Khảo sát sự tạo carotenoid theo thời gian ở pha sinh dưỡng của một số chủng bacillus

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 211 KHẢO SÁT SỰ TẠO CAROTENOID THEO THỜI GIAN Ở PHA SINH DƯỠNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Vũ Thanh Thảo*, Trần Hữu Tâm**, Trần Thành Đạo*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Carotenoid là chất chống oxi hóa tự nhiên, phổ biến trong các sinh vật quang tự dưỡng. Trong những sinh vật không có khả năng quang hợp, các loài Bacillus có khả năng sinh sắc tố được xem là nguồn carotenoid mới. Mục tiêu: Khảo sát sự tương quan giữa đường cong sinh trưởng và hàm lượng carotenoid của 6 chủng Bacillus, từ đó xác định thời điểm sinh carotenoid cao nhất đối với các chủng Bacillus ở dạng tế bào sinh dưỡng. Phương pháp: Sáu chủng Bacillus sinh carotenoid gồm B. marisflavi (DD1.1), B. vietnamensis (HC28), B. infantis (AT14), B. licheniformis (AT22), B. indicus (HU36) và B. firmus (CG17.0) được khảo sát đường cong sinh trưởng và hàm lượng carotenoid theo thời gian trên Tryptic Soy Broth (TSB). Tiến hành phân tích hàm lượng và loại carotenoid bằng HPLC. Kết quả: Carotenoid của các chủng Bacillus được sản xuất từ pha lũy thừa và đạt cực đại ở pha ổn định. Khoảng thời gian sinh carotenoid tối ưu của các chủng như sau:16-18 h, 24-26 h, 22-24 h, 24-26 h, 44-46 h và 28-30 h tương ứng với các chủng B. marisflavi, B. vietnamensis, B. infantis, B. licheniformis, B. indicus và B. firmus. Kết luận: Tất cả các chủng Bacillus đều phát triển chậm với thời gian thế hệ dài (trên 0,8 giờ). Hàm lượng carotenoid cao nhất có thể thu nhận cùng sinh khối vào pha ổn định của quá trình sinh trưởng. Từ khóa: Bacillus; carotenoid; đường cong sinh trưởng; thực phẩm chức năng, môi trường thay thế ABSTRACT LEVELS OF CAROTENOIDS PRODUCED DURING VEGETATIVE PHASE OF CAROTENOGENIC BACILLUS SPECIES Vu Thanh Thao, Tran Huu Tam, Tran Thanh Dao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 211 - 217 Background: Carotenoids are well known as natural antioxidants. They occur universally in photosynthetic organisms. Among non-photosynthetic organisms, Bacillus species have recently been identified as a new source of carotenoid. Objectives: Identify the relationship between growth curves and carotenoid contents of six selected strains and determine culture duration for highest carotenoid contents tend to produce probiotic. And the appropriate time to acquire carotenoids for vegetative cells of Bacillus strains was examined in order to provide additional data for achieving simple and cost-effective carotenoid production. Methods: Six strains of carotenogenic Bacillus species consisting of B. marisflavi (DD1.1), B. vietnamensis (HC28), B. infantis (AT14), B. licheniformis (AT22), B. indicus (HU36) and B. firmus (CG17.0) were grown in tryptic soy broth to investigate growth curves and carotenoid content by time. During vegetative growth samples were taken every six hour for carotenoid analysis by HPLC. *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM **Trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 212 Results: The result showed that carotenoid levels were detected at midle of the exponential growth phase and reach maximal levels at stationary phase which correspond to approximate 16-18 h, 24-26 h, 22-24 h, 24-26 h, 44-46 h and 28-30 h for strains of B. marisflavi, B. vietnamensis, B. infantis, B. licheniformis, B. indicus and B. firmus, respectively. Conclutions: All strains growth rate are slow with long generation time (more than 0.8 h). Maximal biomass and carotenoids content can be harvested at the same period in the stationary phase. Keywords: Bacillus; carotenoid; growth curves. ĐẶT VẤN ĐỀ Carotenoid có cấu tạo phân tử là các đơn