Nghiên cứu tác dụng kháng virus Herpes simplex (HSV) của cao chiết hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 313 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) CỦA CAO CHIẾT HẠ KHÔ THẢO (PRUNELLA VULGARIS L.) Đào Thị Kim Đính*, Huỳnh Thị Kim Loan**, Trần Thu Hoa***, Trần Công Luận* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng virus herpes týp 1 và týp 2 của các cao chiết từ Hạ khô thảo thu hái ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV. Phương pháp: Chiết cao toàn phần, tách phân đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo. Nhuộm tế bào Vero với xanh methylen và đo mật độ quang ở bước sóng 620 nm, so sánh tế bào Vero tiếp xúc/không tiếp xúc với các cao chiết, tế bào Vero không nhiễm virus và tế bào Vero nhiễm virus để xác định độc tính trên tế bào của các cao chiết và khả năng kháng virus. Kết quả: Ba loại cao đạt tiêu chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III. Cao toàn phần cùng các phân đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo có tác dụng ức chế HSV tốt với chỉ số hệ số chọn lọc CC50/ IC50 đối với HSV-1 và HSV-2 từ 16,29 đến 28,08. Như vậy, cả ba loại cao đều có ý nghĩa trong trị liệu (có hệ số chọn lọc >10). Kết luận: Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng minh có tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2, có thể được sử dụng để làm thuốc kháng herpes hiệu quả. Từ khóa: Hạ khô thảo, kháng herpes, HSV-1 và HSV-2. Chữ viết tắt: CC, nồng độ gây độc; CC50, liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy; IC50, nồng độ ức chế 50% tế bào nuôi cấy; HSV, Herpes simplex virus; CPE, bệnh tích tế bào; SI, hệ số chọn lọc; TCID50, liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy. ABSTRACT STUDY ON IN VITRO ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY OF EXTRACTS FROM VIETNAMESE MEDICINAL HERB PRUNELLA VULGARIS L. Dao Thi Kim Dinh, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa, Tran Cong Luan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 313 - 317 Objective: To investigate the in vitro antiherpetic activity of extracts from Prunella vulgaris. Methods: Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples by comparison untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2. Antiviral activity was finally expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50). Results: Prepare water extract, ethyl acetate fraction and aqueous fraction from Prunella vulgaris L.. All three extracts exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 16.29 to 28.08. Conclusion: Extracts from Prunella vulgaris L. are potential antiherpetic agents as herbal products. Keywords: Prunella vulgaris L., Antiherpetic, HSV-1, HSV-2. Abbreviation: CC, cytotoxic concentration; CC50, 50% cytotoxic concentration; CPE, cytopathic effect; IC50, 50% Inhibitory concentration; HSV, Herpes simplex virus; SI, selectivity index, TCID50, 50% tissue culture infectious dose. *Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM **Viện Pasteur Tp. HCM ***ĐH. Y Dược Tp. HCM Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận ĐT: 0903671323 Email: congluan53@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 314 ĐẶT VẤN ĐỀ Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L. Lamiaceae) mọc ở một số vùng núi cao từ 1000 m trở lên củaViệt Nam, như Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mường Khương, Bát Sát, Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ (Hà Giang); Sìn Hồ, Tủa Chùa (Lai Châu); Mù Cang Chải (Yên Bái)(7). Thành phần hóa học của Hạ khô thảo gồm có các acid