Khảo sát đáp ứng kháng thể ở chuột nhiễm Angiostrongylus Cantonensis bằng kỹ thuật ELISA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 30 KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ Ở CHUỘT NHIỄM ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS BẰNG KỸ THUẬT ELISA Lê Thị Xuân*, Trần Thị Huệ Vân*, Phạm Thị Lệ Hoa**, Lê Kim Ngọc Giao***, Trần Quang Bính****, Nguyễn Trần Chính** TÓM TẮT Đặt vấn đề: đáp ứng kháng thể ở chuột nhiễm Angiostrongylus cantonensis đã được khảo sát trong phòng thí nghiệm bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, cho thấy đáp ứng kháng thể bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật thử nghiệm và loại kháng nguyên sử dụng. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mô tả thời gian xuất hiện, diễn biến và đáp ứng kháng thể ở chuột nhiễm Angiostrongylus cantonensis với 2 liều khác nhau (50 ấu trùng/chuột và 100 ấu trùng/chuột). Phương pháp: nghiên cứu mô tả thực nghiệm. Sau gây nhiễm cho 2 lô chuột, kháng thể được đo lường bằng thử nghiệm ELISA gián tiếp, đánh giá mỗi tuần sau nhiễm có so sánh với các giai đoạn phát triển của giun trong chuột. Kết quả: kháng thể tìm được trong máu chuột từ tuần thứ 4 sau nhiễm, tăng lên đến đỉnh vào tuần thứ 7 và duy trì đến cuối kỳ thực nghiệm (20 tuần). Kháng thể tăng cao hơn ở lô chuột được gây nhiễm với liều ấu trùng cao hơn. Kết luận: có thể theo dõi diễn biến đáp ứng kháng thể trên chuột bị nhiễm Angiostrongylus cantonensis bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Đáp ứng kháng thể tỷ lệ thuận với liều gây nhiễm và thời gian nhiễm. Từ khóa: đáp ứng miễn dịch, Angiostrongylus cantonensis, chuột cống, ELISA ABSTRACT ANTIBODY RESPONSES IN RATS INFECTED WITH ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS BY ELISA TEST Tran Thi Hue Van, Le Thi Xuan, Pham Thi Le Hoa, Le Kim Ngoc Giao, Tran Quan Binh, Nguyen Tran Chinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 30 - 36 Background: Antibody responses in Angiostrongylus cantonensis infected rats had been investigated in laboratory condition by different methods. From these studies the values of the immune responses were affected by methods and antigens used in the test. This study aimed at described the dynamic evolution of immune response to two different infected doses. Methods: Experimental study in laboratory condition. Two groups of rats were infected by two different doses (50 larvaes and 100 larvae per rat). Antibody was detected by ELISA every week and was compared with the existence of parasite in different stages in the life cycle of Angiostrongylus cantonensis in rats. Results: Antibody were detected from the 4th week, reached the peak at 7th week postinfection and was still detected with stable titer until the end of the study (20th week). Conclusion: The antibody responses to A. cantonensis could be monitored in rats model by indirect ELISA  Bộ môn Ký sinh trùng, khoa Y, Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh  Bộ môn Nhiễm, khoa Y, Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh  Bộ môn Vi sinh , khoa Y, Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh  Khoa Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Chợ Rẫy Tp.