vị isoprenoid liên kết tạo nên một dây C40 polyisoprenoid với một loạt các nối đôi liên hợp nằm ở vùng trung tâm của phân tử. Chúng có nguồn gốc từ isopentenyl pyrophosphate được tổng hợp bởi thực vật và một số vi sinh vật như vi khuẩn, tảo và vi nấm(13). Carotenoid là nhóm sắc tố được phổ biến rộng rãi trong tự nhiên với một số màu sắc như vàng, cam, đỏ và tím. Bên cạnh đó, với hoạt tính chuyển hóa tiền chất của một số vitamin và hormon, carotenoid đóng một vài trò quan trọng về sinh học và sinh lý học trong đời sống sinh vật, chẳng hạn như khả năng đánh bắt ánh sáng trong quang hợp, bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân gây quang hóa bằng cách dập tắt oxy đơn bội cũng như các gốc tự do có hại tạo ra khi tế bào bị chiếu sáng(4). Các nghiên cứu cho thấy rằng sự hiện diện của carotenoid trong chế độ ăn hàng ngày sẽ ngăn chặn nhiều bệnh tạo bởi các gốc tự do như xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể, thoái hóa điểm vàng, bệnh đa sơ cứng và quan trọng nhất là ung thư(7). Trong những năm gần đây, những loài Bacillus sinh sắc tố đã được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu như Bacillus marisflavi và Bacillus aquimaris sinh sắc tố vàng được phân lập từ biển thủy triều Hoàng Hải ở Hàn Quốc(15), Bacillus megaterium sinh sắc tố đỏ, Bacillus firmus tạo màu hồng đến hồng đậm, Bacillus vietnamensis sinh sắc tố được phân lập tại ao tôm ở Việt Nam, và Bacillus indicus với sắc tố đa dạng vàng-cam, Bacillus cibi, Bacillus vedderi, Bacillus clarkii(8). Bên cạnh đó, nhiều bằng chứng cho thấy có sự liên quan mật thiết giữa những chủng sinh sắc tố và khả năng tạo carotenoid. Carotenoid tập trung chủ yếu ở màng tế bào và đóng một vai trò quan trọng trong đời sống của vi khuẩn. Chúng có tác dụng ổn định màng lipid và làm giảm tính lỏng của màng để tế bào vững chắc, nhờ đó bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi sự phá hủy của ánh sáng và các biến đổi nhiệt độ. Vì vậy, các sắc tố này rất cần thiết cho các chủng Bacillus sống trong môi trường khắc nghiệt(4,5). Việc sản xuất carotenoid ở vi khuẩn phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau. Để tăng hiệu quả tổng hợp carotenoid, có thể tối ưu hóa các thành phần của môi trường lên men như: nguồn carbon, nguồn nitrogen, bổ sung các hợp chất hóa học, ion kim loại, muối hoặc các điều kiện lên men (ánh sáng, nhiệt độ, pH) và thời gian thu nhận carotenoid tối ưu(4). Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát thời điểm thích hợp để thu nhận carotenoid đối với tế bào sinh dưỡng của các chủng Bacillus nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất carotenoid. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chủng vi khuẩn: 6 chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: DD1.1 (B. marisflavi), HC28 (B. vietnamensis), AT14 (B. infantis), AT22 (B. licheniformis), HU36 (B. indicus) và CG17.0 (B. firmus). Những chủng này có khả năng tạo sắc tố và được phân lập từ môi trường biển và ao tôm ở Việt Nam bởi Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, ĐH Y Dược TP.HCM. Hóa chất: TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar), methanol, chloroform, acetonitril: của Merck, Đức. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 213 Carotenoid chuẩn (astaxanthin, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin, và β-caroten): của Sigma. Phương pháp Xây dựng đường cong tăng trưởng và xác định hàm lượng carotenoid Hoạt hóa các chủng vi khuẩn 37oC qua đêm trên TSB. Cấy 1% (v/v) chủng vào 100 ml TSB vào các erlen 250 ml, điều chỉnh pH và nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Xây dựng đường cong tăng trưởng (tiến hành trên 1 erlen): mỗi giờ lấy mẫu 1 lần, đo OD, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn, đồng