Khảo sát đột biến gen BCR/ABL kháng mạnh với imatinib bằng kỹ thuật ASO‐PCR tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  200 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL KHÁNG MẠNH VỚI IMATINIB  BẰNG KỸ THUẬT ASO‐PCR TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC  Phạm Thị Mỹ Hạnh*, Phan Thị Xinh**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V,  T315I của tổ hợp gen BCR/ABL gây kháng mạnh với imatinib (IM) trên bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy  (BCMDT).  Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên 30 mẫu tủy xương của BN BCMDT kháng IM tại  Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 01/2012 đến 05/2013 có chỉ định tìm đột biến BCR‐ABL kháng IM  bằng kỹ thuật giải trình tự DNA. Đồng thời, xây dựng điều kiện kỹ thuật ASO‐PCR với 6 cặp mồi chuyên biệt  của 6 kiểu đột biến và chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho từng cặp mồi để khảo sát đột biến cho 30 mẫu BN trên.  Kết quả: Sau khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp mồi chuyên biệt, chúng tôi đã xác định được nhiệt  độ  tối ưu cho phản ứng ASO‐PCR  đối với 6 kiểu  đột biến gen BCR/ABL kháng mạnh với  IM  là G250E và  Y253H ở 650C, Y253F ở 550C, E255K và E255V ở 680C, và T315I ở 630C. Đồng thời, kết quả khảo sát 6 kiểu đột  biến trên 30 BN BCMDT kháng IM bằng kỹ thuật ASO‐PCR phát hiện 17 lượt đột biến trên 15 BN so với 15  lượt đột biến trên 14 BN bằng giải trình tự chuỗi DNA, cho thấy kỹ thuật ASO‐PCR có độ nhạy cao hơn so với  giải trình tự chuỗi DNA.   Kết luận: Xây dựng thành công kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến thường gặp, kháng mạnh với  IM giúp các bác sĩ lâm sàng quyết định hướng điều trị phù hợp cho BN. Ngoài ra, ASO‐PCR là kỹ thuật đơn  giản, hiệu quả có thể triển khai rộng rãi ở các Bệnh viện có chuyên khoa huyết học để chẩn đoán đột biến điểm  BCR/ABL đã biết.  Từ khóa: bạch cầu mạn dòng tủy, đột biến kháng imatinib, ASO‐PCR.  ABSTRACT  DETECTION OF BCR/ABL MUTATIONS WHICH STRONGLY RESIST TO IMATINIB USING ASO‐ PCR AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL  Pham Thi My Hanh, Phan Thi Xinh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 200 - 204  Objective: Using ASO‐PCR  to detect  the 6 types  (Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I) of BCR/ABL  mutation which strongly resist to Imatinib (IM) in chronic myeloid leukemia (CML).  Methods:  This  study was  performed  in  30  IM‐resistant CML  patients which were  analyzed BCR/ABL  mutations by direct sequencing at Blood transfusion and Hematology hospital from January 2012 to May 2013.  ASO‐PCR conditions were established to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation strong resistance to IM.  Results: By adjusting primer annealing temperature, we determined optimal primer annealing temperature  for ASO‐PCR to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation (G250E and Y253H at 650C, Y253F at 550C, E255K  and  E255V  at  680C,  and  T315I  at  630C). Concomitantly,  the  results  of  detecting  the  6  types  of  BCR/ABL  mutation  in  30  patients  showed  that  there were  17 mutations  in  15  patients  by  using ASO‐PCR  and  15  mutations in 14 patients by using direct sequencing. These results indicate that ASO‐PCR is more sensitive than  direct sequencing technique.  