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Lê Thị Xuân ĐT: 0913602355 Email: lexuan07@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 31 test. The antibody increased with time after infection during the first seven weeks. The higher infected dose, the higher immunologic response. Key words: immunologic response, Angiostrongylus cantonensis, rat, ELISA MỞ ĐẦU Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis), giun ký sinh ở phổi chuột, là tác nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm màng não tăng bạch cầu toan tính (BCTT) hoặc viêm não-màng não tăng BCTT ở người trên thế giới. Chuột cống, ký chủ vĩnh viễn của A. cantonensis, bị nhiễm khi ăn ốc chứa ấu trùng giai đoạn 3 (AT3). Khi vào đến dạ dày-ruột, AT3 đi vào mạch máu, theo máu lên não. Ở não, ấu trùng lột xác 2 lần trở thành ấu trùng giai đoạn 5. Sau đó, giun non theo máu trở về tim và định cư trong động mạch phổi. Giun trưởng thành, đẻ trứng và ấu trùng 1 nở trong phổi chuột và di chuyển lên khí quản, xuống ruột và được thải ra ngoài theo phân và nhiễm trở lại ốc. Người là ký chủ tình cờ, ăn phải AT3 trong ốc sống hoặc trong rau bị nhiễm. Ở người, chu trình phát triển của giun cũng tương tự như ở chuột, tuy nhiên thường ấu trùng bị giữ lại ở hệ thần kinh và không thể trở về tim, phổi để trưởng thành. Vì vậy, bệnh do A. cantonensis ở người biểu hiện ở giai đoạn cấp tính bằng hội chứng viêm não - màng não, kèm theo tăng bạch toan tính trong dịch não tủy và máu, thường nhẹ đến trung bình, hiếm khi nặng và có tính tự giới hạn, sau giai đoạn viêm màng não cấp, bệnh tự lui. Chẩn đoán xác định là tìm được giun non hoặc ấu trùng trong dịch não tủy của bệnh nhân. Mặc dù có nhiều ca nhiễm, nhưng chỉ một số rất ít tìm được giun trong dịch não tủy. Vì vậy, chẩn đoán chủ yếu là dựa trên triệu chứng lâm sàng và tiền sử ăn uống cũng như các kết quả xét nghiệm. Khó khăn trong việc chẩn đoán xác định là một lý do để các kỹ thuật miễn dịch có một vai trò quan trọng để xác định trường hợp nhiễm bệnh. Hiệu giá kháng thể tăng có thể là bằng chứng của một bệnh nhiễm mới và cũng là một bệnh đang có. Thử nghiệm huyết thanh phát hiện kháng thể bây giờ đã được chấp nhận rộng rãi là một công cụ chẩn đoán thích hợp nhất. Bệnh do A. cantonensis có tính cách cấp tính, không kéo dài, vì vậy, biết được thời điểm kháng thể xuất hiện trong máu/dịch não tủy của bệnh nhân sau khi bị nhiễm có thể giúp chúng ta lấy bệnh phẩm làm xét nghiệm đúng lúc và theo dõi diễn tiến của bệnh. Trong khi chờ đợi tiến hành khảo sát biến động kháng thể ở người bị nhiễm A. cantonensis, chúng tôi thực hiện nghiên cứu dùng mô hình thực nghiệm để tìm hiểu biến động kháng thể ở chuột bị nhiễm A. cantonensis trong phòng thí nghiệm. Đáp ứng kháng thể ở chuột đối với nhiễm Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis) có thể được chứng minh ở chuột bị nhiễm tự nhiên hay ở chuột được gây nhiễm thực nghiệm(14). Từ trước đến nay đã có nhiều kỹ thuật để phát hiện kháng thể ở chuột bị nhiễm A. cantonensis: khuyếch tán trong thạch (AGD), miễn dịch đối lưu (CIEP), ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và miễn dịch hấp phụ men (ELISA). Cross và Chen dùng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể dùng và nhận thấy tất cả các ca nhiễm A. cantonensis được xác nhận và nghi ngờ đều có giá trị OD cao hơn những ca chứng(2, 3) Công trình nghiên cứu này mô tả động học của kháng thể trong máu của chuột bị nhiễm A. cantonensis bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thiết kế Mô tả thực nghiệm, hàng loạt ca. Dụng cụ và hoá chất Pepsin bột (Merck), Acid hydrocloric (Merck), Ether, dung dịch NaCl 0,85%. Bình nến, bồn ủ, ống thông dạ dày, kim tiêm 1ml, dụng cụ Baermann (giá đỡ, rây lưới, gạc, phễu được nối với ống cao su, kẹp, bình Becher). