Sự phân bố kiểu gen (Genotype) của virus viêm gan B (HBV) ở trẻ em nhiễm HBV

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 190 SỰ PHÂN BỐ KIỂU GEN (GENOTYPE) CỦA VIRUS VIÊM GAN B (HBV) Ở TRẺ EM NHIỄM HBV Cao Minh Nga*, Nguyễn Thanh Bảo*, Nguyễn Thị Hải Yến** , Trần Thị Như Lê**, Trần Thị Ngọc Anh*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi B là một vấn đề y tế cộng đồng quan trọng ở nhiều nước trên Thế giới, đặc biệt là các quốc gia đang phát triển. Tại Việt Nam, với tỉ lệ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) ở mức độ cao (10-20%) đã có nhiều nghiên cứu về genotype HBV ở người lớn nhưng chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên đối tượng trẻ em. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định và mô tả sự phân bố genotype HBV ở trẻ em nhiễm HBV. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiền cứu, mô tả cắt ngang. Thu thập 106 mẫu huyết thanh bệnh nhi có HBsAg (+) tại bệnh viện Nhi đồng 2 TP. HCM từ tháng 6/2009 đến tháng12 /2009. Xét nghiệm men gan (GOT, GPT) và HBeAg theo thường qui tại phòng xét nghiệm bệnh viện. Định lượng HBV-DNA và xác định genotype HBV theo phương pháp Real-time PCR tại Đại học Y Dược TP. HCM. Kết quả nghiên cứu: Xác định genotype HBV trên 79 mẫu huyết thanh bệnh nhi có lượng HBV-DNA trên 103 bản sao/mL. Kết quả cho thấy: 3 kiểu gen HBV được xác định là B (69,6%), C (7,6%) và B kết hợp C (22,8%). Không có khác biệt về sự phân bố genotype HBV theo giới tính, số lượng bản sao HBV-DNA trong huyết thanh. Trên 60 mẫu được xét nghiệm định lượng men gan (GPT), không có sự khác biệt về sự phân bố các genotype HBV trong nhóm có tăng men gan và nhóm có men gan bình thường. Trên 41 mẫu được xét nghiệm HBeAg, không khác biệt về sự phân bố genotype trong 2 nhóm HBeAg (+) và HBeAg (-). Kết luận: Trên bệnh nhi nhiễm HBV, genotype B chiếm đa số (69,6%), genotype C chiếm 7,6%. Tỉ lệ nhiễm hỗn hợp genotype B+C là 22,8%. Mối liên quan giữa sự phân bố các genotype nêu trên với giới tính, số lượng bản sao HBV-DNA trong huyết thanh, HBeAg và tình trạng tăng men gan không có sự khác biệt. Từ khóa: kiểu gen, virus viêm gan B, viêm gan B, trẻ em. ABSTRACT THE GENOTYPE DISTRIBUTION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) IN CHILDREN WITH POSITIVE HBsAg Cao Minh Nga, Nguyen Thanh Bao, Nguyen Thi Hai Yen, Tran Thi Nhu Le, Tran Thi Ngoc Anh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 188 - 192 Backgrounds: Hepatitis B virus is a important problem of health burden worldwide, especially developing countries. In Vietnam, which has had a hight prevalence of HBV infection (10-20%), many studies of HBV genotype have been done but there have not been anyone on HBV infected children yet. Objectives: In order to investigate the HBV genotype of children with positive HBsAg and it’s distribution. * Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Cần Thơ *** Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi đồng 2 TP. Hồ Chí Minh Địa chỉ liên lạc: PGS.TS Cao Minh Nga ĐT: 0908361512 Email: pgscaominhnga@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y tế Công cộng 191 Method: Retrospective, descriptive and cross-sectional method. The sera of 106 children positive HBsAg were collected