Conclusion:  Successful  development  of  ASO‐PCR  procedure  for  detecting  the  6  types  of  BCR/ABL  * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh  ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 0932.728.115   Email: phanthixinh@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  201 mutation helps the doctors in selecting suitable therapy regiment for patient. Moreover, ASO‐PCR is simple and  effective  technique  which  can  apply  for  detecting  the  known  BCR/ABL  kinase  domain  mutations  in  other  hematology hospitals.  Keywords: chronic myeloid leukemia, mutations resistance to Imatinib, ASO‐PCR  ĐẶT VẤN ĐỀ  Khoảng 20% đến 30% bệnh nhân (BN) bạch  cầu  mạn  dòng  tủy  (BCMDT)  được  phát  hiện  kháng  imatinib  (IM)  sau khi  điều  trị với  thuốc  một thời gian. Các cơ chế kháng IM đã được mô  tả mà  nguyên  nhân  chủ  yếu  là  do  những  đột  biến trên ABL kinase domain (chiếm tới 30 ‐ 90%  các  BN  kháng  IM)  và  tăng  biểu  hiện  do  sự  khuếch đại của gen BCR/ABL(2,4). Do đó, khảo sát  các đột biến vùng kinase trên BCR/ABL là yếu tố  quan trọng giúp quyết định hướng điều trị cho  BN BCMDT kháng IM.  Từ  năm  2010  đến  năm  2012,  tại Bệnh  viện  Truyền máu Huyết  học  (BV.TMHH)  TP.HCM,  chúng tôi đã khảo sát 103 BN BCMDT kháng IM  bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(3). Kết quả  nghiên  cứu  cho  thấy  có  46,6%  BN  mang  đột  biến, trong đó các kiểu đột biến thường gặp gây  kháng mạnh  với  IM  là G250E,  Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V,  E279K,  T315I  (23/103  =  22,3%).  Việc phát hiện các đột biến gây kháng mạnh này  giúp các bác sĩ quyết định ngừng sử dụng IM và  đưa ra lựa chọn điều trị khác thích hợp cho BN.   Mặc dù kỹ  thuật giải  trình  tự chuỗi DNA  phù hợp  để khảo  sát  tất  cả  các kiểu  đột biến  BCR/ABL gây kháng IM nhưng đòi hỏi phải có  đủ  trang  thiết  bị  hiện  đại,  đắt  tiền,  nhân  lực  được đào tạo tốt có thể phân tích đột biến nên  khó triển khai rộng rãi. Trong khi đó, kỹ thuật  ASO‐PCR có độ nhạy và tính chuyên biệt cao,  có  thể  sử  dụng  để  phát  hiện  nhanh  các  đột  biến đã biết kháng mạnh với IM sử dụng trang  thiết  bị  đơn  giản  như máy  luân  nhiệt  và  kỹ  thuật viên có thể thực hiện được nếu quy trình  đã được xây dựng tốt.   Trong nghiên cứu này chúng tôi xây dựng  quy  trình ASO‐PCR khảo sát đột biến G250E,  Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V,  T315I  để  giúp  hoàn  thiện  kỹ  thuật  phát  hiện  nhanh  các  trường hợp mang đột biến kháng mạnh với IM  thường gặp.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Nghiên cứu được tiến hành trên 30 mẫu tủy  xương của BN BCMDT kháng IM tại BV.TMHH  TP.HCM  từ  tháng  01/2012  đến  05/2013  có  chỉ  định  tìm đột biến BCR/ABL kháng  IM bằng kỹ  thuật giải trình tự chuỗi DNA.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới.  Phương pháp tiến hành  Ly  trích DNA:  Lấy  2 ml  tủy  xương  từ  gai  chậu hoặc  5 ml máu ngoại biên  (nếu  số  lượng  bạch cầu ≥ 20 K/μL) trong chống đông EDTA. Ly  trích DNA  từ  tủy  xương hoặc máu ngoại biên  bằng GenElute blood genomic DNA kit (Sigma,  Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra  nồng  độ  và  độ  tinh  sạch  bằng máy  đo  quang  phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm.  