Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của một số chủng staphylococci phân lập từ môi trường bệnh viện

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 164 KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ CHỦNG STAPHYLOCOCCI PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BỆNH VIỆN Bùi Minh Giao Long*, Lý Trọng Minh**, Trần Cát Đông** TÓM TẮT Mở đầu: Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng đáng kể chi phí điều trị và tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân nằm viện. Các chủng Staphyloccoci, đặc biệt là MRSA (Staphylococcus aureus kháng methicillin) là một trong những chủng gây gây ra các nhiễm trùng khó điều trị ở bệnh viện bệnh phổ biến nhất. Việc khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh thường được tiến hành từ bệnh phẩm, tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu trên vi khuẩn phân lập từ môi trường bệnh viện. Mục tiêu: Khảo sát sự đề kháng với nhóm β-lactam và các kháng sinh khác đồng thời xác định kiểu gen đề kháng của các chủng Staphylocci phân lập từ không khí bệnh viện. Phương pháp: Lấy mẫu và phân lập bằng cách đặt các đĩa MSA (Mannitol Salt Agar) tại các khoa, phòng. Thử nghiệm kháng sinh đồ và biện giải theo CLSI M100-S18. Chiết tách ADN và thực hiện PCR để xác định kiểu gen đề kháng mecA. Kết quả: Phân lập được 130 chủng Staphylococci từ không khí một số khoa, phòng. Kết quả cho thấy tỉ lệ kháng penicillin và ampicillin là cao nhất (lần lượt là 72,31%, 70%). Tỉ lệ chủng kháng ceftazidime và oxacillin gần bằng nhau (26,15% và 24,62%). Các kháng sinh còn lại có tỉ lệ đề kháng dưới 20%. Imipenem và amoxicillin/clavulanic acid không bị đề kháng. Kết quả PCR cho thấy có 28/32 chủng có có mang gen đề kháng mecA. Thử nghiệm kháng sinh đồ trên 8 kháng sinh nhóm khác cho thấy tỉ lệ đề kháng azithromycin cao nhất (83,33%), tiếp theo là clindamycin (67,67%) và kanamycin (40%). Tỉ lệ đề kháng với cloramphenicol, bactrim và ciprofloxacin trong khoảng từ 20-30%. Không có chủng nào đề kháng với tetracyclin và vancomycin. Kết luận: Sự đề kháng kháng sinh ở các chủng Staphylococci trong không khí tại bệnh viện cho thấy môi trường bệnh viện luôn cần phải được kiểm soát tốt hơn để hạn chế nhiễm trùng cho bệnh nhân. Từ khóa: Staphylococci, MRS, MRSA, đề kháng kháng sinh, mecA ABSTRACT INVESTIGATING THE ANTIBIOTIC RESISTANCE OF SOME STAPHYLOCOCCI STRAINS ISOLATED FROM HOSPITAL ENVIRONMENT. Bui Minh Giao Long, Ly Trong Minh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 164 - 169 Background: Currently, nosocomial infections contribute significantly to excess costs and mortality for hospitalized patients. Many strains of Staphylococci, especially, MRSA (methicillin resistant Staphylocccus aureus) are one of the most popular pathogens causing difficult-to-treat infections in hospital. The monitoring of antibiotic resistance is often performed on patients’ isolates; however, there has been not much concern for that from hospital environment yet. Objectives: Investigating incidences of antibiotic resistance to β-lactam and others and also identifying resistant genotype of Staphylococci strains isolated from hospital air. *Bộ môn Dược Lâm Sàng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM **Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127; Email: trancdong@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 165 Methods: Sampling and isolating airborne Staphylococci strains were done by sedimentation method on MSA (Mannitol Salt Agar) plates in some clinics. Agar disk diffusion was used to identify the resistance to antibiotics and the results were interpreted based