thời xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng cách đếm sống. Hàm lượng carotenoid: cứ 6 giờ lấy 2 erlen đem ly tâm, đông khô và tiến hành chiết carotenoid, chạy HPLC để xác định hàm lượng carotenoid. Sau khi đã xác định được khoảng thời gian sinh carotenoid tối ưu, tiến hành lập lại thí nghiệm với khoảng thời gian lấy mẫu xác định hàm lượng carotenoid là 2 giờ để xác định chính xác thời gian thu carotenoid tối ưu. Tiến hành đo OD và xác định mật độ tế bào và xác định hàm lượng carotenoid cho đến khi giá trị OD đo được giảm (mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy giảm). Xác định thời gian thế hệ Phương trình tuyến tính (y = a + kx) được tính từ phần tuyến tính trên đường cong tăng trưởng của vi sinh vật sẽ giúp xác định tốc độ phát triển (k) của vi sinh vật trên giờ. Trong đó, y là giá trị log10 của số khuẩn lạc trên một ml (CFU/ml), x là thời gian nuôi cấy tính theo giờ. Hệ số góc k của phương trình tuyến tính là tốc độ phát triển của vi sinh vật (log10/ giờ). Thời gian thế hệ G (giờ) của vi sinh vật được tính theo phương trình G = lg2/k(6). Phương pháp chiết carotenoid Sinh khối Bacillus sau khi đông khô nghiền mịn, cân chính xác 100 mg cho vào 3 ml dung môi methanol:chloroform (1:2). Tán siêu âm trong 20 phút để phá vỡ tế bào, ủ trong đá 10 phút. Thêm đồng lượng nước, vortex mạnh. Ly tâm 10000 g trong 10 phút. Sau khi chiết, hỗn dịch sẽ chia thành 2 lớp nhưng chỉ có lớp dịch chiết ở dưới có màu sẽ được chọn để tiến hành phân tích bằng HPLC. Lớp trên được chiết lại với chloroform (đến khi cắn không còn màu). Làm khô dịch chiết đến cắn và bảo quản ở -20oC đến khi phân tích HPLC(5,8). Phân tích carotenoid bằng HPLC Carotenoid được phân tích bằng HPLC với hệ thống Knauer (Đức). Dịch chiết carotenoid từ vi khuẩn lọc qua màng lọc Teflon 0,45 μl. Tiến hành sắc ký trên cột pha đảo Eurospher RP 18 (5μm, 150x 4,6 mm), thể tích bơm mẫu 20 μl. Dung môi pha động là acetonitrile:methanol (70:30), tốc độ dòng 1 ml/ phút. Bước sóng phát hiện ở 450 nm (bước sóng dùng để phát hiện carotenoid). Loại carotenoid được xác định thông qua thời gian lưu khi so sánh với các carotenoid chuẩn. Xây dựng đường chuẩn của canthaxanthin để xác định hàm lượng carotenoid. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đường cong tăng trưởng Tốc độ phát triển và thời gian thế hệ của các chủng vi khuẩn được mô tả như Bảng 1. Hệ số tương quan của các phương trình tuyến tính cao (R2) chứng tỏ mô hình tuyến tính sử dụng thích hợp để đánh giá sự phát triển của các chủng Bacillus(12). Bảng 1. Thời gian thế hệ và các đặc tính phát triển của 6 chủng Chủng Tốc độ phát triển (log10h-1) Thời gian thế hệ (h) R2 Pha ổn định* (h) DD1.1 0,329 0,914 0,968 13-48 AT14 0,346 0,870 0,956 13-34 HU36 0,245 1,232 0,982 16-52 AT22 0,291 1,033 0,981 10-44 CG17.0 0,264 1,140 0,964 10-30 HC28 0,251 0,023 1,199 13,088 0,969 0,979 08-22 30-45 * Thời gian từ T0 Trong số những chủng này, AT14 và DD1.1 có tốc độ phát triển nhanh hơn những chủng khác, 0,346 và 0,329 h-1, chỉ sau 2 giờ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 214 nuôi cấy đã đạt pha lũy thừa. Ngược lại, HU36 có tốc độ phát triển chậm (0,245 h-1) và thời gian thế hệ dài hơn những chủng khác (1,23 h); thêm vào đó, HU36 phải sau 7 h nhân giống mới đạt pha lũy thừa. Chủng HC28 có hai pha lũy thừa, pha lũy thừa đầu từ 2 đến 10 h, và pha lũy thừa thứ hai kéo dài từ 22 đến 30 h, nhưng pha lũy thừa 2 có tốc độ phát triển thấp (0,023 h-1) khi so với pha lũy thừa 1 (0,251 h-1). Kết quả còn cho thấy các chủng Bacillus này đều có pha ổn định dài từ 20 đến 36 h; ví dụ như pha ổn định của Bacillus firmus là 20 h, từ 10 đến 30 h; của AT22 là 34 h, từ 10 đến 44 h; và của AT14 là 36 h, từ 16 đến 52 h. Sau đó sự phát triển của vi