Thực  hiện  phản  ứng ASO‐PCR:  Thành  phần  phản  ứng ASO‐PCR  gồm  có  1μL  (10μM) mồi  cho mỗi  loại  (bảng 1), 0,1μL  (5UI  /  μL) Takara  Taq HotStart Polymerase (Takara, Nhật) và 1 μL  (100ng) DNA trong 20μL thể tích phản ứng. Tiến  hành thử điều kiện của phản ứng PCR với nhiệt  độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 55 ~ 680C. Chu  kỳ luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720  Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) bao  gồm 940C trong 5 phút; theo sau là 30 chu kỳ của  940C  trong  25 giây,  55  ~  680C  trong  25 giây và  720C trong 30 giây. Sản phẩm PCR được điện di  trên  thạch 2% có chứa ethidium bromide  trong  0,5 x TBE và quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ  (Biorad, Mỹ). Chứng dương và chứng âm được  chọn  từ những mẫu  có  đột biến và không  đột  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  202 biến  đã  khảo  sát  bằng  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi DNA.  Bảng 1: Các cặp mồi dùng cho ASO‐PCR và kích  thước sản phẩm PCR tương ứng  Kiểu đột biến Mồi xuôi Mồi ngược Kích thước sản phẩm PCR Nhiệt độ bắt cặp tối ưu G250E 250mu 244R 208 bp 65oC Y253H 253mu1 199 bp 65oC Y253F 253mu2 198 bp 55oC E255K 255mu1 194 bp 68oC E255V 255mu2 194 bp 68oC T315I 315mu 315R 158 bp 63oC KẾT QUẢ  Chúng tôi đã tiến hành thử điều kiện phản  ứng ASO‐PCR để chọn điều kiện nhiệt độ bắt  cặp mồi tối ưu khuếch đại đặc hiệu 6 kiểu đột  biến  BCR/ABL  kháng mạnh  với  IM.  Kết  quả  thử điều kiện của từng kiểu đột biến được mô  tả như sau:  Đối với đột biến G250E, chúng  tôi khảo sát  nhiệt độ bắt cặp mồi ở 560C, 600C và 650C đối với  mẫu chứng âm mang đột biến T315I (giếng 1, 4,  7), mẫu mang đột biến G250E (giếng 2, 5, 8) và  nước (giếng 3, 6, 8) (hình 1A). Kết quả cho thấy  cả 3 điều kiện đều xuất hiện băng đặc hiệu cho  đột biến G250E (208 bp) như kết quả của giếng 2,  5, 8 và nước hoàn toàn không có băng (hình 1A).  Giếng 1 và 4 xuất hiện băng mờ không đặc hiệu  ở 560C và 600C, trong khi đó ở 65oC băng không  đặc hiệu này biến mất (giếng 7, Hình 1A). Điều  kiện  tối ưu của phản ứng được kiểm  tra  trên 3  mẫu chứng dương và lặp lại 2 lần.  Đối với đột biến Y253H, chúng tôi khảo sát ở  4 mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C, 620C, 650C và  680C đối với mẫu có đột biến Y253H, mẫu chứng  âm mang đột biến Y253F và nước. Kết quả cho  thấy  ở  650C mẫu  có  đột biến Y253H  xuất hiện  băng  đậm  và  rõ  nét  hơn  các  điều  kiện  khác.  Ngược lại, với đột biến Y253F chúng tôi khảo sát  ở 550C, kết quả cho  thấy chỉ có mẫu mang  đột  biến Y253F mới xuất hiện băng đặc hiệu (198 bp)  ở giếng 1, mẫu chứng âm mang đột biến Y253H  (giếng  2), mẫu  không  có  đột  biến  (giếng  3)  và  nước  (giếng  4)  đều  không  xuất  hiện  băng  đặc  hiệu  (hình 1B). Điều kiện  tối ưu của Y253H và  Y253F được kiểm tra trên 3 mẫu và 2 mẫu chứng  dương tương ứng và lặp lại 2 lần.  560C 600C 650C 550C A B   Hình 1: ASO‐PCR phát hiện đột biến G250E (A) và  Y253F (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu chứng âm có đột biến  T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu có đột biến G250E; giếng 3, 6, 8  là nước. (B): Giếng 1 là mẫu có đột biến Y253F; giếng 2 là  mẫu chứng âm có đột biến Y253H; giếng 3 là mẫu không  có đột biến; và giếng 4 là nước.  Đối với đột biến E255K, chúng tôi khảo sát 3  mốc nhiệt độ bắt cặp mồi  là 600C, 620C và 680C  với mẫu chứng dương có đột biến E255K, chứng  âm có đột biến E255V và nước. Kết quả cho thấy  ở điều kiện 68oC cho kết quả tối ưu nhất (Hình  2A). Ngược  lại,  với  đột  biến  E255V  chúng  tôi  khảo  sát  4 mốc nhiệt  độ bắt  cặp  là  580C,  600C,  650C và 680C với mẫu chứng dương có đột biến  E255V, chứng âm có đột biến E255K và nước, và  kết quả cho thấy ở điều kiện 68oC cho kết quả tối  ưu nhất (Hình 2B). Điều kiện tối ưu của E255K  và E255V  được kiểm  tra  trên 3 mẫu và  1 mẫu  chứng dương tương ứng và lặp lại 2 lần.  