on CLSI M100-S18. DNA of MRS strains were extracted and amplifying mecA gene by using PCR for the genotyping. Results: We isolated 130 strains of Staphylococci from hospital air. The results showed that the resistance to penicillin and ampicillin ranked the first and second highest with 72,31% and 70% respectively. The rates of ceftazidime and oxacillin resistance were followed at 26,15% and 24,62% respectively. For other β-lactam antibiotics, resistant incidences were less than 20%. There was no resistance to imipenem and amoxicillin/clavulanic acid found in all strains. The PCR-based genotyping indicated 28 out of 32 strains carrying the mecA gene. The subsequent results on 8 other antibiotic groups demonstrated that azithromycin has the highest resistant rate (88,33%) followed by clindamycin (67,67%) and kanamycin (40%). The resistance to chloramphenicol, bactrim and ciprofloxacin were ranged in 20-30%. Resistance to vancomycin and tetracycline was not observed. Conclusion: The antibiotic resistance of Staphylococci strains isolated from hospital air indicated that it is always necessary to control the hospital environment to reduce infections for patients. Keywords: Staphylococci, MRS, MRSA, antibiotic resistance, mecA. ĐẶT VẤN ĐỀ Môi trường bệnh viện đặc biệt ở các phòng khám, phòng mổ, khoa hô hấp, khoa hồi sức cấp cứu tồn tại các vi khuẩn gây bệnh hay cơ hội với mật độ cao. Các vi khuẩn này có thể lây nhiễm cho bệnh nhân và cả nhân viên y tế theo đường không khí hoặc qua tiếp xúc với các dụng cụ y tế dùng trong bệnh viện(2,13). Đây chính là tình trạng nhiễm trùng bệnh viện và hiện nay đang được quan tâm rất nhiều vì các vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện thường có mức độ đề kháng cao hơn các vi khuẩn nhiễm trùng từ cộng đồng(4,13). Các chủng Staphylocci, đặc biệt là MRSA (Staphylococcus aureus đề kháng methicillin) được phát hiện đề kháng rất nhiều các loại kháng sinh khác như macrolid, quinolon, aminosid, và kể cả vancomycin(6,13). Ngoài ra một số chủng khác như Staphylococcus epidermidis và Staphlycococcus saprophyticus gây bệnh cơ hội quan trọng cho người cũng đang có khuynh hướng đa đề kháng(6). Điều này thực sự là một thử thách rất lớn trong điều trị vì làm gia tăng tỉ lệ tử vong cũng như làm tăng chi phí điều trị cho bệnh nhân. Việc theo dõi tình hình đề kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm là một trong công việc thường quy của bệnh viện. Tuy nhiên, việc xác định mức độ đề kháng của các vi khuẩn tồn tại trong môi trường bệnh viện ở nước ta chưa được quan tâm nhiều. Ngoài ra, bên cạnh việc xác định kiểu hình đề kháng methicillin, việc xác định kiểu gen đề kháng hiện được xem là chính xác hơn và được sử dụng nhiều hơn(7,9). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Hóa chất: đĩa kháng sinh (Nam Khoa), TSA (Trypton Soy Agar), MHA (Mueller Hinton Agar), MSA (Mannitol Salt Agar), agarose, ethidium bromide (Merck), PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs). Trang thiết bị: máy UV-vis Genequant 1300, tủ ấm Shellab, máy li tâm Sigma 3 – 18, máy luân nhiệt Techne TC-3000 G, bộ điện di ngang Bio- rad Mini-sub cell GT. Phân lập các chủng Staphylococci Các chủng Staphylococcus aureus được phân lập từ không khí ở một số khoa phòng (phòng hồi sức cấp cứu, phòng khám, phòng mổ, khoa hô hấp, khoa ngoại tổng hợp, kho nội tổng hợp) trong thời gian từ tháng 04/2010 đến tháng 05/2010 tại Bệnh viện Nhân Dân Gia Định và Bệnh viện Thủ Đức. Sử dụng đĩa thạch MSA Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 166 (Mannitol Salt Agar) là môi trường chọn lọc để phân lập các chủng Staphylococci. Các đĩa