUẬN ............................................................................................... 36 5.2 ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 36 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38 7.PHỤ LỤC ......................................................................................................... 39 Thành phần hóa chất ............................................................................................. 39 Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm ......................................... 41 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt ............ 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid, có bất hoạt 43 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG ........................................................................................................ TRANG Bảng 1. Tăng trọng của heo thí nghiệm trong thời gian thí nghiệm .................... 25 Bảng 2. Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn ............... 27 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid ................................ 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid .................... 43 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH .................................................................................................................... TRANG Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố ...................................................................... 28 Hình 2.1. Cấu trúc kháng thể .................................................................................. 3 Hình 2.2. Liên kết kháng nguyên- kháng thể ....................................................... 15 Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ ................................................ 26 Hình 4.2 Kết quả âm tính trên huyết thanh heo .................................................... 26 Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid ................................................... 33 Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố ............................................................. 33 Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm ........................................................ 33 Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm ......................................................... 33 1 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Độc tố verotoxin VT2e do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nƣớc ta. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị phù ở heo tuy có hiệu quả nhƣng gây ra nhiều triệu chứng phụ nhƣ rối loạn tiêu hoá, tạo ra các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh gây khó khăn cho những lần trị bệnh về sau. Do đó sử dụng vacxin để phòng bệnh phù do E. coli trên heo đƣợc xem là liệu pháp thích hợp nhất. Một số tác giả đã thử nghiệm vacxin nhƣợc độc, hoặc vacxin chết ...bƣớc đầu ghi nhận hiệu quả bảo vệ nhất định. Tuy vậy, các phản ứng phụ vẫn là những trở ngại lớn cho việc áp dụng rộng rãi những loại vacxin này. Vacxin tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách loại bỏ yếu tố gây bệnh của vi sinh vật mà vẫn giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên của chúng đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm nhằm khắc phục những nhƣợc điểm nói trên. Hiện nay, TS. Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra đƣợc E. coli mang gen mã hoá cho tiểu phần B của độc tố VT2e và tinh sạch đƣợc protein này. Từ thực tế đó, đƣợc sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên heo ”. 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU - Mục tiêu Đánh giá khả năng ứng dụng protein tái tổ hợp MPB-VT2e trong sản xuất vacxin phòng bệnh phù do E. coli trên heo. - Yêu cầu  Xây đựng thí nghiệm kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của MBP-VT2eB trên heo.  Định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch.  Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose) trên tế bào vero  Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2eB bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero. 2 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 VACXIN 2.1.1 Lịch sử ra đời vacxin Hiện nay vacxin đƣợc xem là một phƣơng pháp hữu hiệu để phòng bệnh trên ngƣời và động vật. Từ xa xƣa khi mà con ngƣời vẫn chƣa hiểu biết về hệ thống miễn dịch đặc hiệu thì ngƣời Trung Quốc đã biết sử dụng những vảy từ ngƣời bị bệnh đậu mùa để phòng bệnh này. Năm 1798, Edward Jenner đã quan sát thấy hiện tƣợng những ngƣời vắt sữa bò thƣờng tiếp xúc với những con bò bị đậu mùa thì không bị nhiễm bệnh đậu mùa. Từ đó ông sử dụng virus gây bệnh đậu mùa trên bò nhƣ một vacxin chống lại bệnh đậu mùa trên ngƣời. Sau này, ngƣời ta biết rằng đó là nhờ những protein trên bề mặt virus gây bệnh đậu mùa trên bò tƣơng tự nhƣ những protein có trên bề mặt của virus gây đậu mùa trên ngƣời. Và Pasteur là ngƣời đặt ra nền móng cho việc sử dụng vacxin khi khám phá ra nguyên lý: “Muốn phòng bệnh phải gây cho thú bệnh nhẹ”. Từ đó đến nay, ngƣời ta đã sản xuất ra nhiều loại vacxin phòng nhiều loại bệnh do vi khuẩn, virus, kí sinh trùng gây ra nhƣ: bệnh đậu mùa, bệnh lở mồm long móng, bệnh tả...với nhiều dạng tồn tại khác nhau. Nhƣng dù bất cứ dạng nào vacxin cũng mang một chức năng chung là tạo miễn dịch cho cơ thể ngƣời và động vật, phòng chống lại các loại bệnh truyền nhiễm và nhiều tác nhân gây hại khác [4]. 