Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 18, 2003 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA ALLELE HLA-DQA1 BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION SEQUENCE SPECIFIC PRIMERS (PCR-SSP) Ở DÂN TỘC KINH MIỀN TRUNG VIỆT NAM Trần Đình Bình Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế Wang Linlin, Lin Weixiong Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác [1-3]. Những người không cùng một loại hình phân bố các allele của HLA thì tính nhạy cảm hay sức đề kháng với một số bệnh không giống nhau [1-3]. Nhiều tác giả nước ngoài đã nghiên cứu sự khác biệt về phân bố allele HLA-DQA1 trong quần thể người đã phát hiện một số người mang những allele này sẽ có khả năng nhạy cảm hay đề kháng với một số bệnh tật nhất định. Trong thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền khác nhau, cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý... thì sụ phân bố các alleles của hệ HLA cũng khác nhau[4 -11]. Ở Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu về hệ HLA, nhất là sự phân bố của allele HLA-DQA1 trên nhiều dân tộc như Hán, Choang, Bố Y, Duy Ngô Nhĩ, Mãn..., Thái Lan cũng đã có báo cáo về vấn đề này [11], nhưng cho đến nay chưa có báo cáo nào về phân bố allele HLA-DQA1 ở Việt Nam. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR-SSP) [12] để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allele HLA-DQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau. I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu: là 214 thanh thiếu niên khỏe mạnh, tuổi từ 7-36, dân tộc Kinh, cư trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình, tỉ lệ nam nữ 1:1. Tuổi bình quân là 14 tuổi. 2. Tách DNA: Trên mỗi đối tượng lấy 2ml máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri citrate 3,8% chống đông và dùng phương pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến là Phenol/ Chloroform. Các bước như sau [13]: Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml dung dịch Gelatine 3%, trộn đều, ủ ở 37oC/ 10 phút, tách lấy phần dịch phía trên, ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía trên, thêm 2 ml dung dịch TES 2mM, trộn đều, thêm 0,5 ml dung dịch 10% SDS, trộn đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hòa trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500rpm?5 phút, tách lấy phần dịch ở trên, (có thể tiến hành bước này thêm một lần nữa), thêm 2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v:24/1), trộn đều, ly tâm 3500rpm/5 phút. Tách lấy phần nước trong ở trên, thêm 5ml dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ nhàng quay ống nghiệm để các sợi DNA xoắn lại, dùng ống hút nhỏ nhẹ nhàng hút lấy DNA và bảo quản ở một ống khác trong dung dịch cồn 75%. Khi sử dụng có thể dùng dung dịch TE hoặc nước cất để hòa tan DNA. 3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele HLA-DQA1. 3.1. Specific Primers: Căn cứ vào bảng các nucleotides của các alleles của hệ HLA II năm 2002[14] và dựa vào các Primers đặc hiệu của O.Olerup [12], chúng tôi lấy các Primers đặc hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh học của Viện Khoa học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao gồm 9 chuỗi 5’ và 7 chuỗi 3’ hợp thành 12 đôi Primers đặc hiệu để khuếch đại và phân tích exon thứ 2 của HLA-DQA1 allele. 