Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano của Rutin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 559 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CỦA RUTIN Trương Công Trị*, Khưu Mỹ Lệ*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano của rutin. Phương pháp nghiên cứu: Tạo nhũ tương và đồng nhất hóa với thiết bị Ultra-Turrax và siêu âm. Kích thước và dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân được chụp với kính hiển vi điện tử truyền qua và nhiễu xạ laser. Định lượng rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao detector PDA, bước sóng 255 nm. Kết quả: Đã xây dựng công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano rutin bằng phương pháp đã nêu trên. Bằng thiết bị TEM và LB 550, đã đo đạc được kích thước và dãy phân bố kích thước hạt là từ 66,6 nm đến 339,3 nm. Lượng hoạt chất được nhũ hóa chiếm 1,3% so với tổng lượng lipid. Kết luận: Kết quả cho thấy có thể bào chế tiểu phân nano rutin bằng phương pháp tạo nhũ tương và đồng nhất hóa với thiết bị Ultra-Turrax và siêu âm. Từ khóa: Rutin, tiểu phân nano, TEM. ABSTRACT FORMULATION OF RUTIN LIPID NANOPARTICLES Truong Cong Tri, Khuu My Le, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 559 - 564 Objectives: The aim of the study was to prepare rutin lipid nanoparticles. Methods: Rutin nanoparticles were prepared by emulsification and homogenization with Ultra-Turrax and ultrasound. Particle size and distribution were analysed by transmission electron micrography and laser diffraction. HPLC was used to determine the quantity of rutin at a wavelength of 255 nm. Results: Nanoparticles were successfully prepared by emulsification and homogenization. The particle size and distribution ranged from 66,6 nm to 339,3 nm. Quantity of emulsified rutin is about 1,3% of total lipid. Conclusions: The present results provided evidence that rutin nanoparticles could be prepared by emulsification and homogenization with Ultra-Turrax and ultrasound. Keywords: Rutin, nanoparticles, TEM. ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều hoạt chất có tác dụng trị liệu nhưng ít tan nên sinh khả dụng kém. Nồng độ thuốc trong máu không ổn định cũng là một yếu tố làm thay đổi hiệu quả điều trị. Vấn đề cải thiện sinh khả dụng và kiểm soát tốc độ phóng thích hoạt chất để nâng cao hiệu quả điều trị, giảm tác dụng phụ là điều rất cần thiết. Từ đó, các cải tiến về kỹ thuật bào chế, nhất là việc sử dụng chất mang có kích thước rất nhỏ, hệ tiểu phân nano, đã được nghiên cứu. Lợi thế của tiểu phân nano là chúng đóng vai trò như một hệ thống phân phối, mang các hoạt chất kém tan trong nước vượt qua hàng rào sinh học của cơ thể(1). Hơn nữa, khi kích thước giảm đi, độ tan của các hoạt chất kém tan được cải thiện đáng kể(3). Ngoài ra, tiểu phân nano còn có thể kiểm soát tốc độ phóng thích theo thời gian nên hạn chế được tình trạng nồng độ hoạt chất trong huyết tương không ổn định. Hệ tiểu phân nano lipid đang *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vnn.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 560 thu hút sự chú ý của các nhà khoa học nhờ lợi thế có thể dễ dàng nâng cỡ lô trên quy mô công nghiệp(4,6), ít độc tính(7) và kiểm nghiệm được các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm(5). Nhằm bước đầu ứng dụng kỹ thuật mới trong bào chế dược phẩm, nhất là đối với dược phẩm chứa hoạt chất kém tan từ dược liệu, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano của rutin”. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài nhằm bào chế hệ tiểu phân nano của rutin và phân tích các tính chất của tiểu phân bằng các thiết bị phù hợp. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Nguyên vật liệu Rutin (Ban NCKH, Việt Nam), hỗn hợp acid capric và acid caprylic (Labrafac CC - Gattefossé - France), glycerin behenat (Compritol - Gattefossé - France), stearoyl macrogolglycerid (Gelucire - Gattefossé - France), phosphatidylcholin (Lipoid GMBH - Germany) và các dung môi, hóa chất cần thiết khác đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trang thiết bị Máy đồng hóa (Ultra-Turrax - Germany), bể siêu âm (Sonorex - Germany), kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1400 - Jeol - Japan), máy đo phân bố kích cỡ hạt (LB 550 - Horiba Jobin Yvon - Mỹ), máy HPLC (Shimadzu LC-10AD - Nhật). Phương pháp nghiên cứu Thiết lập công thức Tiến hành xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp tạo nhũ tương và đồng hóa bằng thiết bị Ultra-Turrax và siêu âm(2,9). Khảo sát thành phần công thức, từ đó chọn công thức phù hợp nhất để nang hóa rutin. Quy trình bào chế Hòa tan các chất hoạt động bề mặt vào nước ở 70oC, khuấy pha nước bằng Ultra-Turrax với tốc độ 10.000 vòng / phút (5 phút). Đun pha dầu lên 70oC, phối hợp pha dầu vào pha nước bằng Ultra-Turrax với tốc độ 10.000 vòng / phút (5 phút). Tăng tốc độ khuấy lên 20.000 vòng/phút (5 phút), tiếp tục siêu âm nhũ tương (5 phút). Kết tinh hạt bên trong tiểu phân ở nhiệt độ phòng (30oC)(8). Đánh giá một số tính chất của tiểu phân Sự phân bố kích cỡ hạt Tiến hành xác định dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân theo phương pháp nhiễu xạ laser. Phân tích sau khi bào chế mẫu 24 giờ. Nhiệt độ phân tích là 25oC. Dựa vào biểu đồ, xác định kiểu phân bố kích thước, dãy phân bố kích cỡ, kích thước trung bình của tiểu phân và giá trị các thông số d50, d75, d90. Kích thước và hình thể học của tiểu phân Tiểu phân sau khi bào chế sẽ được đo kích thước thực tế và khảo sát hình thể học bằng TEM để đánh giá hình dạng và cấu trúc bên trong tiểu phân. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ và thời gian khuấy đến kích thước tiểu phân theo mô hình yếu tố đầy đủ và tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box–Wilson. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát một số tính chất của rutin Trước khi thiết lập công thức, tiến hành khảo sát tính tan của rutin trong tá dược (dầu) và trong một số dung môi. Kết quả cho thấy rutin tan một phần trong tá dược dầu và tan tốt trong methanol, ethanol so với dung môi nước. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký rutin Máy HPLC Shimadzu LC – 10AD Cột: X.Terra LC 18 (250 mm x 4,6 mm), cỡ hạt: 5 µm, tiền cột Supelcosil Pha động: CH3CN- H2O (36: 64) Detector PDA, bước sóng phát hiện: 255 nm. Nhiệt độ cột: 25 - 30oC Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 561 Tốc độ dòng: 0,52 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 30 µl Kết quả thiết lập công thức Thành phần công thức bào chế được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano Thành phần Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Công thức 4 Labrafac CC (g) 20 15 10 5 Compritol (g) 0 5 10 15 Thành phần khác vđ (g) 100 Cảm quan của nhũ tương Nhũ tương lỏng, trắng đục như sữa, không tách lớp Nhũ tương lỏng nhưng đặc hơn CT1, trắng đục như sữa Nhũ tương đặc, mịn, trắng đục như sữa, đồng đều Nhũ tương đặc, mềm, mịn, trắng đục như sữa, đồng đều Độ bền của nhũ tương Sau một tuần nhũ tương vẫn bền Tách lớp sau 2 ngày bảo quản ở 30oC Tách lớp sau 1 ngày để nguội ở 30oC Tách lớp ngay sau khi để nguội ở 30oC Khi điều chế nhũ tương theo công thức chỉ có lipid dạng lỏng và chưa phối hợp hoạt chất, kết quả thu được hệ tiểu phân rất ổn định, bền sau 4 tháng bảo quản ở nhiệt độ mát. Tuy nhiên, đối với các công thức có phối hợp lipid dạng rắn, nhũ tương được tạo thành chưa ổn định và nhanh chóng bị tách lớp sau vài ngày điều chế. Ở dạng lỏng, các lipid chuỗi carbon dài có cấu trúc linh động đan xen vào nhau nhưng khi chuyển sang dạng rắn, chúng có xu hướng duỗi thẳng hàng, đẩy lipid lỏng (và hoạt chất) ra khỏi tiểu phân làm tiểu phân kém bền, hiện tượng tách lớp sẽ xảy ra. Điều đặc biệt lưu ý đối với các lipid dạng rắn, khi