2.1.2 Đáp ứng miễn dịch 2.1.2.1 Kháng nguyên[4] a. Định nghĩa Kháng nguyên là một chất tự nhiên hay tổng hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch khi đƣợc đƣa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc là chất có khả năng phản ứng với một kháng thể hay một tế bào của hệ thống miễn dịch. Trên cấu trúc phân tử của kháng nguyên có sự hiện diện của các quyết định kháng nguyên gọi là epitope. b. Tính chất của kháng nguyên  Tính sinh miễn dịch: tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc vào: 3 3 Trọng lƣợng phân tử : kháng nguyên phải có trọng lƣợng phân tử đạt tối thiểu là 10.000Da. Tuy nhiên có một số chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ nhƣng có tính sinh miễn dịch vì chúng gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên hoàn chỉnh, ngƣợc lại một số chất có trọng lƣợng phân tử lớn nhƣng không có tính sinh miễn dịch. Lƣợng epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với các epitope cùng loài.  Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của kháng nguyên do những epitope quyết định. Các epitope là vị trí để kháng thể hay các lympho T mẫn cảm gắn với kháng nguyên một cách đặc hiệu. Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất nghiêm ngặt tuy nhiên đôi khi vẫn xảy ra hiện tƣợng hai kháng nguyên khác nhau có thể cho phản ứng chéo nhau. 2.1.2.2 Kháng thể[4] a. Định nghĩa Kháng thể (immunoglobin Ig) là protein dạng cầu đƣợc tổng hợp bởi tế bào lympho và tế bào plasma khi bị kích thích bởi kháng nguyên. Nó đƣợc tạo ra để giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố kháng nguyên có hại vào cơ thể. b. Cấu trúc tổng quát của kháng thể Phân tử immunoglobulin gồm một hay nhiều đơn vị hình thành, chúng có cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptit giống nhau từng đôi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng đƣợc nối với nhau bằng những cầu nối disulfua. Kháng thể đƣợc cấu tạo từ hai loại chuỗi polypeptit là chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đƣợc liên kết với nhau bằng các liên kết disulfide. Các chuỗi nhẹ bao gồm hai dạng κ, λ, hai dạng này chung cho tất cả các loại kháng thể. Các chuỗi nhẹ đều đƣợc cấu tạo từ hai phần:  Phần hằng định: kí hiệu CL (constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid amin tƣơng đối không đổi  Phần thay đổi: kí hiệu VL (variable) có tận cùng là –NH2. Trật tự acid amin trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá 4 4 thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu Vκ (cho type kappa) và Vλ (cho type lambda). [3] Có các kiểu chuỗi nặng nhƣ: µ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α, ε và dạng của chuỗi nặng sẽ qui định phân loại lớp nhƣ IgM, IgD, IgG, IgA, và IgE và dƣới lớp nhƣ IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 (5) . Các chuỗi nặng đƣợc cấu tạo từ hai vùng: vùng hằng định (CH) và vùng dễ biến đổi (VH), các vùng dễ biến đổi có khu vực tận cùng là N. Các vùng dễ biến đổi bao gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable) đƣợc tách biệt bằng các vùng bảo thủ hơn (framework regions) ở giữa. Những vùng này là những vùng liên kết với kháng nguyên hay còn gọi là paratop, vì vậy nó còn đƣợc gọi là vùng định tính bổ sung (complementarity-detemining regions) [15]. Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi H đựơc gọi là vùng khớp hay vùng bản lề đảm bảo cho tính mềm dẻo của các phân tử kháng thể đồng thời là hai cánh tay (VL, CL, VH, CH1) di động trong không gian. 2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch Khi cơ thể đã đƣợc miễn dịch thì khi tác nhân gây bệnh xâm nhập, chúng sẽ không thực hiện đựơc quá trình gây bệnh và nhanh chóng bị loại trừ khỏi cơ thể. Nhƣ vậy vacxin là yếu tố khởi phát của quá trình đáp ứng miễn dịch và kháng nguyên là thành phần cơ bản của vacxin. Khi đƣa vacxin vào cơ thể cũng có nghĩa là đƣa một loại kháng nguyên lạ vào cơ thể, kháng nguyên này sẽ kích thích cơ Hình 2.1. Cấu trúc kháng thể (Timothy G. Standish, 2003) 5 5 thể thú sản xuất ra một loại protein mới có chức năng bảo vệ và tham gia miễn dịch là kháng thể (antibody). Nhƣ vậy việc tiêm vacxin vào cơ thể thú chính là việc tập dƣợt cho cơ thể thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh khi chúng xâm nhập vào những lần sau đó. H