Khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của cao chiết lá hương nhu tía (Ocimum sanctum) trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 124 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN SỰ SUY GIẢM TRÍ NHỚ CỦA CAO CHIẾT LÁ HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM) TRÊN CHUỘT NHẮT Trần Đình Năng*, Nguyễn Hoàng Giao*, Dương Phước An*, Nguyễn Thị Thu Vân*, Trần Phi Hoàng Yến* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Hoạt tính chống oxy hóa và khả năng bảo vệ tế bào não của Hương nhu tía Ocimum Sanctum Lamiaceae đã được chứng minh in vivo(4). Tuy nhiên, cho đến nay sự khảo sát về khả năng bảo vệ sự suy giảm việc học tập và ghi nhớ của Hương nhu tía vẫn chưa được thực hiện. Mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ sự suy giảm khả năng học tập và ghi nhớ của cao chiết toàn phần từ lá cây Hương nhu tía (HNT) trên chuột nhắt. Phương pháp: Sử dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin (TMT) để đánh giá khả năng bảo vệ sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ của cao chiết lá HNT thông qua mô hình Morris Water Maze (MWM) và việc xác định các chỉ số sinh hóa (acetylcholine và acetylcholinesterase). Kết quả: Hai liều cao chiết toàn phần từ cây HNT (50 mg/kg, và 100 mg/kg, p.o x 14 ngày) đều thể hiện khả năng bảo vệ tác dụng gây suy giảm việc học tập và ghi nhớ do TMT liều duy nhất (TMT 2,4 mg/kg, i.p) thông qua 3 thử nghiệm của mô hình MWM: Thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test, p < 0,001 khi so giữa nhóm TMT với HNT1 + TMT hoặc nhóm HNT2 + TMT); thử nghiệm thăm dò (Probe Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT và HNT1 +TMT hoặc nhóm HNT2 +TMT); và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test, p < 0,05 khi so giữa nhóm TMT với HNT1 + TMT; p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với nhóm HNT2 + TMT). Kết quả định lượng acetylcholine (Ach) và acetylcholinesterase (AchE) trong vùng hải mã cũng tương ứng với kết quả đạt được từ các thử nghiệm hành vi. Cả hai liều thử nghiệm cao chiết HNT đều thể hiện khả năng phục hồi sự giảm nồng độ Ach (p < 0,01) và sự gia tăng AchE (p < 0,01) do TMT gây ra. Kết luận: cao chiết toàn phần từ lá HNT thể hiện khả năng bảo vệ sự suy giảm khả năng học tập và ghi nhớ qua mô hình MWM và hiệu quả này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng hàm lượng Ach và giảm hoạt tính AchE trong vùng hải mã não chuột. Keywords: Trimethyltin, suy giảm học hỏi và ghi nhớ, acetylcholine, Hương nhu tía ABSTRACT STUDY ON AMELIORATE OF MEMORY IMPAIRMENTS OF HUONG NHU TIA (OCIMUM SANCTUM) EXTRACT IN MICE Tran Dinh Nang, Nguyen Hoang Giao, Duong Phuoc An, Nguyen Thi Thu Van, Tran Phi Hoang Yen *Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 124 - 129 Background: Antioxidant activity and neuroprotective effect of Ocimum Sanctum was investigated in vivo(4). However, study on role of the leaf of Ocimum Sanctum in impairments of learning and memory is not carried out until now. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365 Email: tranyen73@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 125 Objective: Evaluate role of the leaf of Ocimum Sanctum extract of learning and memory impairments in mice. Methods: Trimethyltin (TMT) model for learning and memory impairments to evaluate the effect of Ocimum Sanctum extract (HNT) using Morris Water Maze (MWM) protocol and biochemical detection (Acetylcholine và Acetylcholinesterase). Results: Two doses of HNT (HNT1, 50 mg/kg and HNT2, 100 mg/kg, p.o x 14 days) prove the protective role in learning and memory impairments caused by TMT one dose exposure (2.4 mg/kg, i.p) by evaluation of MWM: Hidden Platform Test (p < 0.001 as compared between TMT and HNT1 + TMT or HNT2 + TMT group); Probe Test (p < 0.01 as compared between TMT and HNT1 +TMT or HNT2 +TMT group); and Working Memory Test (p < 0.05 as compared between TMT and HNT1 + TMT; p < 0.01 as compared between TMT and HNT2 + TMT). Results in acetylcholine (Ach) content and Acetylcholinesterase (AchE) activity are correlated to results in behavior study. Two doses of HNT ameliorate the decreases in Ach content and increases in AchE activity caused by TMT. Conclusion: Results demonstrated role of HNT in impairments of learning and memory using MWM test. This result correlates to cholinergic response, by increases in Ach content (p < 0.01) and decreases in AchE activity (p < 0.01) in hippocampus of mice. Keywords: Trimethyltin, learning and memory impairments, acetylcholine, Ocimum sanctum Lamiaceae ĐẶT VẤN ĐỀ Hương nhu tía (HNT) còn gọi é tía có tên khoa học Ocimum tenuiflorum (Ocimum sanctum) họ Hoa môi (Lamiaceae) là một trong những dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu đời, có thành phần hóa học chủ yếu là các polyphenol và flavonoid. HNT đã được chứng minh có các tác dụng chống oxy hóa, chống stress, kháng viêm, kháng khuẩn(1,2) Đặc biệt, các tác dụng chống stress oxy hóa đã được thực hiện trên não, sử dụng mô hình gây stress bằng tiếng ồn, thông qua với kết quả khả quan do nhóm J. Samson và cộng sự thực hiện(4). Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ thông qua mô hình thử nghiệm hành vi Morris Water Maze (MWM) và thông qua việc xác định nồng độ Ach và hoạt tính enzym AchE, các thông số liên quan đến hoạt động của hệ cholinergic, một hệ thống có vai trò rất quan trọng trong sự hình thành và duy trì trí nhớ. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao chiết toàn phần HNT Cao chiết ethanol toàn phần từ cây HNT được chiết dựa trên phương pháp chiết ngấm kiệt theo tài liệu đã được công bố(3). Chuột thử nghiệm Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino, trọng lượng 22 - 24 gam (khoảng 5 - 6 tuần tuổi), do Viện Vắc Xin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang cung cấp. Nguyên liệu, hóa chất khảo sát Coomassie [Bradford] (Thermo fisher Scientific); Amplex® Red Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit (A12217- InvitrogenTM/ Molecular Probe). Máy đo phổ hấp thu U-1900 UV/VIS Spectrophotometer 200V (HITACHI), máy Elisa (Thermo Electron) và máy nghiền đồng thể SONICATOR 3080 (USA). Thử nghiệm Morris Water Maze Là thử nghiệm dùng để đánh giá trí nhớ dài hạn trên chuột nhắt trắng. Hồ bơi có kích thước 1500 x 80 (cm) (đường kính x chiều cao), chân đế kích thước 10 x 25 (cm) (đường kính x Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 126 chiều cao). Hồ bơi được đặt ở một nơi có màn che kín, trên tấm màn che này có đặt những hình vẽ với hình thù bất kỳ tại 4 góc hồ bơi. Nhiệt độ của hồ bơi phải nằm trong khoảng 27 ± 2 0C trong suốt thử nghiệm(4). Thử nghiệm mê cung bơi gồm 8 ngày thử nghiệm như sau: Hình 1a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 1b. Sơ đồ bố trí thử nghiệm mô hình Morris Water Maze - Chuột được chia làm 6 nhóm,, mỗi nhóm