B 58oC 60oC 65oC 68oC600C 620C 680C A   Hình 2: ASO‐PCR phát hiện đột biến E255K (A) và  E255V (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến E255K;  giếng 2, 5, 8 là mẫu chứng âm có đột biến E255V; giếng 3,  6, 8 là nước. (B): Giếng 1, 4, 7 và 10 là mẫu có đột biến  E255V; giếng 2, 5, 8 và 11 là mẫu chứng âm có đột biến  E255K; giếng 3, 6, 9 và 12 là nước.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  203 Đối với đột biến T315I, chúng tôi khảo sát ở 3  mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 630C, 640C và 650C,  mẫu chứng dương có đột biến T315I (giếng 1, 4,  7), mẫu chứng âm có đột biến G250E (giếng 2, 5,  8)  và nước  (giếng  3,  6,  9). Kết  quả  cho  thấy  ở  điều kiện 63oC cho kết quả tối ưu nhất với băng  đột biến (158bp) rõ nét nhất (hình 3). Điều kiện  tối ưu của phản ứng được kiểm  tra  trên 3 mẫu  chứng dương và lặp lại 2 lần.  Hình 3: ASO‐PCR phát hiện đột biến T315I  Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu  chúng âm có đột biến G250E; giếng 3, 6, 9 là nước.  Sau  khi  chuẩn  hóa  điều  kiện  ASO‐PCR  thành công, chúng  tôi khảo sát 6 kiểu  đột biến  G250E,  Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V,  T315I  kháng mạnh với IM trên 30 BN BCMDT kháng  IM. Kết quả cho  thấy có 17  lượt đột biến của 6  kiểu trên 15 BN (bảng 2). Kiểm tra bằng kỹ thuật  giải trình tự chuỗi DNA cho thấy 6 kiểu đột biến  trên được phát hiện 15 lượt trên 14 BN, 5 BN có  đột biến khác và 11 BN không phát hiện đột biến  vùng ATP‐binding domain.  Bảng 2: Các kiểu đột biến BCR/ABL kháng IM  Kiểu đột biến ASO-PCR Giải trình tự DNA G250E 3 3 Y253H 5 3 Y253F 2 2 E255K 3 3 E255V 1 1 T315I 3 3 Không phát hiện 6 kiểu đột biến trên 15 Đột biến khác ngoài 6 đột biến trên 5 Kiểu đột biến ASO-PCR Giải trình tự DNA Không phát hiện đột biến vùng ATP- binding domain 11 BÀN LUẬN  Khi khảo sát các kiểu đột biến, chúng tôi sử  dụng DNA  trong  phản  ứng  PCR  và  thử  điều  kiện  với  2  loại  taq  polymerase  là GoTaq  Plexi  DNA polymerase (Promega, Hoa Kỳ) và Takara  Taq HotStart  Polymerase.  Kết  quả  của  GoTaq  Plexi cho nhiều băng phụ ngoài băng đặc hiệu ở  cùng điều kiện nhiệt độ nên Takara Taq HotStart  Polymerase  được  chọn  sử  dụng  trong  nghiên  cứu này. Với việc thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi  cho từng phản ứng PCR, chúng tôi đã xác định  được điều kiện nhiệt độ phù hợp cho các phản  ứng ASO‐PCR  phát  6  kiểu  đột  biến  BCR/ABL  kháng mạnh  với  IM  (Bảng  1).  Điều  kiện  phản  ứng ASO‐PCR  đã  xây dựng  trong  nghiên  cứu  cho thấy kết quả khảo sát đặc hiệu cho từng kiểu  đột biến như tại vị trí Y253 và E255 đều có 2 kiểu  đột biến xảy ra là Y253K/Y253F và E255K/E255V,  khi  khảo  sát  đột  biến  Y253F  thì  Y253K  được  dùng  làm  chứng  âm  nhưng  chỉ  có mẫu mang  đột  biến  Y253F  xuất  hiện  băng  đặc  hiệu  và  ngược lại (Hình 1B), tương tự đối với E255K và  E255V (Hình 2).  Kết quả khảo sát 30 BN BCMDT kháng  IM  bằng 2 kỹ thuật ASO‐PCR và giải trình tự chuỗi  DNA  cho  thấy giá  trị  của ASO‐PCR  trong việc  tầm soát các đột biến đã biết. Trong 30 BN được  khảo sát, có 15 BN biểu hiện 17  lượt của 6 kiểu  đột  biến G250E, Y253F, Y253H,  E255K,  E255V,  T315I, cao hơn so với kết quả giải trình tự chuỗi  DNA (15 lượt của 14 BN) (Bảng 2). Trong đó, có  2 BN  (IAP‐015 và  IAP‐025) không  tìm  thấy đột  biến  Y253H  bằng  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi  DNA nhưng băng đột biến được phát hiện bằng  kỹ  thuật  ASO‐PCR  (giếng  3,  Hình  4A).  