MSA được đặt ngẫu nhiên ở góc phòng ở các vị trí: dưới sàn nhà, cách mặt đất 1-1,5 m và mở nắp trong 1 giờ. Sau đó, ủ các đĩa này trong tủ ấm 37 oC trong 24-36 giờ. Chọn các khóm màu vàng và có vòng trong xung quanh khóm (do khả năng lên men mannitol), nhuộm Gram kiểm tra hình thái và làm thuần trên môi trường TSA. Kháng sinh đồ Thử nghiệm kháng sinh đồ bằng phương pháp Kirby – Bauer, 2 chủng chứng được sử dụng gồm S. aureus ATCC 29213 (nhạy methicillin) và MRSA ATCC 4330. Đo đường kính vùng ức chế bằng thước kẹp. Bất cứ sự tăng trưởng nào thấy được bên trong vòng vô khuẩn đều chứng tỏ rằng vi khuẩn đề kháng kháng sinh. Kết quả được biện giải theo bảng biện giải M100-S18 của CLSI(3) Chiết tách ADN và phản ứng PCR Chiết tách ADN theo qui trình chiết tách chung cho vi khuẩn Gram dương của Cutting S.M(5) và thực hiện PCR khuếch đại đoạn gen mecA với mồi đặc hiệu cho gồm mồi xuôi (5’- AGT TGT AGT TGT GGG GTT TGG-3’) và mồi ngược (5’-CGT ATT TTT TAT TAC CGT TTCTC-3’) được thiết kế để tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thước 2000 bp. Phản ứng PCR thể tích 25 µl có thành phần gồm 0,5 µl ADN trộn với 2,5 µl đệm PCR 10 X, 0,25 µl dNTP 25 mM, 0,25 µl mồi xuôi và mồi ngược với nồng độ 100 µM và 0,2 µl Taq ADN polymerase 5 U/ µl và nước khử khoáng vừa đủ. Thực hiện chương trình PCR gồm 95 °C trong 1 phút, 45°C trong 45 giây, 72°C trong 2,5 phút, lập lại 35 chu kì. Sản phẩm khuếch đại bằng PCR được chạy điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 100V trong 15 phút, đọc kết quả bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide và xem dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả phân lập và định danh Staphylococci Từ 264 đĩa MSA qua 4 đợt lấy mẫu ngẫu nhiên ở các khoa phòng của hai bệnh viện, chúng tôi đã thu được 130 chủng Staphylococci. Kết quả đề kháng sinh nhóm β-lactam 130 chủng Staphylococci được thực hiện kháng sinh đồ trên 13 loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam. Kết quả được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Kết quả đề kháng 13 kháng sinh nhóm β- lactam của 130 chủng Staphylococci khảo sát Tổng cộng Kháng sinh Số chủng Tỉ lệ (%) Penicillin 94 72,3 Ampicillin 91 70 Ceftazidim 34 26,2 Oxacilin 32 24,6 Ceftriaxon 25 19,2 Cefuroxim 19 14,6 Ticarcillin 15 11,5 Cefotaxim 14 10,8 Cefaclor 11 8,7 Amoxicillin/ acid clavulanic 7 5,4 Piperacillin/Tazobactam 5 3,9 Ampicillin/Sulbactam 0 0 Imipenem 0 0 Qua kết quả trên toàn bộ 130 chủng thu được, cho thấy tỉ lệ vi khuẩn đề kháng penicillin cao nhất với 72,3%, tiếp theo là ampicillin 70% và ceftazidime với 26,2%. Tỉ lệ vi khuẩn kháng với oxacillin đứng thứ 4 với 24,6%. Không có chủng nào đề kháng với ampicillin/sulbactam và imipenem. Mức độ đề kháng penicillin trong nghiên cứu của chúng tôi khá thấp (72,3%) so với các nghiên cứu khác của Lê Toàn Lợi (80%)(8), Nguyễn Phúc Minh Châu (92,2%)(10), Phạm Thị Khánh Chi (100%)(12), Phạm Hùng Vân (100%)(11). Về ampicillin cũng tương tự, mức độ đề kháng chỉ ở 70%, trong khi ở nghiên cứu khác là 85,7% và 89,1%. Nghiên cứu về mức độ đề kháng với các β-lactam khác, so với nghiên cứu của Phạm Hùng Vân, mức độ đề kháng với Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 167 ticarcillin, ampicillin/ acid clavulanic và cefuroxim lần lượt là 28%, 30% và 38% trong khi nghiên cứu của chúng tôi là 11,5%, 5,4% và 14,6%. Thống kê của Bộ y tế năm 2006(1) cho thấy tỉ lệ đề kháng với cefotaxim và ceftriazon lần lượt là 9,8% và 29,7% gần bằng tỉ lệ đề kháng của chúng tôi là 10,78% và 26,2%. Tuy nhiên, tỉ lệ đề kháng cefuroxim theo thống kê này lại thấp hơn rất nhiều với 0,8%. Sự khác biệt giữa các nghiên cứu có thể