từ 8-10 con, thể tích tiêm hoặc uống thuốc là 0,1 µl/ 1 gam chuột): + Nhóm 1: Saline (Nước muối sinh lý, Sal.; n = 8) + Nhóm 2: TMT (2,4 mg/kg, i.p; liều duy nhất, n = 10) + Nhóm 3: HNT1 (50 mg/kg, p.o x 14 ngày; n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p + Nhóm 4: HNT2 (100 mg/kg, p.o x 14 ngày; n = 10)+TMT 2,4 mg/kg, i.p + Nhóm 5: Memantine (MEM 2 mg/kg, i.p x 10 ngày; n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p + Nhóm 6: Galantamin (Gal. 10 mg/ kg x 10 ngày, n = 10) + TMT 2,4 mg/kg, i.p Định lượng Ach và AchE Nguyên tắc Sử dụng kit Amplex Red™ để định lượng Ach và AchE thông qua trung gian enzyme choline oxidase xúc tác các phản ứng. Ach sẽ bị enzyme AchE chuyển thành choline, sau đó nó bị choline oxidase oxi hóa thành betain và H2O2. Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với 10– cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red reagent) tạo chất có màu hồng. Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nmCường độ huỳnh quang của Amplex Red™ tỷ lệ thuận với nồng độ Ach và AchE. Kết quả được biểu diễn là số nmol Ach/ mg protein và số mU AchE hoạt động/ mg protein. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 127 Xử lý và phân tích số liệu Số liệu được biểu diễn dưới dạng Mean ± SEM. Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLST test. Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,05. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 2. Sự thay đổi về thời gian tìm thấy chân đế giữa nhóm chứng (Sal., n = 6) và các nhóm tiêm TMT (TMT 2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất, n = 6) có hoặc không có điều trị với cao chiết HNT (HNT1 50 mg/kg, p.o x 14 ngày + TMT2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất, HNT2 100 mg/kg, p.o x 14 ngày + TMT2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất, n = 6) hoặc memantine (MEM 2 mg/kg, i.p x 10 ngày + TMT 2,4 mg/kg, i.p, liều duy nhất). ap < 0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,001 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 yếu tố với Fisher’s PLST test). Hình 3. Sự thay đổi về số lần chuột bơi qua chân đế (Hình 3A) và thời gian chuột tìm thấy chân đế (Hình 3B) giữa nhóm chứng (Sal., n = 6) và các nhóm tiêm TMT (sau 7 ngày, n = 6) có hoặc không có điều trị với cao chiết HNT (HNT1 50 mg/kg, p.o + TMT, HNT2 100 mg/kg, p.o + TMT, n = 6) hoặc memantine (MEM 2 mg/kg, i.p x 10 ngày). ap < 0,01 khi so với nhóm chứng, bp < 0,05, bbp < 0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 128 Nhận xét Sử dụng mô hình MWM để đánh giá vai trò của cao chiết lá HNT đối với sự suy giảm việc học tập và ghi nhớ do TMT gây ra, một số kết quả đã được ghi nhận: Khi so với nhóm Sal., nhóm TMT làm suy giảm khả năng học và nhớ của chuột thông qua sự gia tăng thời gian tìm thấy chân đế trong thử nghiệm ẩn chân đế (HPT) và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (WMT). Ngoài ra, nhóm TMT còn làm giảm số lần chuột bơi qua chân đế trong thử nghiệm đánh giá (Probe Test). Điều trị với HNT 7 ngày trước và sau khi tiêm TMT, cả 2 liều 50 mg/kg và 100 mg/kg đều làm giảm thời gian tìm thấy chân đế so với nhóm TMT trong HPT và WMT. Tuy nhiên, chưa có sự gia tăng tuyến tính giữa 2 liều thử nghiệm. Nhóm đối chứng dương được điều trị với MEM, một chất đã được sử dụng trong điều trị bệnh alzheimer từ mức độ nhẹ tới nặng, sử dụng liều 2 mg/kg, 3 ngày trước và 7 ngày sau khi tiêm TMT cho thấy có