in the Pediatric Hospital N02 in HoChiMinh city from June to December 2009. Some tests (GPT, GOT, HBeAg) were done as routine tests. Quantitating of HBV-DNA and genotyping of HBV were taken by Real-time PCR method in University of Medicine and Pharmacy in HoChiMinh city. Result: Seventy-nine samples with over 103 HBV-DNA copies/mL sera of children patients were available for this study. The result indicate the HBV genotypes including B, C and mixture (B + C), accounting for 69.6%, 7.6% and 22.8% respectively. There was no significant difference in the distribution of HBV genotypes in groups of gender, HBV-DNA copies quantity in sera. Among 60 sera samples having transaminases result and 41 samples one having HBeAg test, there was also no significant difference in the distribution of HBV genotypes between in groups of hight level and normal level of transaminases and groups of HBeAg (+) and HBeAg(-) also. Conclusions: The genotypes of HBV in infected children were B (69.6%), C (7.6%) and mixture B+C (22.8%). There was no significant difference in the distribution of HBV genotypes in groups of gender, HBV-DNA copies quantity in sera, HBeAg and the level of transaminases. Keywords: genotype, HBV, hepatitis B, children. ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan siêu vi B là một vấn đề y tế cộng đồng trên qui mô toàn cầu, là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 10 trên thế giới với khoảng 600.000 trường hợp tử vong hàng năm. Đa số các trường hợp viêm gan mạn, xơ gan, ung thư gan nguyên phát hoặc tử vong do HBV đều nhiễm HBV từ nhỏ. HBV được chia thành 8 kiểu gen (AH) dựa trên sự khác biệt bộ gen từ 8% trở lên. Ở các vùng địa lý khác nhau có sự phân bố khác nhau của genotype HBV(1,2,3,12). Gần đây, genotype thứ 9 (genotype I) được tìm thấy tại Việt Nam và Lào(8,10). Genotype C của HBV có thể gây diễn tiến bệnh lý nặng hơn những genotype khác(10, 11, 12). Để xác định genotype HBV có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau như giải trình tự chuỗi, multiplex PCR, real- time PCR, Tại Việt Nam, tỉ lệ người nhiễm HBV ở mức độ cao (10-20%), đã có nhiều nghiên cứu xác định genotype HBV trên các nhóm đối tượng bệnh nhân viêm gan mãn, xơ gan, ung thư gan ở người lớn. Các kiểu genotype thường gặp ở Việt Nam là B và C(2, 4, 5, 8, 9, 11). Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên đối tượng trẻ em. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sự phân bố kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B (HBV) ở trẻ em nhiễm HBV” nhằm mục đích: 1. Xác định genotype HBV ở trẻ em có HBsAg (+) 2. Mô tả sự phân bố genotype HBV theo giới tính, số lượng HBV-DNA, tình trạng HBeAg và theo men gan. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Loại hình nghiên cứu Mô tả hồi cứu – thiết kế cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhi có HBsAg (+) tới khám và chữa bệnh tại bệnh viện Nhi đồng II TP. Hồ Chí Minh từ tháng 6/2009 đến tháng12 /2009. Phương pháp nghiên cứu - Biến số nghiên cứu: giới, genotype HBV, số lượng bản sao HBV-DNA, men gan. - Xét nghiệm men gan (GOT, GPT) và HBeAg theo thường qui tại phòng xét nghiệm bệnh viện. - Định lượng HBV-DNA và xác định genotype HBV theo phương pháp Real-time PCR(5) tại phòng Y sinh học Đại học Y Dược TP. HCM. - Nhập và phân tích số liệu bằng phần mền SPSS 12.0, dùng phép kiểm 2 để so sánh các tỉ lệ với mức có ý nghĩa p<0,05. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 192 KẾT QUẢ Trong thời gian tiến hành nghiên cứu, ghi nhận được 106 bệnh nhi có xét nghiệm HBsAg (+), trong số này 79 mẫu huyết thanh có kết quả định lượng HBV-DNA ≥ 103 copies/ml, là ngưỡng có thể tiến hành định genotype HBV. Đặc điểm mẫu nghiên cứu Bảng 1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu (n=79) Đặc tính Tần số Tỉ lệ (%) Nam 46 58,2 Giới Nữ 33 41,8 B 55 69,6 C 6 7,6 Genotype HBV B+C 18 22,8 103 - < 105 7 8,9 105 - < 108 18 22,8 Số lượng HBV- DNA / ml huyết thanh > 108 54 68,4 Trong 79 mẫu huyết thanh được xác định genotype, chúng tôi chỉ tìm được sự hiện diện của 3 loại genotype: B, C và B+C. Trong đó genotype B chiếm tỉ lệ cao nhất (69,6%), genotype kiểu kết hợp B+C chiếm tỉ lệ 22,8%, genotype C chiếm tỉ lệ thấp nhất -7,6%. Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhi Bảng 2: Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhi (n=79) Giới tính Genotype B Genotype C Genotype B + C Nam (n=46) 69,6 % 6,5 % 23,9 % Nữ (n=33) 69,7 % 9,1 % 21,2 % Ở nhóm bệnh nhi nam, tỉ lệ genotype B là 69,9%, genotype C và B+C là 6,5% và 23,9%. Ở nhóm bệnh nhi nữ, tỉ lệ genotype B là 69,7%, genotype C và B+C là 9,1% và 21,2%. Như vậy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố genotype theo giới tính (p< 0,05). Sự phân bố genotype theo số lượng HBV-DNA/ml huyết thanh Bảng 3: Sự phân bố genotype HBV theo số lượng bản sao HBV-DNA/ml huyết thanh HBV-DNA (bản sao/ml) Genotype B Genotype C Genotype B + C 103 - < 105 (n=7) 71,54 % 0,0 % 28,6 % HBV-DNA (bản sao/ml) Genotype B Genotype C Genotype B + C 105 - < 108 (n=18) 55,60 % 16,7 % 27,8 % >108(n=54) 74,10 % 5,6 % 20,4 % Chúng tôi chỉ tiến hành xác định được genotype ở những mẫu huyết thanh có số lượng bản sao HBV-DNA / ml huyết thanh ≥ 103 (79 mẫu). Số lượng bản sao HBV-DNA /ml huyết thanh cao nhất xác định được là 109. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về sự phân bố các loại genotype HBV ở cả 3 nhóm có số lượng bản sao HBV-DNA cao thấp khác nhau. Sự phân bố genotype theo men gan Bảng 4: Sự phân bố genotype HBV theo men gan (n=60) Men gan GPT Genotype B Genotype C Genotype B + C >20 UI/L (n=9) 66,7 % 11,1 % 22,2 % ≤20 UI/L (n=51) 74,5 % 7,8 % 17,6 % Trên 60 mẫu huyết thanh được xét nghiệm định lượng men gan, chúng tôi ghi nhận được kết quả: ở nhóm có men gan GPT > 20 UI/mL và nhóm có men gan GPT  20 UI/mL, genotype B đều chiếm tỉ lệ cao nhất (66,7% và 74,5%), genotype C chiếm tỉ lệ thấp nhất (11,1% và 7,8%), genotype hỗn hợp B+C chiếm tỉ lệ 22,2% và 17,6%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về sự phân bố genotype ở 2 nhóm có men gan tăng và men gan bình thường. Sự phân bố genotype theo kháng nguyên HBeAg: Bảng 5: Sự phân bố genotype theo kháng nguyên HBeAg HBeAg Genotype B Genotype C Genotype B + C Dương tính (n=36) 72,2 % 8,3 % 19,4 % Âm tính (n=5) 80,0 % 20,0 % 0 % Trong 41 mẫu huyết thanh có làm xét nghiệm HBeAg, có 36 mẫu (87,8%) có kết quả HBeAg (+), 5 mẫu (12,2% ) có kết quả HBeAg (-). Ở nhóm có HBeAg (+), genotype B có 26 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y