khuẩn bắt đầu giảm, do sự cạn kiệt của thành phần môi trường. Hàm lượng carotenoid Sắc ký đồ của các carotenoid chuẩn như trong Hình 1. Thời gian lưu của astaxanthin, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin và β-carotene là 3,9 phút, 6,6 phút, 7,5 phút, 10,1 phút, và 32 phút. Tất cả các carotenoid đều có đỉnh trong dải phổ UV với độ hấp thu cực đại (λmax) tại 478 nm, 445 nm, 452 nm, 470 nm, và 450 nm 1 0 10 20 30 100 400 200 0 Thời gian (phút) Đ ộ hấ p th u (m A U ) 2 3 4 5 Hình 1. Thời gian lưu của carotenoid chuẩn 1. astaxanthin; 2. lutein; 3. zeaxanthin; 4. canthaxanthin; 5. β-carotene Phổ hấp thu của sáu loại dịch chiết sắc tố của vi khuẩn đều có đỉnh trong vùng bước sóng từ 400 to 600 nm, dãy phổ hấp thu của carotenoid. Bên cạnh đó, kết quả khảo sát khả năng chống oxi hóa của 6 loại dịch chiết đều cho thấy khả năng dập tắt gốc tự do cao từ 85 – 90 % (không trình bày dữ liệu). Vì vậy 6 chủng vi khuẩn này đều có khả năng sinh carotenoid. 0 5 40 20 10 10.1 5.1 0 10 20 30 40 Đ ộ hấ p th u (m A U ) Time (min) 0 25 100 75 50 7.5 5.1 0 25 100 75 50 9.9 5.1 0 50 200 150 100 8.1 3.9 8.1 a b c d 0 10 20 30 40 3.0 3.9 10 40 20 0 Time (min) 0 5 40 20 10 8.1 3.9 e f 0 10 20 30 40 2 8 4 0 g Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết carotenoid từ các chủng Bacillus ở 450nm a: DD1.1; b: HU36; c: HC28; d: AT14; e: CG17.0, f: AT22; g: chủng không sinh carotenoid B. subtilis PY79. Chủng B. subtilis PY79 không sinh sắc tố được sử dụng làm đối chứng trong thí nghiệm. Sắc ký đồ carotenoid của 6 chủng Bacillus so sánh với chủng đối chứng PY79 như trong Hình 2. Sắc ký đồ của các chủng nghiên cứu có đỉnh hấp thu ở 450 nm, vùng hấp thu của carotenoid, trong khi sắc ký đồ carotenoid của chủng Bacillus subtilis PY79 cho thấy không có sự hiện diện của carotenoid. Kết quả HPLC còn cho thấy tất cả các dịch chiết sắc tố đều Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 215 thuộc nhóm xanthophyl thời gian lưu từ 3,9 phút đến 10 phút. Hình 2 (a) thể hiện dữ liệu của DD1.1 với 2 loại carotenoid, tương ứng với 2 thời gian lưu là 5,1 và 10,1 phút. Carotenoid với thời gian lưu 10,1 phút được xác định là canthaxanthin khi so với chất chuẩn. HU36 và HC28 có đỉnh chính với thời gian lưu là 5,1 phút, và HU36 còn có một đỉnh phụ ở 7,5 phút, trong khi HC28 có 2 đỉnh khác ở 8,1 và 9,9 phút (Hình 2(b), 2(c)). Dịch chiết của AT14 có các đỉnh chính ở thời gian lưu là 8,1 phút, và một đỉnh phụ với thời gian lưu là 3,9 phút là astaxanthin (Hình 2(d)). Trong khi, CG17.0 và AT22 có đỉnh chính là astaxanthin với thời gian lưu là 3,9 phút (Hình 2(e), 2(f)). Bên cạnh đó, 2 chủng này còn có carotenoid khác với thời gian lưu là 8,1 và 3,0 phút, điều này có thể do sự khác biệt về màu sắc của các chủng này. DD1.1 0 50 100 150 200 250 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 5.1 RT 10.1 TC Cells AT14 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 6 12 18 24 30 36 42 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 3.9 RT 8.1 TC Cells HU36 0 50 100 150 200 250 300 350 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 5.1 RT 7.5 TC Cells CG17.0 0 50 100 150 200 250 300 0 6 12 18 24 30 36 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 8.1 RT 3.9 TC Cells AT22 0 100 200 300 400 500 600 700 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 3.0 RT 3.9 TC Cells HC28 0 100 200 300 400 500 600 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Time (h) C ar ot en oi d (u g/ g D W ) 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lo g 10 (C FU /m l) RT 5.1 RT 9.8 RT 8.1 TC Cells C ar ot en oi d( μg /g S K K ) C ar ot en oi d( μg /g S K K ) C ar ot en oi d( μg /g S K K ) C ar ot en oi d( μg /g S K K ) C ar ot en oi d( μg /g S K K ) C ar ot en oi d( μg /g S