Đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của Cryptococcus neoformans đối với các thuốc kháng nấm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 70 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG IN VITRO CỦA CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM Nhữ Thị Hoa, Phạm Quốc Trung* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của các chủng C. neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm não-màng não đối với amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) và flucytosine (5-FU) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Phương pháp: thử nghiệm in vitro được tiến hành trên 107 loài C. neoformans được phân lập từ bệnh nhân và lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Học, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch. Phục hồi các loài C. neoformans trên môi trường SDA hoặc trên chuột bạch đã gây suy giảm miễn dịch và định danh kiểm tra bằng môi trường Staib-Ajello. Xác định bước sóng và ngưỡng OD tương đương 106 CFU/ml để định lượng dịch treo nấm bằng quang phổ kế. Môi trường Muller Hinton có bổ sung glucose và methylen blue được sử dụng trong đánh giá đáp ứng thuốc. Đường kính vòng sạch nấm được đo sau 2 ngày. Phân tích số liệu bằng phần mềm Stata 10.0. Kết quả: bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ nấm C. neoformans là 640nm; OD tương đương 106 CFU/ml là 0,06. Trong 107 mẫu được khảo sát, 8,4% thuộc var. gattii, 91,6% thuộc var. neoformans. Tỉ lệ C. neoformans nhạy với amphotericin B, fluconazol, flucytosine lần lượt là 76,6% , 71% , 0,9%; nhạy kém là 23,4%, 16,8% và 0%. Không ghi nhận trường hợp kháng amphotericin B, trong khi đó, 12,2% C. neoformans kháng fluconazol và 99% C. neoformans kháng flucytosine. Các chủng kháng tập trung ở nhóm var. neoformans. Chưa phát hiện mối liên quan giữa khả năng đáp ứng thuốc in vitro với chủng (variety) cũng như việc sử dụng fluconazol dự phòng. Kết luận và đề xuất: bước sóng 640nm (máy spectro SC) là bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ dịch treo nấm C. neoformans. Mức độ nhạy của C. neoformans đối với amphotericin B và fluconazol có khuynh hướng giảm. Cần tiến hành khảo sát MIC của các hoạt chất kháng nấm trên các chủng phân lập từ môi trường và bệnh nhân nhằm đưa ra kết luận chính xác và cụ thể hơn. Từ khóa: C. neoformans, bước sóng 640nm, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, tỉ lệ kháng, tỉ lệ nhạy. ABSTRACT IN VITRO SUSCEPTIBILITY OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TO ANTIFUNGALS Nhu Thi Hoa, Pham Quoc Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 70 - 75 Objectives: to assess in vitro susceptibility of C. neoformans isolated from meningo-encephalitic patients to amphotericin B, fluconazol, flucytosine by disk diffusion method. Method: in vitro susceptibility to amphotericin B, fluconazol, flucytosine of 107 C. neoformans isolates, preserved in 10% glycerine solution at Pham Ngoc Thach University of Medicine, was assessed by disk diffusion method. The strains were recovered by inoculating into SDA (Sabouraud dextrose agar) or intra-peritoneal injection to immunosuppressed mice and identified via Staib-Ajello culture. Optimal wavelength and OD Bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Hoc, trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: Ths. Nhữ Thị Hoa ĐT: 0903379566 Email: drnhuhoa@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 71 equivalent to 106 CFU/ml were determined for quantification of yeast cells suspension by spectrophotometry. Muller-Hinton media supplemented with glucose and methylen blue was used for assessing susceptibility of the yeast to antifungi. Diameter of antifungal zone was recorded after 48 hours. Data were analyzed with Stata10.0 Results: the optimal wavelength to defining the density of cryptococcal suspension is 640 nm, and OD being equivalent to 106 CFU/ml is 0.06. Among 107 isolates evaluated, there were 8.4% var. gattii, and 91.6% var. neoformans. In vitro susceptibility of C. neoformans to amphotericin B, fluconazol, and flucytosine are respectively: susceptible: 76.6%, 71% and 0.9%; intermediate: 23.4%, 16.8% and 0%. No resistant strains to amphotericin B were observed, but 99.07% and 12.15% of isolates were readily resistant to flucytosine and fluconazol respectively. Most of strains resisting to fluconazol and flucytosine belong to var. neoformans. No correlation between in vitro susceptibility and fungal variety, together with the prophylactic use of fluconazol were found. Conclusions and recommendations: wavelength of 640nm (Spectro SC apparatus) is optimal for determining density of cryptococcal suspension. In vitro susceptibility to fluconazol, amphotericine B tends to decline. It is really necessary to conduct research on amphotericin B, fluconazol and flucytosine MICs of isolates from environment and patients. Key words: C. neoformans, spectrophotometry, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, resistance, susceptibilty. ĐẶT VẤN ĐỀ C. neoformans là một trong những tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt trên cơ địa HIV/AIDS, do đó, kháng nấm dự phòng đã được khuyến cáo áp dụng trên các đối tượng nguy cơ cao. Ngoài ra trong điều trị, sau đợt tấn công, phác đồ kéo dài cũng được đòi hỏi để ngăn ngừa tái phát(2). Các phương pháp xử trí này có thể dẫn đến nguy cơ thay đổi ngưỡng đáp ứng của C. neoformans đối với thuốc kháng nấm(13, 15). Thật vậy, trước thập niên 90, ngưỡng MIC của fluconazol luôn ổn định(3). Sau đại dịch HIV/AIDS, nhiều tác giả ghi nhận tình trạng giảm tác dụng của fluconazol trên C. neoformans(7, 8, 13). Borann phát hiện ngưỡng MIC của fluconazol tăng dần từ năm 2000 đến năm 2002, và số trường hợp kháng fluconazol cũng tăng 5,6 lần: 2,5% trong năm đầu so với 14% vào năm thứ 2 (p<0,005)(13). Tương tự, nhiều trường hợp kháng amphotericin B cũng được khẳng định qua đánh giá in vitro: MIC của Amphotericin B từ 0,2µg/ml vào năm 1958 tăng lên 0,5 – 1µg/ml trong những năm gần đây(5, 18). Đặc biệt hiện tượng kháng chéo giữa amphotericin B và fluconazol đã được phát hiện trong một số C. neoformans gây bệnh trên người(6). Tại Việt Nam, trong khảo sát về viêm não- màng não do C. neoformans năm 2004, N.Q. Trung ghi nhận 12/15 trường hợp nhập viện lần 2 khi đang điều trị duy trì với fluconazol(12). N.L.H. Anh và L.G. Hiếu cũng trình bày 3 trường hợp tương tự vào năm 2009(11). Tuy nhiên, việc sử dụng các thuốc kháng retrovirus ở Việt Nam chưa bao phủ đều khắp các đối tượng HIV/AIDS. Như vậy, hiện tượng giảm đáp ứng của C. neoformans đối với các hoạt chất kháng nấm là thật sự hay chỉ là hậu quả của tình trạng suy giảm miễn dịch không được cải thiện của bệnh nhân? Trên cơ sở đó, khảo sát tác dụng in vitro của thuốc kháng nấm trên C. neoformans đã được tiến hành. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp khuếch tán trên thạch được sử dụng để khảo sát khả năng đáp ứng với amphotericin B, fluconazol, flucytosine của 107 loài C. neoformans được phân lập từ bệnh nhân viêm não-màng não và lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh Trùng – Vi Nấm Học, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. Phục hồi các loài bằng canh cấy SDA (sabouraud dextrose agar) hoặc cấy Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 72 trên chuột suy giảm miễn dịch. Định lượng nồng độ dịch treo nấm bằng quang phổ kế ở bước sóng 640nm. Bước sóng này được xác định thông qua việc khảo sát mức độ hấp thụ sóng cao nhất của C. neoformans (chủng quốc tế ATCC 76108, ATCC 28957) trong dãy sóng từ 600nm đến 700nm. Dịch treo nấm, sau khi đo quang, được hiệu chỉnh về 106 CFU/ml dựa vào công thức C1.V1=C2.V2. Cấy 0,5ml dịch treo nấm 106 CFU/ml vào môi trường Muller Hinton có bổ sung glucose và methylen blue. Đặt đĩa kháng nấm (Neostabs) vào canh cấy và ủ ở nhiệt độ phòng. Đường kính vòng kháng nấm được đo sau 2 – 3 ngày và phân loại mức độ nhạy cảm theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất Neostabs. Phân tích số liệu bằng Stata 10.0. KẾT QUẢ Bảng 1: Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu Đặc tính ( n=107) Tần Số Tỷ lệ % Thời điểm lấy mẫu Trước năm 2000 Sau năm 2008 16 91 14,9 85,1 Suy giảm miễn dịch Có HIV/AIDS (+) HIV/AIDS (–) Không 103 99 4 4 96,3 96,1 3,9 3,7 Uống fluconazol dự phòng Có Không 5 94 5,1 94,9 Chủng var. gattii var. neoformans 9 98 8,4 91,6 Đa số chủng thuộc var. neoformans, được phân lập sau năm 2008 từ cơ địa suy giảm miễn dịch, trong đó HIV/AIDS chiếm ưu thế, nhưng chỉ 5,1% có dự phòng nhiễm nấm cơ hội bằng fluconazol. Biểu đồ 1: Giá trị OD của các chủng C. neoformans quốc tế và bệnh nhân theo dãy bước sóng từ 600 – 700 nm. Theo biểu đồ 1, với bước sóng 640 nm, khả năng hấp thu sóng của C. neoformans cao nhất ở cả 2 chủng quốc tế và bệnh nhân. Bảng 2: giá trị OD tương ứng với nồng độ dịch treo các chủng nấm C. neoformans quốc tế. Nồng độ nấm OD MOD var. neoformans (ATCC 28957) Mẫu 1 Mẫu 2 1 x 10 6 1,3 x 106 0,059 0,065 0,06 2 var. gattii (ATCC 76108) Mẫu 1 Mẫu 2 0,9 x 10 6 1 x 106 ` 0,058 0,062 0,06 Ngưỡng OD trung bình tương ứng với 106 CFU/ml dịch treo tế bào C. neoformans là 0,06 Bảng 3: Tỉ lệ nhạy cảm của C. neoformans đối với các thuốc kháng nấm: Nhạy (n,%) Nhạy kém (n,%) Kháng (n,%) AMB 82(76,6) 25 (23,4) 0 FLU 76(71,0) 18 (16,8) 13 (12,2) 5-FU 1(0,9) 0 106(99,0) Tất cả các chủng đều nhạy với amphotericin B trong đó 23,4% nhạy kém. Ngược lại, hầu hết C. neoformans kháng với flucytosine và 12,2% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 73 kháng với fluconazol. Bảng 4: phân bố khả năng đáp ứng với thuốc kháng nấm theo chủng: Chủng Đáp ứng ( n, %) χ 2 (Fisher) Không * Có * AMB * gattii 2 (22,2) 7 (77,8) p = 1 neoformans 23 (23,5) 75 (76,5) FLU* gattii 0 9 (100) p>0,05 neoformans 31 (31,6) 67(68,4) *Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy. Sự đáp ứng in vitro với các thuốc kháng nấm tương tự ở cả 2 chủng. Bảng 5: khả năng đáp ứng với AMB phân bố theo thời gian và việc dùng FLU dự phòng Đáp ứng* (n, %) 2 (Fisher) Không Có Thời gian (năm 2000) Trước 5 (31,3) 11 (68,8) p > 0,5 Sau 20 (22,0) 71 (78,0) Dùng FLU dự phòng Không 23 (22,6) 79 (77,5) p > 0,3 Có 2 (40,0) 3 (60,0) * Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy. Chưa ghi nhận sự khác biệt về việc dùng FLU dự phòng và các chủng trước hoặc sau 2008 trong đáp ứng in vitro đối với AMB của C. neoformans. Bảng 6: khả năng đáp ứng với FLU phân bố theo thời điểm thu thập chủng và việc dùng FLU dự phòng: Đáp ứng * ( n, %) χ 2 (Fisher) Không Có Thời gian (năm 2008) Trước 2 (12,5) 14 (87,5) p > 0,1 Sau 29 (31,9) 62 (68,1) Dùng FLU dự phòng Không 28 (27,5) 74 (72,6) p >0,1 Có 3 (60,0) 2 (40,0) *Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy. Việc đáp ứng in vitro đối với fluconazol không phụ thuộc thời điểm phân lập các chủng nấm cũng như việc dùng fluconazol dự phòng. BÀN LUẬN Đặc điểm của mẫu nghiên cứu Tổng mẫu nghiên cứu bao gồm 107 loài Cryptococcus neoformans phân lập từ bệnh nhân, trong đó 96,1% từ cơ địa nhiễm HIV/AIDS, chủ yếu sau năm 2008, nhưng chỉ 5,1% trường hợp được điều trị dự phòng với fluconazol (Bảng 1), chứng tỏ việc dự phòng nhiễm nấm cơ hội ở bệnh nhân HIV/AIDS chưa được quan tâm đúng mức. Tình trạng này có thể bị tác động bởi các lý do như : 1) những khó khăn về kinh tế không cho phép bệnh nhân tuân thủ điều trị fluconazol dự phòng; 2) sự tương tác giữa fluconazol với các thuốc điều trị khác, như rifampicin; 3) nhiều đối tượng nguy cơ cao chỉ được phát hiện nhiễm HIV vào thời điểm chẩn đoán viêm não- màng não do vi nấm; 4) việc dự phòng fluconazol có thể dẫn đến kháng thuốc(9). Về phân bố chủng (variety), 91,6% C. neoformans thuộc var. neoformans (Bảng 1), phù hợp với đặc điểm sinh học của Cryptococcus neoformans: var. neoformans tấn công chủ yếu trên người suy giảm miễn dịch(9). Swinne so sánh trước và sau 1986, cho thấy tỉ lệ nhiễm C. neoformans var. neoformans gia tăng cùng với đại dịch HIV(13). Ngoài ra, sự phân bố các C. neoformans phân lập từ bệnh nhân ở các nước Đông Nam Á nói chung cũng nghiêng về var. neoformans(10, 13), do vậy, Việt Nam, một nước trong khu vực, ít nhiều sẽ mang dáng dấp của mô hình này. Hầu hết các chủng phân tích đều được lưu trữ từ năm 2008 (Bảng 1), các chủng trước 2008 chỉ bằng 1/6, vì vậy bản chất của sự thay đổi mức đáp ứng với thuốc kháng nấm theo thời gian, nếu tồn tại, có thể chưa được bộc lộ rõ trong khảo sát này. Xác định bước sóng và OD thích hợp trong việc định lượng nồng độ nấm thông qua phương pháp quang phổ kế Mật độ nấm là một trong những yếu tố có thể ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng in vitro của vi nấm đối với thuốc kháng nấm, do vậy cần đảm bảo chính xác số lượng tế bào nấm trong dịch treo thử nghiệm. Hiện nay có nhiều phương pháp xác định nồng độ dịch treo, trong đó định lượng bằng quang phổ kế ở bước sóng thích hợp là phổ biến nhất. Tuy nhiên, bước sóng tối ưu đối với C. neoformans chưa được đề cập trong các danh mục chuẩn nên việc xác định Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 74 bước sóng đã được tiến hành dựa trên mức độ hấp thu sóng ở một nồng độ nhất định của C. neoformans tại nhiều bước sóng khác nhau. Biểu đồ 1 cho thấy bước sóng 640nm cho giá trị OD cao nhất ở cả 2 chủng quốc tế: var. neoformans ATCC 28957 và var. gattii ATCC 76108. Đây là những chủng có bao nang dày rõ rệt. Ngược lại, bao nang của C. neoformans từ các bệnh nhân được phân lập trên canh cấy SDA thường trở nên mỏng hơn, thậm chí không thể nhìn thấy. Vì thế, C. neoformans phân lập từ bệnh nhân có bao nang mỏng được dùng để kiểm chứng và cho kết quả bước sóng tương tự. Qua đó chứng tỏ khả năng hấp thụ sóng của các loại tế bào hạt men Cryptococcus neoformans không bị ảnh hưởng bởi bao nang. Do vậy, bước sóng 640nm được sử dụng để định lượng nồng độ dịch treo tế bào C. neoformans trong nghiên cứu này, khác với bước sóng 625nm dùng cho vi nấm nói chung được ghi nhận trên y văn(15). Sự khác biệt này là tất yếu do khác biệt tùy loại máy quang phổ, loại Cuvet, loại vi nấm được sử dụng Sử dụng bước sóng 640nm để xác định OD ở nồng độ 106 CFU/ml dịch treo tế bào nấm, bảng 2 cho thấy: OD = [0,058 – 0,065] tương ứng với mật độ nấm dao động trong khoảng (0,9 – 1,3) x 106 CFU/ml. Bên cạnh đó, sự chênh lệch OD trung bình giữa 2 var. hầu như không tồn tại, 0,062 và 0,060. Vì vậy để thuận tiện cho việc tính toán, đo đạc, OD = 0,06 được chọn làm OD chuẩn, tương đương với nồng độ 106 CFU/ml dịch treo nấm cho cả var. neoformans và var. gattii. Đánh giá khả năng đáp ứng In vitro của C. neoformans đối với các thuốc kháng nấm Theo bảng 3, 76,6% C. neoformans nhạy với Amphotericin B, thấp hơn nghiên cứu của Espinel(4) (96,4%); tỉ lệ cao hơn kết quả của Gomez(5) (23,4% so với 5,8%). Sự khác biệt này không thể quy cho môi trường cấy khác nhau hoặc lượng nấm tiêm vào vì ở mỗi điều kiện đều được quy định ngưỡng đánh giá tương ứng. Những sai sót trong đo đạc vòng kháng nấm có thể xảy ra nhưng chỉ xuất hiện khi đường kính vòng ức chế mập mờ tại ranh giới của 2 phân lớp: nhạy– nhạy kém hoặc nhạy kém – kháng. Vì vậy, bảng 3 gợi ý một sự thay đổi về khả năng đáp ứng của C. neoformans đối với Amphotericin B .Những thử nghiệm về MIC cần được thực hiện trên các chủng phân lập trước, trong và tái phát sau điều trị để khẳng định hiện tượng này. Trong thử nghiệm đối với Fluconazol, tỉ lệ nhạy, nhạy kém và kháng lần lượt là 71%, 20,5% và 14%, khá tương đồng với nghiên cứu của Borann(13). Tuy nhiên tỉ lệ nhạy kém lại thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của Aller, 55% (1) và Koletar, 20%(8). Nhiều khảo sát về MIC cũng ghi nhận khuynh hướng tăng dần đối với Fluconazol so với trước đại dịch AIDS. Tuy nhiên mức độ đáp ứng thay đổi tùy thuộc vào thời gian sử dụng Fluconazol nên kết quả thay đổi theo từng báo cáo. Xét tính đáp ứng của các chủng đối với hoạt chất kháng nấm, bảng 4 chưa thể hiện sự khác biệt, tương tự báo cáo của George(15). Tuy nhiên Gomez(5), T.T.H.Chau(17) phát hiện var. gattii đáp ứng với amphotericin B tốt hơn var. neoformans, nhưng không khác biệt đối với fluconazole. Theo Luciana, amphotericin B tác dụng như nhau trên cả 2 var. nhưng var. gattii kém nhạy với fluconazol hơn(18). Lý do có thể bắt nguồn từ cỡ mẫu giữa 2 chủng: hoặc