3.2. Primers đối chiếu: Mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đôi Primers đối chiếu là Ctrl 1 (5’ TAT CAT GCC TCT TTG CAC CAT TC 3’, 23 mer, Tm 660C) 和Ctrl 2 (5’ AAT GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC 3’, 23 mer, Tm 700C) để kiểm soát và đối chiếu phản ứng khuếch đại PCR. 3.3. Kỹ thuật PCR-SSP: Dựa vào phương pháp của O.Olerup để tiến hành, cụ thể là: Mỗi ống tiến hành PCR chứa 10µl gồm có：75ng tiêu bản DNA，dung dịch đệm 5 x PCR (50mmol KCl;1.5mmol MgCl2;10mmol Tris-HCl (pH 8.3); 0.001%(w/v) Gelatin)1% BSA;200àl dNTPs chính là các dATP，dGTP，dCTP và dTTP；0.25àM các đôi Primers đặc hiệu，0.05àM đôi Primers đối chiếu và 0.50 IU Taq DNA polymerase. Tiến hành 30 tuần hoàn, mỗi tuần hoàn như sau: Biến tính 94oC/30 giây Giảm nhiệt 62oC/30giây Nối dài 72oC/90 giây. Sản phẩm thu được sau PCR được tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100 V trong 15 phút. Xem và phân tích kết quả ở đèn cực tím hoặc ở máy vi tính để chụp ảnh và bảo lưu kết quả. 4. Xử lý số liệu thống kê: Dùng cách tính tần suất % theo Hardy-Weinberg [15] để thống kê và xử lý các kết quả đạt được. Bảng 1: Vị trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuếch đại allele DQA1 TT Tên gọi các allele Đôi Primers đặc hiệu Sản phẩm PCR Các allele thu hoạch sau PCR 1 DQA1*0101/4 A*5’01+A*3’01 149 bp DQA1*0101, DQA1*0104 2 DQA1*0101/2/4 A*5’02+A*3’01 172 bp DQA1*0101, DQA1*0102和DQA1*0104 3 DQA1*0102/3 A*5’03+A*3’01 149 bp DQA1*0102, DQA1*0103 4 DQA1*0103 A*5’04+A*3’01 172 bp DQA1*0103 5 DQA1*0201 A*5’04+A*3’02 170 bp DQA1*0201 6 DQA1*0301 A*5’05+A*3’03 183 bp DQA1*0301 7 DQA1*0302 A*5’06+A*3’03 183 bp DQA1*0302 8 DQA1*0401 A*5’07+A*3’04 190 bp DQA1*0401 9 DQA1*0501 A*5’02+A*3’05 186 bp DQA1*0501 10 DQA1*0601 A*5’04+A*3’06 117 bp DQA1*0601 11 DQA1* “A” A*5’08+A*3’07 196 bp all DQA1 alleles except DQA1*0104 12 DQA1*0104 A*5’09+A*3’07 170 bp DQA1*0104 II. KẾT QUẢ Kết quả phân tích HLA-DQA1 từ 214 mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra được 10 loại allele DQA1, tần suất tìm thấy cao nhất là allele DQA1*0104 (25,8%), tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các allele DQA1 còn lại đều được tìm thấy dưới 10%. Nhiều alleles là đồng hợp tử nên tổng số các alleles tìm được là 328 trên số người điều tra là 214 (lẽ ra phải là 428 alleles). Để kiểm tra alleles là đồng hợp tử thì cần phải tiếp tục kiểm tra chuỗi DNA. Đề tài này chưa tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử bàng kỹ thuật đọc chuỗi. Hình ảnh dưới đây là kết quả điện di sản phẩm PCR sau khuếch đại được phân tích và lưu ảnh ở máy tính Bio-Rad Gel Doc 2000. Bảng 2: Tần suất các allele HLA-DQA1 của người Kinh Việt Nam TT Tên gọi các allele Lượt tìm thấy (328) Tần suất kháng nguyên (%) Tần suất allele tìm được(%) 1 DQA1*0101/4 75 0.35 0.194 2 DQA1*0101/2/4 62 0.29 0.157 3 DQA1*0102/3 8 0.04 0.020 4 DQA1*0103 96 0.45 0.258 5 DQA1*0201 24 0.11 0.056 6 DQA1*0301 24 0.11 0.056 7 DQA1*0302 6 0.03 0.015 8 DQA1*0401 22 0.10 0.051 9 DQA1*0501 7 0.03 0.015 10 DQA1*0601 4 0.02 0.010 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 1: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA-DQA1*0102/0103 sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR-SSP. 1-12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA-DQA1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 2: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA-DQA1*0101/0104 sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR-SSP. 1-12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA-DQA1. Bảng 3: So sánh tần suất các allele HLA-DQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam với các dân tộc khác của Trung Quốc và người Thái Lan hiện đại Tên allele Người Kinh Việt Nam n=214 Người Hán miền Bắc n=342 Người Hán miền Nam n=270 Người Hán Vân Nam n=54 Người Choang Quảng Tây n=140 Người Tải n=146 Người Bố Y n=67 Ngưồi Duy Ngô Nhĩ n=184 NgườiMãn n=50 Người Di n=85 Người Choang Ba mã n=142 Người Thái Lan n=140 DQA1*0101 19.4 11.7 