khả năng bảo vệ sự tổn thương hoạt động học và nhớ trên chuột thực nghiệm do TMT gây ra. Khi so với khả năng hồi phục trí nhớ của MEM, nhóm điều trị với HNT gần như không có sự khác biệt, điều này chứng tỏ khả năng hồi phục sự tổn thương trí nhớ của cao chiết HNT gần tương đương với nhóm chứng dương trong điều kiện thử nghiệm. Hình 4. Ảnh hưởng của cao chiết HNT trên sự thay đổi nồng độ Ach (hình 4A) và nồng độ AchE (hình 4B), sử dụng mô hình TMT. ap < 0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,01, bbp < 0,001 khi so với nhóm TMT, cp < 0,05, ccp < 0,001 khi so với nhóm Gal. Nhận xét TMT làm giảm nồng độ Ach và tăng nồng độ AchE khi so với nhóm chứng. Nhóm HNT1 và HNT2 đều làm tăng nồng độ Ach giảm nồng độ AchE khi so với nhóm TMT. Nhóm chứng dương Gal., là chất đối chứng dương Gal., chất ức chế cholinesterase, thể hiện khả năng làm tăng nồng độ Ach và giảm hoạt tính enzyme AchE tương đương với nhóm chứng. Có sự khác biệt có ý nghĩa khi so giữa nhóm Gal. và các nhóm có điều trị bằng cao chiết toàn phần HNT. Bàn luận Cao chiết lá Hương nhu tía (HNT) (7 ngày trước và sau khi tiêm TMT liều duy nhất) có khả năng bảo vệ sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ trên chuột thực nghiệm qua mô hình 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Sal. TMT Gal. HNT1 HNT2 0 5 10 15 20 25 Sal. TMT Gal. HNT1 HNT2 A. Acetylcholine B. Acetylcholinesterase N ồn g độ A ch (n m ol e/ m g pr ot ei n) H oạ t t ín h A ch E (m U /m g pr ot ei n) a a bb bb b,c b,c b,cc b,cc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 129 MWM, một mô hình dùng để đánh giá trí nhớ dài hạn về sự xác định vị trí không gian, và kết quả này phù hợp với khả năng hồi phục sự tổn thương hệ cholinergic thông qua việc xác định nồng độ Ach và hoạt tính enzym AchE. Kết quả ban đầu này giúp định hướng cho việc nghiên cứu tiếp khả năng bảo vệ tế bào não chống lại sự thoái hóa tế bào thần kinh, con đường tất yếu dẫn đến các bệnh suy giảm trí nhớ như Alzheimer, Parkinson, Hungtinton KẾT LUẬN Khả năng bảo vệ sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ của cao chiết HNT (Ocimum Sanctum Lamiaceae) thông qua tác động trên hệ cholinergic đã được chứng minh qua mô hình Morris Water Maze và việc xác định nồng độ Ach và hoạt tính enzym AchE. Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu khoa học của Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM (Năm 2010). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Babu K. and Maheswari Uma K.C. (2006). In vivo studies on the effect of Ocimum sanctum L. leaf extract in modifying the genotoxicity induced by chromium and mercury in Allium root meristems. Journal of Environmental Biology 27(1) 93-95. 2. Khanna N., and Bhatia J. (2003). Antinociceptive action of Ocimum sanctum (Tulsi) in mice: possible mechanisms involved. Journal of Ethnopharmacology Volume 88, Issues 2-3, Pages 293-296. 3. Rastogi, Shukla Y., Paul N.B., Khanna K.S., Mukul (2007). Protective effect of Ocimum sanctum on 3- methylcholanthrene,7,12-dimethylbenz(a)anthracene and aflatoxin induced skin tumorigenesis in mice. Toxicology and Applied Pharmacology 224 pp. 228–240. 4. Samson J., Sheeladevi R., Ravindran R. (2007). Oxidative stress in brain and antioxidant activity of Ocimum sanctum in noise exposure. NeuroToxicology (28) 679–685. 5. Vorhees V.C. & Williams T.M. (2006). Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols 1, - 848 – 858.