triterpenoic, flavonoid, các phenolic và diterpen. Các chất tan trong nước của Hạ khô thảo có tác dụng hạ huyết áp ổn định, kháng đột biến và an thần. Khả năng kháng virus herpes bởi một polysaccharid tách từ Hạ khô thảo đặc biệt được quan tâm(3). Ngoài ra, tanin (polyphenol) chiết từ Hạ khô thảo có tác dụng kháng HIV cũng đã được chứng minh(5). Virus Herpes simplex (HSV) là tác nhân gây bệnh rất thường gặp, gây các bệnh khác nhau từ nhẹ đến nặng, trong một số trường hợp chúng có thể gây tử vong. Các thuốc nucleosid dùng điều trị nhiễm HSV thường có hiệu quả trong điều trị nhiễm HSV ban đầu hoặc là tái nhiễm, tuy nhiên việc sử dụng tràn lan các thuốc này đã làm nảy sinh các chủng HSV đề kháng với các thuốc tương đồng, đặc biệt là ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch. Tìm thuốc mới có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng kháng virus mà ít độc đang được quan tâm, trong đó Hạ khô thảo cũng được nghiên cứu theo hướng này(3,6,9). Báo cáo này của chúng tôi nhằm chứng minh tác dụng ức chế HSV của cao toàn phần, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo chưa được khảo sát ở Việt Nam. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu - Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.) được thu hái tại Phó Bảng, Hà Giang và được định danh bởi Nguyễn Tập – Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Hình 1). Nguyên liệu được xác định độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không tan trong acid theo DĐVN III. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật bằng phương pháp của trường đại học dược Rumani có cải tiến. Hình 1. Cành mang hoa tươi và cụm quả khô Hạ khô thảo. - Chiết xuất dược liệu: 100 g bột dược liệu được đun hồi lưu 3 lần với nước ở 1000C trong 1 giờ mỗi lần theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:nước). Dịch nước được cô cách thủy đến dạng cao đặc (10,8% độ ẩm). Dùng 10 g cao toàn phần hòa trong nước cất và lắc chiết phân đoạn bằng kỹ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 315 thuật lỏng – lỏng với các dung môi từ ít phân cực đến phân cực thu được lần lượt các phân đoạn ethyl acetat, n-butanol và nước. - Acyclovir (Sigma). - HSV týp 1 và HSV týp 2 từ bệnh phẩm được phân lập, định danh và lưu trữ tại Viện Pasteur Tp.HCM. - Tế bào Vero CCL-81 (ATCC), được nuôi cấy trong môi trường CMRL (Gibco) có chứa 5% huyết thanh bào thai bê. Tế bào được nhân định kỳ trong 7 ngày. Tế bào dùng gây nhiễm virus được nhân theo tỷ lệ 2x105 tế bào ml-1 và tạo thành một lớp sau khi nhân được 2-3 ngày. Tạo nguồn HSV chuẩn HSV được gây nhiễm vào tế bào Vero, ủ 37oC, quan sát tế bào mỗi ngày, khi tế bào có hiện tượng CPE hoàn toàn, đem đông tan băng 3 lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung 20% huyết thanh bào thai bê bất hoạt, phân chia lượng nhỏ 1ml, bảo quản -70oC cho đến khi làm phản ứng. Xác định hiệu giá TCID50 của hỗn dịch virus(8) Dựa vào hiện tượng CPE xác định TCID50 theo công thức Karber Log TCID50 = L - d(S-0,5), với L: log của độ pha loãng thấp nhất dung trong thử nghiệm, d: tỷ lệ khác biệt giữa các độ pha loãng, S: tổng tỷ lệ các giếng dương tính trên các giếng gây nhiễm ở từng nồng độ virus. Kỹ thuật nhuộm tế bào bằng xanh methylen được thực hiện theo qui trình đã công bố(4). Chuẩn bị dịch thử Các cao chiết toàn phần và các phân đoạn chiết Hạ khô thảo được pha trong môi trường CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ 20 mg ml-1; acyclovir được pha trong môi trường CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ 2 mg/ml. Từ các dung dịch mẹ, pha loãng trong