9.6 0 5.0 27.0 20.8 13.6 13.8 15.3 15.2 15.7 DQA1*0102 15.7 14.3 23.0 15.9 17.8 32.0 33.1 12.0 14.9 15.3 27.8 15.7 DQA1*0103 2.0 12.0 5.9 7.6 5.4 0 4.6 15.2 8.5 6.7 2.1 5.0 DQA1*0104 25.8 0 0 17.8 22.1 0 0 0 0 0 19.5 0 DQA1*0201 5.6 11.7 4.8 0 0.0 1.0 0.7 19.0 8.6 5.4 0 14.3 DQA1*0301 5.6 27.8 28.5 22.8 35.0 22.0 14.5 14.7 25.5 23.3 12.8 26.0 DQA1*0302 1.5 0 0 0 0.0 0 0 0 0 0 0 0 DQA1*0401 5.1 0.9 0.7 0 1.1 0 0 3.3 1.1 0 2.8 0.0 DQA1*0501 1.5 18.1 15.2 11.5 14.3 9.0 18.0 20.7 13.8 15.9 19.5 12.8 DQA1*0601 1.0 3.5 12.2 24.9 0.0 8.0 6.2 1.6 12.8 18.1 0 16.4 III. BÀN LUẬN Cho đến nay, hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được coi là hệ kháng nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất. Chúng không chỉ có sự phân bố khác nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn có sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau về bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền và ngay cả cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ Kháng nguyên bạch cầu người có vị trí rất quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền học vô cùng chắc chắn, ứng dụng nhiều trong việc xác định con cái, bố mẹ, trong khoa học hình sự để tìm tội pham, trong nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để tìm hiểu nguồn gốc của một dân tộc...[1]. Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây còn khẳng định mối liên hệ mật thiết giữa HLA và một số bệnh tật như: Đái tháo đường không phụ thuộc Insulin, Viêm cứng cột sống, Viêm đa khớp dạng thấp, Viêm khớp thiếu niên... Vì thế nghiên cứu HLA còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, chẩn đoán và hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng bệnh, dự phòng và điều trị một số bệnh tật. Theo đà phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử, việc nghiên cứu hệ HLA ngày càng đơn giản, thuận tiện và chính xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về HLA vẫn còn khu trú tại các Viện nghiên cứu, Phòng Khoa học hình sự... còn chưa được sử dụng nhiều trong bệnh viện và các phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về HLA, dẫu rằng có tài liệu đề cập đến hệ HLA của người Việt Nam nhưng không ghi rõ nơi nghiên cứu [15]. Theo kết quả nghiên cứu trên đây, người dân tộc Kinh Miền Trung Việt Nam có tần suất tìm thấy allele HLA-DQA1*0104 là cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các allele khác được tìm thấy với tần suất rất thấp. So sánh với các dân tộc khác ở Trung Quốc thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân bố khá giống với dân tộc Choang (đã tìm thấy allele HLA-DQA1*0104 với tần suất 22,1% và allele HLA-DQA1*0401 là 1,1% ). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có các allele HLA-DQA1*0301 và HLA-DQA1*0501 được tìm thấy rất thấp, đều thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc (xem bảng 3). Như vậy, tần suất allele HLA-DQA1*0401 cao, HLA-DQA1*0301 và HLA-DQA1*0501 thấp có lẽ là đặc trưng phân bố allele HLA-DQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam. So sánh với nghiên cứu trên người Thái Lan thấy HLA-DQA1*0101, HLA-DQA1*0102 có tần suất tương tự nhưng tần suất HLA-DQA1*0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với người Kinh miền Trung Việt Nam (p<0,005). Dân số Việt nam hiện nay khoảng 80 triệu người, với 54 dân tộc anh em, trong đó người Kinh chiếm tỷ lệ rất lớn (khoảng 90%) phân bố khắp toàn quốc. Dân tộc Kinh có truyền thống, lịch sử, văn hóa... rất lâu đời. Nghiên cứu về dân tộc học cần tập trung trên nhiều phương diện như văn hóa, lịch sử, truyền thống, nhân chủng học... trong đó di truyền học giữ một vai trò rất quan trọng. Báo cáo này có lẽ là nghiên cứu đầu tiên về phân bố các alleles của HLA-DQA1 trên người Kinh ở miền Trung Việt Nam, với những số liệu ban đầu này, chúng tôi hy vọng có thể tiếp tục nghiên cứu thêm về phân bố kháng nguyên hệ HLA nhằm tìm ra được đặc trưng phân bố kháng nguyên HLA trên người Kinh Việt nam, điều này có ý nghĩa lớn trong Y học (chẩn đoán, dự phòng, tiên lượng, điều trị một số bệnh...), trong nhân chủng học nhằm nghiên cứu nguồn gốc các dân tộc và mối liên hệ giữa các dân tộc khác nhau. Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y khoa Huế, Bệnh viện thực hành Trường Đại học Y khoa Huế, Bộ môn Vi sinh, Khoa Xét nghiệm Trường Đại học Y khoa Huế, Trung tâm Thí nghiệm Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung quốc và các thầy cô, đồng nghiệp. Xin chân thành biết ơn TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Mengde, Tai Dongchun, Sun Hanxiao et al. Biological molecular and Clinical applies of HLA. Hunan Medical University Publishing (1998)1-58 Meng Haiying, Hou Yiping. New reseach hotpots of HLA. Chin. J. Med. Genet. 17(5) (2000) 355-357 H.A.Erlich, G.Opelz and J.Hansen. HLA DNA Typing and Transplantation, Immunity, 14 (2001) 347-358. Xu xingpei, Wang Shaoying, Cao Jianying. Study on DNA typing of HLA- II class genes of Chinese Buyi nationality. Chin. J. Microbiol. Immnol 12(5) (1992)285-289 Long Guifang, Ahmed Abdi Mohamed: HLA-DQA1, DQB1 alleles genotyping by PCR- SSP in Guangxi Chinese Zhuang nationality. Chin. J. Microbiol. Immnol. 1999, 19(6) 504- 505. Shen Jingjing, Huang Xiaojie, M. Fernandez et al: Study on HLA-DQ, DR, DP halotypes in Xinjiang Weiwuer. Chin. J. Med. Genet. 1997, 14(4), 234-238. Sun Yiping, Song Changxing, Li Shiliang et al: A comparative study of HLA distribution among some nationalities in China. Chin. J. Microbiol. Immnol 1984, 4(4), 205-211. Uy Guilan, Sun Yiping, Xu Linmin et al: A Study on HLA-DQ, DR, DP typing in Shenyang Han populations. Chin. J. Immunol. 1995, 11(3), 142-144. Shen Jingjing, Guan Xiaofan, Yang Ze et al: Allels at five HLA-II class determined in Weiwuer nationality in North-Western of China. Chin. J. Med. Genet. 2000, 17(3), 219- 220. Li Xiaofeng, Chang Chang, Hong Shenxue et al: Association of alleles HLA-DRB1, DQA1, DQB1 with SLE in Han populations in Yunnan, China. Chin. J. Med. Genet. 2001, 18(5), 408-409. D. Chandanayingyong, Henry A.F. Stephens, R. Claythong et al: HLA-A, -B, -DQA1 and -DQB1 Polymorphism in Thais. Human Immunology, 1997, 53, 174-182. O. Olerup, A. Aldener, A. Fogdell: HLA-DQB1 and DQA1 typing by PCR- SSP in 2 hours. Tissue Antigens, 1993, 41(3), 119-134. Zhou Xiaoling, Lin Weixiong: DNA detection from peripheral blood. Chinese Guangxi Medical University Magazine. 1999, 16(2), 223. S. G. E. Marsh: HLA Sequence, 2002. 13th International Histocompatibility workshop and conference, 5.2002. (Internet). Zhao Tongmao: Genetics of Human Blood Group. Chinese Science Publishing, 1987，226-236 ANALYSIS OF HLA-DQA1 ALLELES OF VIETNAMESE IN CENTRAL VIETNAM . Tran Dinh Binh College of Medicine, Hue University Wang Linlin, Lin Weixiong Guangxi Medical University SUMMARY By using PCR-SSP technique, we have determined the polymorphism of the HLA-DQA1 alleles of 214 healthy individuals in Centre of Vietnam.The Results shows that 10 HLA-DQA1 alleles were detected, of which DQA1*0104 were the most common allele with frequency of 25.8%, and lowest frequency was DQA1*0601（1%）.This means that HLA-DQA1 alleles polymorphism of Vietnamese in Central Vietnam have national characteristics and that are different from the other Chinese and Thais. Human leucocyte antigen，HLA-DQA1，PCR-SSP Vietnamese.