Tuy  nhiên, kết quả giải trình tự chuỗi DNA của 2 BN  trên cũng cho thấy tại vị trí aa253 ngoài sóng T  bình  thường còn xuất hiện sóng C  rất nhỏ gần  bằng  sóng  nền  (sóng  nhiễu)  nên  rất  khó  nhận  diện và quyết định là sóng bất thường (Hình 4B),  chứng tỏ trên 2 BN này đã xuất hiện dòng tế bào  63 0 64 0 65 0 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  204 mang đột biến Y253H chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều  so với dòng tế bào không mang đột biến (< 10%).  Hình 4: Kết quả ASO‐PCR (A) và giải trình tự DNA (B)  Tìm đột biến Y253H trên BN IAP‐25  Kỹ thuật ASO‐PCR có thể phát hiện 1 tế bào  bất  thường  trong  103  –  104  tế bào bình  thường  nên dễ dàng khuếch đại dòng  tế bào mang đột  biến với tỉ  lệ thấp < 10%, trong khi đó kỹ thuật  giải  trình  tự DNA  đòi hỏi phải  có  ít nhất  10%  dòng tế bào mang đột biến mới phát hiện được  (2,6), cho thấy ASO‐PCR nhạy hơn khi phát hiện  các  đột biến  đã biết. Việc phát hiện 6 kiểu  đột  biến kháng mạnh  trên giúp các bác sĩ  lâm sàng  quyết  định  chọn  lựa  hướng  điều  trị  thích  hợp  cho BN.  KẾT LUẬN  Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng  thành  công  các  điều  kiện  của  phản  ứng ASO‐ PCR khảo sát 6 kiểu đột biến BCR/ABL kháng IM  mạnh  và  thường  gặp  trên  BN  BCMDT  tại  BV.TMHH. Kết quả khảo sát 6 kiểu đột biến trên  30  BN  BCMDT  kháng  IM  cho  thấy  kỹ  thuật  ASO‐PCR  có  ưu  điểm  trong việc phát hiện  các  đột biến đã biết. ASO‐PCR khảo sát các kiểu đột  biến kháng  IM  là kỹ  thuật  đơn giản,  thực hiện  nhanh, không  đòi hỏi  trang  thiết bị đắt  tiền và  nhân  lực  đào  tạo  chuyên  sâu  nên  dễ  dàng  chuyển giao cho các cơ sở chuyên khoa điều trị  BCMDT trong nước.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Elnahass YH, Mahmoud HK, Ali FT, et al (2013), Abl Kinase  Domain Mutations in Imatinib‐treated Egyptian Patients with  Chronic Myeloid Leukemia, J Leuk, 1: 106.  2. Kang HY, Hwang  JY, Kim  JH,  et  al  (2006). Comparison  of  allele specific oligonucleotide‐polymerase chain reaction and  direct  sequencing  for  high  throughput  screening  of  ABL  kinase  domain  mutations  in  chronic  myeloid  leukemia  resistant to IM, Haematologica, 91: 659‐662.  3. Phan Thị Xinh  (2012), Khảo  sát  đột biến gen BCR/ABL gây  kháng IM trên BN bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) bằng  phương pháp giải  trình  tự chuỗi DNA, đề  tài Sở Khoa Học  Công Nghệ Tp.HCM 2010‐2012.  4. Soverini S, Colarossi S, Gnani A, et al (2006), Contribution of  ABL kinase domain mutations  to  IM  resistance  in different  subsets  of  Philadelphia‐positive  patients:  by  the  GIMEMA  Working  Party  on  Chronic Myeloid  Leukemia,  Clin Cancer  Res, 12: 7374‐9.  5. Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, et al  (2011), BCR‐ABL  kinase  domain  mutation  analysis  in  chronic  myeloid  leukemia  patients  treated  with  tyrosine  kinase  inhibitors:  recommendations  from  an  expert  panel  on  behalf  of  European LeukemiaNet, Blood, 118 (5): 1208‐15.  6. Willis  SG, Lange T, Demehri  S  et  al  (2005), High‐sensitivity  detection of BCR‐ABL kinase domain mutations in  imatinib‐ naive patients:  correlation with  clonal  cytogenetic  evolution  but not response to therapy, Blood, 106(6): 2128‐37.  Ngày nhận bài báo:      20 tháng 8 năm 2013  Ngày phản biện:      04 tháng 9 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22  tháng  10  năm  2013 (A)