môi trường CMRL thành nhiều nồng độ để khảo sát. Xác định tính độc tế bào của chất thử đối với tế bào Vero(1,4) Cho vô mỗi giếng 100 µl các nồng độ của chất thử, mỗi nồng độ lặp lại ba lần trên phiến 96 giếng có tế bào Vero đã phủ kín thành một lớp, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 48 giờ, đổ bỏ chất không hấp phụ, nhuộm màu bằng xanh methylen và đo mật độ quang ở 620 nm. Tính nồng độ gây độc (CC) theo công thức CC = (A – B)/A x 100. Trong đó A là giá trị OD của chứng tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B là giá trị OD của tế bào đã được tiếp xúc với chất thử. Xác định nồng độ chất thử gây độc 50% tế bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng độ chất thử. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau đó cho xâm nhiễm vào tế bào(2). Nồng độ virus sử dụng để khảo sát HSV-1 và HSV-2 dựa vào hiệu giá TCID50. Tính phần trăm ức chế virus của dịch thử theo công thức IC = (C – D)/(A – D) x 100. Trong đó C là giá trị OD của tế bào tiếp xúc với virus và cao chiết, D là giá trị OD của tế bào chỉ tiếp xúc với virus (chứng virus), A là giá trị OD của tế bào không tiếp xúc với virus và dịch thử (chứng tế bào). Xác định nồng độ dược liệu ức chế 50% (IC50) sự xâm nhiễm của virus từ phương trình tuyến tính biểu diễn IC ở nồng độ virus đáp ứng tốt nhất với chất thử. Chỉ số chọn lọc SI (hay Hệ số trị liệu) được tính theo công thức SI = CC50/ IC50(1). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đặc tính dược liệu Bột dược liệu có độ ẩm 11,47 ± 0,04, đạt tiêu chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III (không quá 13%). Độ ẩm của cao toàn phần là 10,83 ± 0,03, trong khi quy định DĐVN III áp dụng cho cao đặc là không quá 20%; độ tro toàn phần là 10,12 ± 0,05 và độ tro không tan trong acid là 1,18 ± 0,009. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật bột Hạ khô thảo có tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, anthraquinon, polyphenol, saponin, acid hữu cơ, chất khử và polyuronic, điều này cũng phù hợp với nghiên cứu trước Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 316 dây của Namba, 1994(3). Từ 100 g bột dược liệu thu được 32,43 g cao toàn phần. Cao toàn phần Hạ khô thảo có rất nhiều polyphenol, triterpenoid và chất khử, nhiều tinh dầu, acid hữu cơ và polyuronic, có carotenoid, anthraquinon và saponin. Từ 10 g cao toàn phần thu được 0,50 g cao phân đoạn ethyl acetat, 1,61 g cao phân đoạn n-butanol và 7,82 g cao phân đoạn nước. Xác định hiệu giá virus theo TCID50 Kết quả xác định hiệu giá TCID50 đối với HSV-1 và HSV-2 theo bảng 1. Như vậy có thể tiến hành khảo sát khả năng ức chế virus của chất thử với nồng độ virus HSV-1 từ 103,6, 104,6 và 105,6; HSV-2 từ 103,7, 104,7 và 105,7. Bảng 1. Kết quả hiệu giá của chủng virus HSV-1 và HSV-2 dùng thử nghiệm. TCID50= log [ L- d(S- 0,5)] Virus HSV-1 (S6) HSV-2(S8) TCID50 10 -4,8/0,1ml 10-4,2/0,1ml L: Log của độ pha loãng thấp nhất dùng trong thử nghiệm; d: Sự khác nhau giữa các độ pha loãng; S: [Tổng tỷ lệ các giếng hình thành đám hoại tử] x [tổng số giếng tiếp xúc]-1. Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero Các cao Hạ khô thảo bao gồm cao toàn phần, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước có chỉ số SI đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ 16,29 đến 28,08; riêng phân đoạn n- butanol có chỉ số SI < 10. Như vậy, cao Hạ khô thảo có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 rất tốt, đặc biệt là phân đoạn nước tuy vẫn còn kém hơn so với acyclovir (Bảng 2). Kết quả này phù hợp với công bố của Hong-Xi và cộng sự (1999) là polysaccharid kiềm tách từ dịch chiết bằng nước nóng của Hạ khô thảo có khả năng ức chế HSV- 1 và HSV-2(3). Công bố của Zhang và cộng sự còn cho thấy phức hợp lignin–carbohydrat từ dịch chiết nước của cụm hoa (spike) có khả năng kháng mạnh HSV-1 và HSV-2 theo tác động ức chế quá trình bám đính và truyền vào tế bào của virus, kể cả chủng HSV-1 đề kháng acyclovir(9). Tuy nhiên phân đoạn ethyl acetat với thành phần polyphenol chiếm ứu thế cũng có chỉ số SI đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ 17,76 đến 19,46 tương đương với SI của cao toàn phần. Điều này cho thấy ngoài nhóm hợp chất polysaccharid thể hiện tác dụng ưu thế kháng HSV-1 và HSV-2 còn có nhóm hợp chất khác ở phân đoạn ethyl acetat cũng có tác dụng này. Nhóm hợp chất này có thể là nhóm polyphenol như đã phân tích và cũng được đề cập đến theo công bố của Nolkemper và cộng sự (2006)(6) với hai hợp chất chính là acid rosmarinic và acid caffeic. Nhưng nhóm chất này dường như không có sự hiệp lực với nhóm hợp chất polysaccharid và làm cho khả năng ức chế HSV- 1 và HSV-2 của cao toàn phần thấp hơn so với phân đoạn nước mà thành phần chủ yếu là nhóm polysaccharid. Đây là vấn đề chưa được đề cập trước đây và cần có sự nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ. Bảng 2. Kết quả khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2. HSV-1 HSV-2 Hạ khô thảo CC50 (μg/ml) IC50 SI IC50 SI Cao toàn phần 170,48 10,47 16,29 8,22 20,74 Cao ethyl acetat 191,31 10,77 17,76 9,83 19,46 Cao n-butanol 81,08 29,06 2,79 30,74 2,64 Cao nước 307,03 11,31 27,15 10,49 28,08 Acyclovir 1531,03 6,82 224,51 5,49 279,07 KẾT LUẬN Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng minh có tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2 và có thể được lựa chọn hợp lý trong việc làm thuốc kháng herpes. Cảm ơn: Đề tài được thực hiện với kinh phí do Bộ Y tế hỗ trợ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 317 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dargan D.J. (1998), Investigation of the anti-HSV activity of candidate antiviral agents, Methods in Molecular Medrone, Vol 10 Herpes simplex virus Protocols, 387-405. 2. Freshney R. I. (2005), Culture of animal cells: A manual of basic technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, 199-216. 3. Hong-Xi X., Spencer H.S. L., Song F. L., Robert L. W., Jonathan B. (1999). Isolation and characterization of an anti- HSV polysaccharide from Prunella vulgaris. Antiviral Res., 44, 43-54. 4. Hứa Thị Như Cẩm, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Kim Loan, Trần Thu Hoa (2010). Nghiên cứu tác dụng kháng virus herpes simplex (HSV) của các diterpen lacton từ Xuyên tâm liên. Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 14, 142-146. 5. Liu S., Jiang S., Wu Z., Lin L., Zhang J., Zhu Z., Wu S. (2002). Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella vulgaris and Rhizoma cibotte. Life Sciences, 71, 1779–1791. 6. Nolkemper S., Reichling J., Stintzing F.C., Carle R., Schnitzler P. (2006). Antiviral effect of aquueous extracts from species of the Lamiaceae family against Herpes simplex type 1 and type 2 in vitro. Planta med., 72, 1378-1382. 7. Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội. 8. World Health Organization (2004). Polio laboratory manual, immunization, vaccines and biologicals, 4th Edit., 76-78. 9. Zhang Y., But P.P.H., Ooi V.E.C., Xu H.X., Delaney G.D., Lee S.S.H, Lee S.F. (2007). Chemical properties, mode of action, and in vivo anti-herpes activities of a lignin–carbohydrate complex from Prunella vulgaris. Antiviral Research 75, 242– 249.