tập trung chủ yếu vào var. neoformans trong số liệu của George, Gomez, T.T.H. Châu và khảo sát hiện tại; hoặc lệch về phía var. gattii trong đánh giá của Luciana. Do đó, để khẳng định, cần có một nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và cân đối hơn giữa hai chủng. Xét về thời điểm thu thập mẫu, không tìm thấy sự thay đổi về khả năng đáp ứng In vitro của C. neoformans theo thời gian (bảng 5, bảng 6). Nguyên nhân có thể do mầm bệnh không phát tán vào môi trường và không lan truyền một cách tự nhiên từ người sang người qua đường không khí cũng như qua các chất tiết, chất thải, do đó sự đột biến gây kháng thuốc của tế bào nấm, cũng ít cơ hội được “di truyền”. Vì thế, hiện tượng kháng thuốc hoặc kém nhạy của một Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 75 chủng C. neoformans nhiều khả năng được hình thành ngay trong thời gian tồn tại trên cơ thể của chính bệnh nhân bị nhiễm. Về việc sử dụng fluconazol dự phòng, mặc dù hiện tượng kháng chéo thường xảy ra giữa các hoạt chất trong cùng nhóm, nhưng từ năm 1995, Joseph-Horne đã phát hiện khả năng kháng chéo giữa amphotericin B và fluconazole trên một số chủng C. neoformans gây bệnh trên người(6). Tuy nhiên, bảng 5 và 6 chưa ghi nhận được mối liên hệ giữa việc dùng fluconazol dự phòng và mức độ đáp ứng in vitro của C. neoformans đối với amphotericin B, thậm chí cả fluconazol. Có lẽ cỡ mẫu đã che dấu bản chất của vấn đề: chỉ 5/107 trường hợp được ghi nhận đã phòng ngừa nhiễm nấm cơ hội bằng fluconazol. Do vậy, để nhận định chính xác hơn về vấn đề này cần một nghiên cứu khác với cỡ mẫu phù hợp hơn. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Bước sóng 640 nm thích hợp cho việc định lượng nồng độ dịch treo nấm C. neoformans trên dòng máy spectro SC. C. neoformans kháng mạnh với flucytosine và có khuynh hướng giảm đáp ứng với fluconazol và amphotericin B. Chưa tìm thấy sự khác biệt về đáp ứng in vitro giữa var. neoformans và var. gattii đối với các thuốc kháng nấm. Khảo sát MIC của các chủng C. neoformans phân lập từ bệnh nhân và môi trường thiên nhiên nên được tiến hành với cỡ mẫu phù hợp để đánh giá chính xác sự thay đổi khả năng đáp ứng, nếu có, của C. neoformans đối với các hoạt chất kháng nấm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aller AI, Lozano F (2000). Correlation of fluconazole MICs with clinical outcome in cryptococcal Infection. Antimicrob agents Chemother, 44(6):1544 - 8 2. CDC (2009). Guidelines for prevention and treatment of opportunistic infections in HIV-infected adults and adolescents. March 24, Vol.58: 48-50. 3. Davey KG, Johnson EM , Holmes AD (1998). In vitro susceptibility of C. neoformans isolates to fluconazole and itraconazole. Antimicrob Chemother, 42:217 - 20. 4. Espinel-Ingroff A, Gibbs D, and Wang A (2007). Correlation of Neo-Sensitabs tablet diffusion assay results on three different agar media with CLSI broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp. and C. neoformans to amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole, and voriconazole. Journal of clinical microbiology, 45(3):858 - 64 5. Gomez-Lopez A, Dos M , Martins A, Melhem MC, Rodriguez- Tudela JL, and Cuenca-Estrella M (2008). In vitro susceptibility of Cryptococcus gattii clini