nhiệt độ môi trường thấp hơn nhiệt độ tan chảy của chúng (khoảng 5oC) thì chúng lập tức trở về trạng thái rắn nên việc kiểm soát nhiệt độ trong lúc điều chế phải hết sức chặt chẽ. Quá trình điều chế phải tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của lipid rắn từ 5 - 10oC. Vì những lý do trên, các công thức 2, 3 và 4 bị loại bỏ. Công thức 1 với lipid dạng lỏng chiếm 20% được chọn để nang hóa rutin (hình 1). Hình 1. Hình ảnh và kích thước tiểu phân nano chụp bằng TEM Kết quả khảo sát công thức có phối hợp rutin Kết quả khảo sát công thức có phối hợp rutin được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Kết quả khảo sát công thức nang hóa rutin với các hàm lượng khác nhau Công thức 5 6 7 8 9 10 11 12 Lượng rutin (mg) 100 200 300 350 400 450 500 550 Cảm quan Nhũ tương lỏng, mịn, trắng đục như sữa, màu sắc đồng đều. Độ bền của nhũ tương (sau 2 tuần bảo quản ở 30oC và 20oC) Không có rutin lắng xuống đáy, không tách lớp, đạt yêu cầu cảm quan Có rutin lắng xuống đáy (ít), không tách lớp, đạt yêu cầu về cảm quan Có rutin lắng xuống đáy, không tách lớp, đạt yêu cầu cảm quan Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 562 Như vậy, hàm lượng rutin phối hợp vào công thức nhỏ hơn hoặc bằng 300 mg. Hình 2. Hình thể học và kích thước tiểu phân của công thức 7 chụp bằng TEM Kết quả khảo sát từ TEM cho thấy rutin được nang hóa trong lõi tiểu phân và có kích thước khoảng 200 nm (hình 1). Điều này hoàn toàn phù hợp với mục tiêu bào chế vì dạng hòa tan có thể cho tác dụng nhanh nhưng dạng kết tinh sẽ giúp kéo dài tác dụng của tiểu phân nano. Công thức cơ bản Labrafac CC.........................20% Rutin .....................................0,3% Chất diện hoạt 1 .................x% Chất diện hoạt 2 .................y% Nước cất vừa đủ.................100 g Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ và thời gian khuấy đến kích thước tiểu phân Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả được trình bày trong bảng 3. Phương trình hồi quy thực nghiệm: y = 350 –75x1 –50x2 Dựa vào phương trình hồi quy, hệ số bi mang dấu âm, như vậy, có khả năng hai yếu tố này có ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân và tương quan theo chiều nghịch, nghĩa là khi gia tăng tốc độ và thời gian khuấy thì kích thước tiểu phân sẽ giảm. Bảng 3. Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả N xo x1 x2 yu 1 1 1 1 250 2 1 -1 1 350 3 1 1 -1 300 4 1 -1 -1 500 bi 350 -75 -50 Kết quả đánh giá ý nghĩa của các hệ số hồi quy (bảng 4) Bảng 4. Kết quả đo kích thước hạt của 6 TN ở điều kiện cơ bản X1 X2 yu 6 20000 250 6 20000 300 6 20000 250 6 20000 300 6 20000 200 6 20000 250 yuTB 258,33 Ttn của các hệ số bi lần lượt là 6,45 và 3,2. Tra bảng student, Tlt (0,05,5) = 2,57 < 3,2. Do đó, cả hai hệ số bi đều có ý nghĩa. Như vậy, tốc độ và thời gian khuấy càng tăng, kích thước hạt càng giảm. Vấn đề là tăng đến mức độ nào để thu được tiểu phân có kích thước khoảng 100 - 200 nm trong điều kiện cho phép của máy móc thiết bị. Kết quả thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box–Wilson (bảng 5). Kết quả từ TEM cho thấy thí nghiệm 5 và thí nghiệm 6 có kích thước tiểu phân khoảng 200 nm, phù hợp với yêu cầu của tiểu phân nano. Tuy nhiên, ở thí nghiệm 6, thời gian và tốc độ khuấy đều cao hơn thí nghiệm 5 nên chọn điều kiện tối ưu là thí nghiệm 5 với thời gian khuấy 7,0 phút và tốc độ khuấy 20.750 vòng/phút. Bảng 5. Thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng N X1 X2 yu X0i 6,0 20000 250 5 7,0 20750 200 6 8,0 21500 200 7 9,0 22250 250 8 10,0 23000 300 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 563 Kết quả thực nghiệm kiểm chứng điều kiện tối ưu Kết quả xác định kích thước tiểu phân của 03 mẫu cùng công thức và điều kiện (thời gian khuấy 7,0 phút và tốc độ khuấy 20750 (vòng / phút) bằng TEM cho thấy kích thước tiểu phân của cả 03 mẫu đều ở khoảng 200 nm (hình 3). Hình 3. Kích thước và hình ảnh tiểu phân của TN kiểm chứng chụp bằng TEM Đánh giá tính chất của tiểu phân Kết quả đánh giá tính chất của tiểu phân nano nang hóa rutin (bảng 6). Bảng 6. Kết quả đánh giá tính chất của tiểu phân nano nang hóa rutin Tính chất Mô tả Cảm quan Quan sát bằng mắt thường, nhũ tương ở dạng lỏng, trắng đục và đồng nhất giống như sữa. Kích thước và dãy phân bố kích cỡ Kích thước trung bình của tiểu phân: 190,1 nm Dãy phân bố kích thước: 66,6 nm - 339,3 nm Mode: 117,4 nm. Trung vị: 106,7 nm d50, d75, d90: lần lượt bằng 114,5 nm; 172,1 nm; 339,3 nm Hình thể học Tiểu phân có hình cầu, bờ đều, phân tán đồng nhất, không kết tụ, trong lõi chứa rutin. Định lượng Hàm lượng rutin trong mẫu bào chế: 260,23 mg. Độ ổn định Mẫu không nang hóa rutin: Quan sát bằng mắt thường, sau 04 tháng hệ tiểu phân có dạng lỏng, trắng đục và đồng nhất giống như sữa, không tách lớp, không kết bông. Mẫu nang hóa rutin: Quan sát bằng mắt thường, sau 03 tháng hệ tiểu phân có dạng lỏng, trắng đục và đồng nhất giống như sữa, không tách lớp, không kết bông. Biểu đồ phân bố kích cỡ Hình 4. Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân điều chế từ công thức 7 Hình 5. Sắc ký đồ rutin trong mẫu bào chế Theo kết quả tính toán, hàm lượng trung bình của rutin là 260,23 mg trong 100 g công Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 564 thức. Nếu so với tổng lượng lipid thì rutin chiếm khoảng 1,3%. Kết quả thẩm định quy trình định lượng rutin trong công thức bằng HPLC cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống (RSD mẫu chuẩn và thử lần lượt là 1,67 và 1,12), khoảng nồng độ tuyến tính từ 12,5 - 125 μg/ml (R2 = 0,9975), có độ chính xác cao với RSD% = 0,92% và tỉ lệ phục hồi trung bình là 100,1% ± 1,0%. KẾT LUẬN Bằng phương pháp tạo nhũ tương và đồng hóa với thiết bị Ultra-Turrax và siêu âm, đề tài đã điều chế thành công tiểu phân nano nang hóa rutin. Hỗn hợp acid capric và caprilic được sử dụng trong công thức là một tá dược dầu phù hợp để hòa tan và nang hóa rutin. Đây là kết quả bước đầu rất khả quan và cũng là nền tảng để nghiên cứu sâu hơn nhằm ứng dụng kỹ thuật mới trong bào chế các chế phẩm chứa hoạt chất rutin có tác dụng điều trị bệnh lý về tĩnh mạch. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bunjes H. (2005), “Characteration of solid lipid nano - and micropartical”, CRC Press LLC, 42 - 58. 2. Hu F.Q., Zhang Y., Du Y.Z., Yuan H. (2007), “Nimodipine loaded lipid nanospheres prepared by solvent diffusion method in a drug saturated aqueous system”, International Journal of Pharmaceutics, 1 - 7. 3. Mauludin R., Müller H.R., Keck M.C. (2008), “Kinetic solubility and dissolution velocity of rutin nanocrystals”, European Journal of Pharmaceutical Sciences 36, 503 – 504. 4. Müller R.H., Radtke M., Wissing S.A. (2002), “Solid lipid nanoparticals and nano structured lipid carriers in cosmetic and dermatological preparations”, Advanced Drug Delivery Reviews 54, pp. 133 - 141. 5. Müller R.H., Radtke M., Wissing S.A. (2007), “Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs”, International Journal of Pharmaceutics 242, 121 -128. 6. Radtke M., Muller R.H., Nanostructured lipid drug carriers, Nanotechnology, 48 - 52. 7. Traul K.A., Driedger A., Ingle D.L., Nakhasi D. (2000), “Review of the toxicologic properties of medium - chain triglycerides”, Food and chemical toxicology 38, pp.79 - 98. 8. Xia Q., Hao X., Lua Y., Wei X., Wei H., Mab Q.H., Gua N. (2007), “Production of drug-loaded lipid nanoparticles based on phase behaviors of special hot microemulsions”, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 1 - 4. 9. Yuan H, Wang L.L., Doo Y.Z., You J., Hu F.Q., Zeng S. (2007), “Preparation and characteristics of nanostructured lipid carriers for control - releasing progesterone by melt emulsification”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2-3.