là do điều kiện và đối tượng lấy mẫu khác nhau. Trong nghiên cứu này, kết quả sự đề kháng kháng sinh ở các vi khuẩn phân lập từ không khí thấp hơn so với vi khuẩn phân lập từ mẫu phẩm bệnh nhân từ các nghiên cứu khác. Điều này cũng có thể được giải thích do mật độ vi khuẩn đề kháng trong không khí chưa cao trong khi đó bệnh nhân sử dụng kháng sinh ở bệnh viện với tần suất rất cao. Ngoài ra, cần phải thực hiện trên số lượng mẫu nhiều hơn nữa để có thể có kết luận chính xác hơn. Kết quả PCR xác định chủng MRS mang kiểu gen đề kháng mecA Kết quả PCR trên 32 chủng có kiểu hình đề kháng methicillin, có 28 chủng có mang kiểu gen đề kháng mecA. 4 chủng còn lại không mang gen mecA có thể thuộc loại BORSA (bordeline S. aureus) tiết ra lượng lớn β –lactamase. 3 kb 2 kb 3 kb 2 kb Hình 1. Kết quả PCR khuếch đại gen mecA trên 28 chủng MRS Kết quả kháng sinh đồ các chủng MRS trên các kháng sinh nhóm khác Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ định danh sơ bộ 28 chủng có mang gen mecA bằng thử nghiệm tìm coagulase với huyết tương thỏ và nhận thấy có 21 chủng cho coagulase dương tính hay 75% là Staphylococcus aureus còn lại 7 chủng (25%) coagulase âm tính. Phản ứng coagulase có thể xác định đến 99% các chủng S. aureus, tuy nhiên một vài chủng S. aureus không tiết coagulase do khiếm khuyết gen quy định enzym này. Do đó, các chủng này nên được định danh chính xác hơn bằng các phương pháp khác như sử dụng kit định danh API hoặc giải trình tự 16S rADN. Tất cả 28 chủng MRS mang gen mecA trên được khảo sát sự đề kháng trên 8 kháng sinh gồm vancomycin, bactrim và các kháng sinh thuộc các nhóm macrolid, aminoglycosid, phenicol, cyclin, lincosamid. Kết quả được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Tỉ lệ chủng MRS đề kháng các kháng sinh khác Kháng sinh Số chủng kháng Số chủng đề kháng trung gian Tỉ lệ kháng (%) Azithromycin (Az) 25 2 83,3 Clindamycin (cL) 20 4 67,7 Kanamycin (Kn) 12 3 40 Chloramphenicol (Cl) 8 5 26,7 Bactrim (Bt) 7 4 23,3 Ciprofloxacin (Ci) 6 1 20 Tetracyclin (Te) 0 3 0 Vancomycin (Va) 0 0 0 Qua kết quả trên cho thấy, tỉ lệ vi khuẩn đề kháng azithromycin cao nhất với 83,33%, tiếp theo là clindamycin (67,67%) và kanamycin (40%). Các chủng đề kháng cloramphenicol, bactrim và ciprofloxacin có mức độ đề kháng trong khoảng từ 20-30%. Tất cả 28 chủng này Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 168 đều nhạy với tetracyclin và vancomycin. Tuy nhiên, số lượng chủng đề kháng trung gian với tetracyclin là 3 trong khi không có chủng nào đề kháng trung gian với vancomycin. Khảo sát sự đề kháng chéo cho thấy các chủng MRS cũng kháng đồng thời với nhiều kháng sinh khác. Kết quả được trình bày trong bảng 3. Bảng 3. Số lượng và tỉ lệ chủng MRS đề kháng chéo Số kháng sinh Số chủng kháng Tỉ lệ (%) 1 10 33,3 2 6 20 3 5 16,7 4 4 13,3 5 5 16,7 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Qua kết trên cho thấy, có khoảng 33% chủng MRS đề kháng chéo với ít nhất 1 loại kháng sinh và có khoảng 17% chủng đề kháng với 5 loại kháng sinh. Không có chủng nào đề kháng chéo với 6 loại kháng sinh trở lên. Về tỉ lệ đề kháng chéo, cũng tùy theo loại kháng sinh mà nghiên cứu của chúng tôi có mức độ cao hoặc thấp hơn so với một số nghiên cứu khác. Với kháng sinh nhóm macrolid, một số nghiên cứu tiến hành trên erythromycin (Er) và một số tiến hành trên azithromycin (Az). Tuy nhiên, kết quả đều cho thấy tỉ lệ đề kháng nhóm macrolid đều rất cao (xem bảng 4). Về clindamycin (cL), chúng tôi chỉ so sánh được với thống kê của Bộ Y tế năm 2006 và thấy rằng tỉ lệ đề kháng clindamycin cao hơn so với kết quả thống kê (67,7% so với 47,8%). Ngoài ra các nghiên cứu đều không