K K ) Thời gian (h) Thời gian (h) Thời gian (h) Thời gian (h) Thời gian (h) Thời gian (h) Tế bào Tế bào Tế bào Tế bào Tế bào Tế bào Hình 3. Lượng carotenoid tạo ra theo thời gian RT: Thời gian lưu, TC: Tổng carotenoid Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 216 Sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid và đường cong tăng trưởng được xác định trong từng thời điểm phát triển của vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo carotenoid ở các chủng vi khuẩn đều có liên quan với pha tăng trưởng lũy thừa nhưng tùy theo từng chủng vi khuẩn mà thời điểm đạt hàm lượng carotenoid cao nhất khác nhau (Hình 3). Đối với chủng DD1.1, carotenoid tạo ra sau 6 giờ nuôi cấy, làm dịch môi trường có màu vàng nhạt. Màu vàng sẽ tăng cùng với sinh khối trong pha lũy thừa. Khi đó, hàm lượng carotenoid tăng đến cực đại (225 μg/g SKK – sinh khối khô) sau 18 h nuôi cấy vào đầu pha ổn định và duy trì đến cuối pha ổn định. Tương tự, nồng độ carotenoid cực đại của chủng AT14 (740 μg/g SKK) được quan sát trong 18h ở đầu pha ổn định. Đối với HU36, carotenoid được tích lũy trong pha lũy thừa và tiếp tục tăng trong pha ổn định và đạt cực đại (320 μg/g SKK) vào cuối pha ổn định (sau 42 h). Ngược lại, đối với chủng CG17.0 và AT22, hàm lượng carotenoid tăng rất chậm khi tế bào đi vào pha lũy thừa nhưng khi sinh khối tế bào vào pha ổn định, thì sự tích lũy carotenoid tăng nhanh và đạt cực (257 và 572 μg/g SKK) vào giữa pha này. Sau đó, hàm lượng carotenoid giảm nhẹ và duy trì đến cuối phase ổn định. Trong trường hợp của chủng HC28, từ pha đầu lũy thừa đầu đến giữa pha ổn định, tế bào tăng dần nhưng không tích lũy carotenoid. Sự tích lũy carotenoid diễn ra sau 16 h nuôi cấy và đạt cực đại (543 μg/g SKK) sau 30 h nuôi cấy (vào đầu pha ổn định thứ 2). Sau khi xác định sơ bộ khoảng thời gian sinh carotenoid cực đại của từng chủng vi khuẩn, thí nghiệm được tiến hành lặp lại với khoảng thời gian lấy mẫu được chia nhỏ hơn để xác định chính xác thời điểm sinh caortenoid. Kết quả được thể hiện trong bảng 2. Nhìn chung, hàm lượng carotenoid tích lũy trong những chủng này đạt cực đại vào cuối pha lũy thừa hoặc trong pha ổn định của tế bào. Do đó, chúng ta có thể thu nhận carotenoid đạt cao nhất cùng với thời điểm sinh khối tế bào đạt cực đại. Bảng 2. Thời gian carotenoid đạt cao nhất của 6 chủng Bacillus Chủng Carotenoid dự đoán Hàm lượng carotenoid (μg/g SKK) Thời gian (h) * DD1.1 Canthaxanthin 225 16 – 18h AT14 Xanthophyl 745 22 – 24h HU36 Xanthophyl 320 44 – 46h AT22 Astaxanthin 572 24 – 26h CG17.0 Astaxanthin 257 24 – 26h HC28 Xanthophyl 543 28 – 30h * Thời gian đạt carotenoid cao nhất. Bàn luận Trong nghiên cứu này, đặc điểm sinh trưởng của các chủng Bacillus sinh carotenoid được khảo sát. Trong số các chủng vi khuẩn, chỉ có 2 chủng B. firmus và B. licheniformis đã được nghiên cứu trước đó. Michael và cộng sự đã khảo sát thời gian thế hệ của chủng B. firmus môi trường cơ bản và xác định được thời gian thế hệ trong khoảng từ 0,616 h đến 0,900 h tại 30oC, ở pH 7,5 đến 8,5, nhanh hơn thời gian thế hệ của CG17.0 - B. firmus trong nghiên cứu này (1,140 h). Điều này có thể do các loại khoáng trong môi trường là cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Tương tự, Akhtar và cộng sự(1) đã khảo sát chủng B. licheniformis PBT-7 được phân lập tại mỏ muối Khewra của Pakistan và xác định được thời gian thế hệ là 1,2 h trên môi trường LB, tương tự với chủng AT22 - Bacillus licheniformis trong nghiên cứu của chúng tôi (1,033 h). Tuy nhiên, khi nuôi cấy trên môi trường giàu glucose, chủng Bacillus này có thời gian thế hệ ngắn hơn 0,67 h. Với các chủng B. indicus, B. marisflavi, B. vietnamensis và B. infantis, các đặc tính về sinh lý và sinh hóa đã được khảo sát(10,11,15), nhưng đây chỉ