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 32 Vật liệu Ốc Biomphalaria glabrata được nuôi dưỡng trong phòng thí nghiệm. Ấu trùng giai đoạn 3 (AT3) A. cantonensis được thu hồi từ ốc bằng kỹ thuật tiêu mô trong 1% HCl-pepsin và kỹ thuật Baermann. - Chuột cống trắng Wistar, từ 6-8 tuần tuổi, được xét nghiệm phân tìm ký sinh trùng ruột. Những chuột có kết quả phân âm tính sẽ được đưa vào thí nghiệm. 90 chuột được chia làm 2 nhóm: -Lô 1: chuột 45 con, 3 chuột làm chứng âm, 42 chuột được gây nhiễm với 50AT3/chuột -Lô 2; : chuột 45 con, 3 chuột làm chứng âm, 42 chuột được gây nhiễm với 100AT3/chuột Huyết thanh Chứng âm: máu lấy từ 3 chuột khỏe mạnh, xét nghiệm phân không phát hiện KST đường ruột. Xét nghiệm máu không phát hiện nhiễm KST trong máu. Chứng dương: máu lấy từ 3 chuột được gây nhiễm với 100AT/con vào tuần thứ 20 sau nhiễm. Mẫu nghiên cứu: máu của chuột được gây nhiễm với liều 50 AT/chuột và 100 AT/chuột, thu thập định kỳ mỗi tuần từ tuần thứ 1 cho đến tuần thứ 20 sau nhiễm. Máu lấy từ chuột khỏe mạnh và chuột bị nhiễm A.cantonensis được ly tâm, tách huyết thanh, cất ở -70ºC đến khi dùng. Phương pháp Gây nhiễm chuột Gây mê chuột bằng ether. Dùng ống tiêm 1 ml gắn với ống thông dạ dày bơm ấu trùng vào dạ dày chuột. Theo dõi sức khỏe của chuột trong suốt thời gian từ lúc gây nhiễm đến cuối kỳ thực nghiệm. Chuột bị giết hàng tuần ở các thời điểm tuần thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 12, 16 và 20 sau khi gây nhiễm. Dùng ống tiêm để rút máu từ tim. Não, phổi và tim được lấy ra quan sát tìm giun. Giun được định danh dựa vào hình thái học bằng kính hiển vi quang học. Đáp ứng miễn dịch của chuột sau khi được gây nhiễm A. cantonensis sẽ được khảo sát bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp, phát hiện kháng thể trong máu chuột. Thử nghiệm ELISA gián tiếp Kháng nguyên pha trong đệm Carbonate- bicarbonate 0,05M, pH 9,6, nhỏ 100 µl vào các giếng, ủ ở 37ºC trong 1 giờ và để qua đêm ở 4ºC. Rửa phiến nhựa với dung dịch rửa ( PBS-Tween 20) 3 lần. Khóa giếng với 150 µl BSA 1%, ủ ở 37ºC trong 1 giờ. Rửa 3 lần với dung dịch rửa. Cho 100 µl huyết thanh chứng âm và dương và mẫu thử đã pha loãng vào giếng và ủ ở 37ºC trong 1 giờ. Rửa 5 lần với dung dịch rửa. Cho vào mỗi giếng 100 µl cộng hợp ( KPL), ủ ở 37ºC trong 1 giờ. Rửa 5 lần với dung dịch rửa. Cho 100 µl cơ chất TMB (Sigma) vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng từ 15 -20 phút. Ngưng phản ứng bằng H2SO4 2M. Đọc kết quả bằng máy đọc Multiskan ở bước sóng 450 nm. Mỗi mẫu được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. KẾT QUẢ Thời điểm giun có mặt tại các cơ quan Kết quả được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Thời điểm phát hiện giun ở chuột bị nhiễm A. cantonensis Thời điểm (tuần) Cơ quan quan sát tìm giun Liều nhiễm 50AT/ chuột Liều nhiễm 100AT/ chuột Số giun/chuột n (%) Số giun/chuột n (%) Não Tim Phổi Phân Não Tim Phổi Phân 1 tuần + 0 - + 0 - 2 + 0 - + 0 - 3 + 0 - + 0 - 4 + 6 (12) - + 25 (25) - 5 - 27 (54) - - 34 (34) - 6 - 42 (84) + - 67 (67) + 7 - 35 (70) + - 58 (58) + 8 - 40 (80) + - 47 (47) + 9 - 42 (84) + - 66 (66) + 10 - 39 (78) + - 53 (53) + 11 - 32 (64) + - 42 (42) + 12 - 41 (82) + - 46 (46) + 16 - 38 (76) + - 43 (43) + Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 33 Thời điểm (tuần) Cơ quan quan sát tìm giun Liều nhiễm 50AT/ chuột Liều nhiễm 100AT/ chuột Số giun/chuột n (%) Số giun/chuột n (%) Não Tim Phổi Phân Não Tim Phổi Phân 20 - 41 (82) + - 49 (49) + Kết quả thử nghiệm ELISA với huyết thanh chuột Kết quả thử nghiệm ELISA được trình bày trong bảng 2. Các giá trị được thể hiện bằng đơn vị mật độ quang (OD), đánh giá theo tỷ lệ Voller và cs. (1979) được tính từ các giá trị OD đo được từ các mẫu huyết thanh chuột khỏe mạnh và chuột bị nhiễm giun. Bảng 2: Diễn biến kháng thể kháng A. cantonensis trong huyết thanh chuột bị nhiễm Thời điểm ELISA Huyết thanh (OD) Liều 50AT/chuột Liều 100AT/chuột OD Tỷ lệ Voller Mẫu/Chứng âm OD Tỷ lệ Voller Mẫu/Chứng âm Chứng âm 0,223 1,0 0,231 1,0 1 tuần 0,229 1,0 0,236 1,0 2 0,269 1,2 0,323 1,4 3 0,328 1,5 0,454 2,0 4 0,427 1,9 0,669 2,9 5 0,526 2,4 0,855 3,7 6 0,668 3,0 0,901 3,9 7 0,740 3,3 0,993 4,3 8 0,791 3,5 1,016 4,4 9 0,805 3,6 1,108 4,8 10 0,813 3,6 1,086 4,7 11 0,762 3,4 1,068 4,6 12 0,784 3,5 1,086 4,7 16 0,778 3,4 1,040 4,5 20 0,802 3,5 1,062 4,6 So sánh biến động kháng thể theo thời gian (tuần) của 2 lô chuột từ tuần 1 đến tuần 20 sau nhiễm được trình bày trong biểu đồ 1. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 20 22 24 50 ch 100 ch Biểu đồ 1: Biến động kháng thể (OD) theo thời gian nhiễm (tuần) của 2 lô chuột. BÀN LUẬN Về thời điểm giun xuất hiện ở não và tim- phổi Theo chu trình phát triển của A. cantonensis được đề cập trong y văn và kết quả khảo sát của những tác giả khác thì sau nhiễm giun, ấu trùng xuất hiện rất sớm ở não nhưng di chuyển khỏi não sau 4 tuần để sinh trưởng ở động mạch phổi, tim, phổi và được thải ra môi trường ngoài theo phân sau 6 tuần(12, 15). Tác giả Bhopale và cs còn nhận thấy số lượng giun ở não tăng cao nhất ở tuẩn thứ 3 (ngày 21) ở tất cả các liều nhiễm 15AT, 100AT, 500AT, 2000AT, 5000AT, 10000AT(1). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với những đề cập nói trên. Ngoài ra, qua khảo sát chúng tôi nhận định là thời điểm xuất hiện và các giai đoạn phát triển của giun ở các cơ quan Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 34 như trên không khác nhau với liều gây nhiễm cao hay thấp. Ấu trùng giai đoạn 3 đã xuất hiện ở não chuột ngay tuần đầu sau khi xâm nhập vào chuột. Chúng tiếp tục tập trung lên não cao nhất vào tuần thứ 3 và phát triển thành giun non ở não vào tuần thứ 4. Cũng vào tuần thứ 4, một số giun bắt đầu trở về tim phổi vào khoảng ngày 28-31, đến tuần thứ 5, không còn thấy giun ở não. Từ tuần thứ 4, giun trở về ký sinh tại động mạch phổi, trưởng thành và đẻ trứng. Trứng bắt đầu xuất hiện trong phân chuột từ tuần thứ 6 sau nhiễm (bảng 1). Về thời điểm xuất hiện kháng thể Ở chuột gây nhiễm với liều 50 AT/chuột, OD đo được ở tuần thứ 1, 2 sau nhiễm chưa có khác biệt so với OD đo được trước khi chuột được gây nhiễm cho thấy chưa có đáp ứng kháng thể trong 3 tuần đầu. Từ tuần thứ 4, kháng thể bắt đầu tăng dần, cao đáng kể từ tuần thứ 5, đạt đỉnh vào tuần thứ 7 và duy trì cho đến cuối kỳ thí nghiệm, tuần thứ 20. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Chen và cs khi gây nhiễm liều 100AT gây được đáp ứng kháng thể phát hiện bằng kỹ thuật ELISA từ tuần thứ 3 sau nhiễm(2). Kamiya và Tanaka cũng nhận thấy rằng sự xuất hiện của kháng thể phát hiện được trùng hợp với sự xuất hiện của AT trong phân(7). Trong nghiên cứu, ở lô chuột được gây nhiễm với liều 100AT/chuột, kết quả OD đo được cũng tương tự như ở lô chuột gây nhiễm với liều 50 AT/chuột về thời điểm xuất hiện cũng như biến động của kháng thể trong huyết thanh chuột. Yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể ở chuột bị gây nhiễm A. cantonensis Liều gây nhiễm Bhopale và cs gây nhiễm cho các lô chuột với liều ấu trùng khác nhau từ 15 AT/chuột, 100 AT/chuột, 500 AT/chuột, 2000 AT/chuột, 5000 AT/chuột và 10000 AT/chuột(1). Khi dùng kỹ thuật miễn dịch điện di đối lưu (CIEP) để phát hiện kháng thể, tác giả nhận thấy kháng thể xuất hiện vào ngày 21 sau nhiễm ở tất cả các lô chuột, trừ lô chuột được gây nhiễm với liều 15 AT/chuột. Yoshimura và cs. dùng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động (IHA) đã phát hiện được kháng thể ở chuột nhiễm A. cantonensis với liều trung bình 77 AT/chuột , IHA dương tính ở mức thấp từ tuần thứ 5 và tiếp tục tăng sau đó(13). Yong WK và Dobson cũng dùng kỹ thuật IHA để phát hiện kháng thể ở 3 lô chuột bị nhiễm A. cantonensis với các liều khác nhau (thấp 10-30 AT, trung bình 40-50 AT và cao 100-150 AT) cũng phát hiện được kháng thể IHA vào ngày thứ 12 sau nhiễm, sau đó tăng nhanh đến đỉnh vào tuần thứ 5 và duy trì ít nhất đến 4 tuần sau. Nhóm tác giả này cũng chứng minh có tương quan giữa hiệu giá kháng thể và liều gây nhiễm từ tuần thứ 14(11). Khi so sánh các giá trị của OD ở 2 lô chuột trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các giá trị OD khác nhau khi đo cùng thời điểm. Ở lô gây nhiễm với liều 100AT/chuột, trị số OD cao hơn trị số của OD trong lô chuột bị nhiễm 50AT/chuột (bảng 2) rất rõ rệt. Giá trị OD gấp 2 so với chứng ghi nhận được ở tuần thứ 4 ở lô gây nhiễm với liều thấp, nhưng đã đạt hiệu giá OD gấp 2 lần từ tuần thứ 3 với liều gây nhiễm 100AT/chuột. Kanbara và cs. cũng có nhận xét tương tự khi gây nhiễm cho 2 lô chuột với liều 150AT/chuột và 50AT/chuột và tác giả cũng đã kết luận kháng thể xuất hiện sớm hơn trong lô chuột được gây nhiễm với liều cao (150/chuột) (ngày 20 sau nhiễm) so với trong lô chuột nhiễm liều thấp (ngày 30 sau nhiễm)(9). Vì vậy, có thể nhận định rằng đáp ứng miễn dịch thể dịch đối với nhiễm A. cantonensis ở chuột tỷ lệ thuận với số lượng AT gây nhiễm. Thời gian nhiễm ký sinh trùng Thời điểm kháng thể được phát hiện trong máu chuột mhiễm A. cantonensis có thể sớm hay muộn tùy thuộc vào kỹ thuật thử nghiệm và kháng nguyên được làm từ ấu trùng hay giun trưởng thành. Kỹ thuật kết tủa có thể phát hiện được kháng thể 1 tuần sau nhiễm, kỹ thuật ngưng kết hồng cầu chỉ phát hiện được kháng thể 5 tuần sau nhiễm(2, 4, 6, 7, 13, 14). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 35 Chen dùng kỹ thuật ELISA với nhiều loại kháng nguyên làm từ các giai đoạn phát triển khác nhau của giun, đã phát hiện kháng thể ở chuột từ tuần thứ 3 tới tuần thứ 26 sau khi nhiễm và kết luận là kháng nguyên làm từ giun trưởng thành tốt hơn kháng nguyên khác(2). Với kỹ thuật ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và kháng nguyên làm từ giun trưởng thành, Yong và Dobson phát hiện kháng thể đầu tiên vào ngày 35 khi giun non di chuyển về phổi và cho rằng kết quả này có thể do dùng kháng nguyên làm từ giun trưởng thành(11). Dharmkrong và cs. ghi nhận được kết quả tương tự nhưng sớm hơn vào ngày thứ 14 khi họ dùng kháng nguyên làm từ ấu trùng(4). Theo Yong và Dobson, kháng nguyên làm từ giun trưởng thành chỉ phát hiện được kháng thể khi giun tới phổi(11). Kháng thể kháng AT biến mất khi phản ứng kháng thể chống kháng nguyên giun trưởng thành được phát hiện. Đáp ứng miễn dịch có tính đặc hiệu giai đoạn phát triển. Vấn đề được đặt ra có chăng sự khác biệt về cấu tạo giữa kháng nguyên làm từ ấu trùng và kháng nguyên làm từ giun trưởng thành. Dhamkrong-At và Sirisinha chứng minh các polypeptide có trong lượng phân tử 80 000, 39 500 và 22 000 có mặt trong nhiều giai đoạn phát triển của giun và có tính kháng nguyên(5). Năm 2005, Li và cs. đã dùng kỹ thuật điện di và dấu thấm miễn dịch (SDS-PAGE và Immunoblot) để phân tích kháng nguyên làm từ các giai đoạn phát triển khác nhau của A.cantonenesis. Tác gỉa đã kết luận các băng protein đều giống nhau ở các giai đoạn phát triển khác nhau(11). Kết quả của chúng tôi và các tác giả trên đều cho thấy đáp ứng kháng thể ở chuột bị nhiễm A. cantonensis tỷ lệ thuận với thời gian gây nhiễm. Tuần thứ 1 đến tuần thứ 3 sau nhiễm là thời gian chúng tôi chỉ mới tìm thấy ấu trùng ở não, giá trị OD đo được chưa có sự thay đổi có ý nghĩa khi so với chứng âm, đồng nghĩa với kháng thể chưa xuất hiện trong máu. Tuy vậy, cũng có thể OD chưa cao do kháng thể đã bắt đầu có nhưng ở mức thấp dưới khả năng phát hiện của phản ứng ELISA bởi vì các kỹ thuật khác như kỹ thuật kết tủa đã có thể tìm thấy kháng thể 1 tuần sau gây nhiễm. Mặt khác, giun ở não giai đoạn này chỉ là ấu trùng nên chưa có tính sinh kháng nguyên mạnh, vì vậy chưa gây được đáp ứng miễn dịch đáng kể. Từ tuần thứ 4 trở đi cũng là lúc giun đã trưởng thành và di chuyển từ não xuống đến ruột. Chúng tôi cũng ghi nhận được giá trị lúc đó OD và tỷ lệ Voller tăng ngày càng cao hơn, chứng tỏ kháng thể đã hiện diện đủ mạnh và ngày càng nhiều để có thể phát hiện được. Điều này còn có thể do giun trưởng thành có tính kháng nguyên mạnh hơn và ổn định trong thời lâu dài. Trở lại với trường hợp nhiễm A. cantonensis ở người, theo y văn thế giới, giun chỉ đến được não và không trở về phổi nên không trưởng thành được. Đáp ứng miễn dịch dịch thể ở người như thế nào, có giống như ở chuột? Đây là một câu hỏi còn để ngõ, cần có những nghiên cứu để làm rõ diễn biến động học kháng thể kháng A. cantonensis ở người. KẾT LUẬN Kỹ thuật ELISA có thể phát hiện được kháng thể chống Angiostrongylus cantonensis trong huyết thanh chuột từ tuần thứ 4 sau nhiễm. Hiệu giá kháng thể tính bằng đơn vị OD hay tỷ lệ Voller tăng đến đỉnh vào tuần thứ 7 sau gây nhiễm và tồn tại với hiệu giá cao cho đến hết