tìm thấy vi khuẩn đề kháng vancomycin trong khi thống kê 2006 của Bộ Y tế cho thấy có 1,2% S.aureus đề kháng với vancomycin. Bảng 4. So sánh mức độ đề kháng kháng sinh nhóm khác giữa các nghiên cứu Tài liệu Macrolid Cl Bt cL Ci Va Lê Toàn Lợi(8) 82,9 (Er) 37,1 31,4 - 57,1 0 Nguyễn P. M. Châu(10) 92,2 (Er) 45,3 31,3 - 39,1 0 Tài liệu Macrolid Cl Bt cL Ci Va Phạm T. K. Chi(12) 47,8 (Er) 26,1 17,4 - 13 0 Phạm Hùng Vân(11) 88 (Az) 43 25 - 65 0 Bộ Y tế 2006(1) 61,2% (Er) - 27,4 47,8 32,9 1,2 Nghiên cứu này 83,3 (Az) 26,7 23,33 67,7 20 0 Điều đáng lưu ý là trong nghiên cứu này, imipenem và vancomycin vẫn chưa bị đề kháng. Trên thực tế, 2 thuốc này vẫn là thuốc lựa chọn hàng đầu cho điều trị nhiễm trùng MRSA, tuy nhiên giá thuốc cao sẽ tăng chi phí điều trị tạo gánh nặng kinh tế lớn cho bệnh nhân. Bên cạnh đó, khả năng gia tăng đề kháng vancomcycin trong tương lai sẽ có thể gây trở ngại lớn trong điều trị nếu việc sử dụng kháng sinh này không được kiểm soát tốt. KẾT LUẬN Kết quả phân lập và khảo sát sự đề kháng kháng sinh của các chủng Staphylococci trong không khí hai bệnh viện dù không cao như từ bệnh phẩm nhưng cho thấy môi trường bệnh viện vẫn luôn là một trong các nguồn lây nhiễm quan trọng và cần phải được kiểm soát tốt. Bên cạnh đó, bệnh nhân cần tuân thủ việc sử kháng sinh hợp lý để hạn chế tình trạng vi khuẩn mang gen đề kháng có thể lây truyền cho cộng đồng qua đường không khí. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2006). Tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị và hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp. 2. Breathnach AS (2009). Nosocomial infections. Medicine 37 (10):557-561. 3. CLSI (2008). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; 18th Informational Supplement. M100- S18. 28 (1): 46-53. 4. Cosgrove E.S., Perencevich N.E., Sakoulas G. et al. (2003). Comparison of Mortality Associated with Methicillin- Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia: A Meta-analysis. Clinical infectious diseases. 36(1):53. 5. Cutting S. M. and Horn P. B. V. (1990). Genetic Analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. C. R. Harwood and S. M. Cutting. Chichester, England, John Wiley & Sons Ltd: 27-74 6. Domaracki E.B., Venezia A.R., Evans M.A., (2000), Vancomycin and Oxacillin Synergy for Methicillin-Resistant Staphylococci. Antimicrobial, Agents and Chemotherapy. 44 (5):1394-1396. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 169 7. Dominguez M.A., Linares J., Martin R. (1997). Molecular mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Microbiologia; 13: 301-308. 8. Lê Toàn Lợi (2007), Tình hình mang mầm vi khuẩn Staphylococcus aureus trên bệnh nhân chuẩn bị mổ xoang tại bệnh viện Tai - Mũi - Họng TP.HCM, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Đại học Mở, TP.HCM. 9. Murakami K., Minadime W., Wanda K., Nakamura E., Teraoka H., and Watanabee S.. (1991). Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244. 10. Nguyễn Phúc Minh Châu, (2007), Nghiên cứu tình trạng mang Staphylococcus aureus ở mũi trên bệnh nhân ngọai trú tại bệnh viên Tai - Mũi Họng Tp.HCM, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP.HCM. 11. Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình (2006), Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu đa trung tâm thực hiện trên 235 chủng vi khuẩn. 12. Phạm Thị Khánh Chi, (2006), Nghiên cứu người mang mầm vi khuẩn S. aureus tại mũi trên sinh viên khoa Dược TP. HCM, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP.HCM. 13. Voss A., Doebbeling N.B. (1995). The worldwide prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents 5:101-106