tế Công cộng 193 mẫu, chiếm tỷ lệ cao nhất (72,2%), genotype B có 3 mẫu (8,3%) và 7 mẫu có genotype kết hợp B+C (19,4%). Trong nhóm có HBeAg (-), 4 mẫu có genotype B (80%) và 1 mẫu có genotype C (20%), không có genotype kết hợp B+C. Sự khác biệt về phân bố genotype giữa 2 nhóm HBeAg (+) và nhóm HBeAg (-) không có ý nghĩa thống kê. BÀN LUẬN Các kiểu genotype của HBV của trẻ em xác định được trong nghiên cứu này (Bảng 1) gồm có: genotype B (69,6%), genotype C (7,6%) và kết hợp genotype B với C (22,8%). Đây là những genotype phổ biến ở châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, đã được nhiều nghiên cứu trước đây trên người lớn xác nhận(2, 4, 5, 8, 9, 11). Phân tích riêng từng loại, ta thấy genotype B (69,6%) chiếm tỉ lệ không khác biệt so với các tác giả Việt nam nghiên cứu trên đối tượng người lớn với những kỹ thuật khác nhau (77,8% - 78% - 67,7%)(4, 5, 9). Trong nghiên cứu này, tỉ lệ genotype C (7,6%) thấp hơn hẳn tỉ lệ genotype B. Tỉ lệ genotype C trên đối tượng trẻ em trong nghiên cứu của chúng cũng thấp hơn hẳn so với tỉ lệ genotype C trong các nghiên cứu về genotype của HBV ở người lớn tại Việt nam (40,5% - 21,3% - 22% và 29%)(2, 4, 5, 9). Có thể do đối tượng người lớn trong các nghiên cứu khác thuộc các nhóm bệnh lý là diễn tiến xa của tình trạng nhiễm HBV, phù hợp với y văn - genotype C của HBV thường gây bệnh lý ở gan nặng hơn các genotype khác(10, 11, 12). Trong nghiên cứu của chúng tôi không thấy sự hiện diện của genotype A như một số nghiên cứu khác trên đối tượng người lớn, tuy nhiên ở những nghiên cứu này sự hiện diện của genotype A (nếu có) chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ (0,9% và 4%)(2, 4). Một sự khác biệt rõ rệt nữa từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên đối tượng trẻ em so với các nghiên cứu khác trên người lớn là sự hiện diện kiểu gen hỗn hợp (B+C) với tỉ lệ cao hơn nhiều (22,8%). Nghiên cứu của Lê T. Đỗ Quyên(9) với cùng kỹ thuật xác định genotype HBV ở người lớn, kiểu gen hỗn hợp (B+C) chiếm 3,3%. Nghiên cứu của Bùi Hữu Hoàng(2) cũng ghi nhận được tỉ lệ rất thấp (1,4%) mang kiểu gen hỗn hợp của genotype A và C. Các nghiên cứu khác ở Việt nam trên đối tượng người lớn chưa ghi nhận được kiểu gen hỗn hợp(4,5). Sự khác biệt có thể do đối tượng nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng khác nhau. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kỹ thuật real-time PCR được sử dụng để xác định kiểu gen của HBV. Kỹ thuật này có khả năng phát hiện được các genotype khác nhau cho dù nó chỉ chiếm số lượng nhỏ trong quần thể hỗn hợp chứa cả hai loại genotype HBV, đây chính là ưu điểm của kỹ thuật real-time PCR so với kỹ thuật đòi hỏi chi phí cao nhưng không phát hiện được kiểu gen hỗn hợp như kỹ thuật giải trình tự chuỗi(5). Tại Việt nam, chưa có nghiên cứu về genotype HBV ở trẻ em. So sánh với hai nghiên cứu ở Trung quốc(1, 3) cho thấy, genotype B của HBV ở hai nhóm trẻ được khảo sát đều có tỉ lệ cao vượt trội so với genotype C (99,0% và 83,2% so với 9,1% và 16,28%) tương tự như nghiên cứu của chúng tôi (69,6% so với 7,6%). Tuy nhiên hai nghiên cứu này đều không phát hiện được kiểu gen hỗn hợp như nghiên cứu của chúng tôi. Có thể lý giải sự khác biệt là do yếu tố địa lý, do cỡ mẫu nhỏ hơn nghiên cứu của chúng tôi (33 và 43 so với 79 trẻ được khảo sát) và đặc biệt có thể do kỹ thuật tiến hành. Cả hai nghiên cứu ở Trung quốc đều dùng kỹ thuật giải trình tự chuỗi để xác định genotype HBV trong khi chúng tôi sử dụng kỹ thuật real- time PCR với các cặp mồi cho từng loại genotype HBV. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi đòi hỏi chi phí cao nhưng không phát hiện được kiểu gen hỗn hợp như chúng ta đã biết. Một nghiên cứu ở Thái Lan dựa trên kỹ thuật miltiplex-PCR(7) cũng phát hiện được kiểu gen hỗn hợp của HBV (genotype B và C) – chiểm tỉ lệ 1,9%. Tuy nhiên, khác với nghiên cứu của chúng tôi, ở Thái lan genotype C ở trẻ em lại Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 194 chiếm tỉ lệ ưu thế so với genotype B (90,6% so với 7,5%). Một nghiên cứu khác ở Nhật(6) dựa trên kỹ thuật giải trình tự để xác định genotype HBV ở trẻ em cũng cho kết quả genotype C chiếm tỉ lệ ưu thế so với genotype B (86% so với 9%), ngoài ra genotype D và A cũng hiện diện với tỉ lệ thấp (2,5% và 1%). Nghiên cứu này cũng không phát hiện được kiểu gen hỗn hợp như các nghiên cứu dùng kỹ thuật giải trình tự khác. Sự phân bố genotype HBV theo giới tính (Bảng 2), số lượng bản sao HBV-DNA trong huyết thanh (Bảng 3), HBeAg (Bảng 5) và tình trạng men gan (Bảng 4) khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu khác trên người lớn(7, 8, 10). KẾT LUẬN Qua nghiên cứu xác định genotype HBV trên 79 bệnh nhi có HBsAg (+) đến khám và xét nghiệm tại Bệnh viện Nhi đồng II, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1. Sự phân bố kiểu gen của HBV ở trẻ em như sau: genotype B chiếm tỉ lệ cao nhất (69,6%), genotype C chiếm tỉ lệ rất thấp (7,6%), genotype hỗn hợp (B kết hợp C) chiếm tỉ lệ cao (22,8%), cao hơn nhiều so với số liệu từ các nghiên cứu trên người lớn. 2. Không có mối liên quan giữa sự phân bố các genotype HBV với giới tính, số lượng bản sao HBV-DNA, HBeAg và tình trạng men gan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bian T, Zhang Y, Cao YQ, Wang JJ, Shen LP, Wang F, Wang Y, Bi SL (2008). The analysis of hepatitis B virus genetic characterization and ratio of mutation in low-age group of Nunan (Article in Chinese). Institute for Viral Disease Control and Prevention, China Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China. Jun; 22(3): 205-7. 2. Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003). Kiểu gen của siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Y học TP Hồ Chí Minh. Chuyên đề Nội khoa, tập 7, phụ bản số 1:128-133. 3. Cheng DX, Ye GL, Lin Y, Chen ZH (2009). The analysis of hepatitis B virus genetic characterization from immuned children and their mother (Article in Chinese). Xiang Shan Country First People Hospital, Zhejiang 315700, China. Jun; 23(3):194-6 4. Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga, Phạm Hoàng Phiệt, Kenji Abe (2003). Kỹ thuật định týp gen siêu vi viêm gan B bằng multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mãn tính. Y học TP Hồ Chí Minh. Chuyên đề Y học cơ sở, tập 7, phụ bản số 1:145-150. 5. Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Bảo Toàn, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Duy Khánh, Cao Minh Nga, Vũ Thị Tường Vân (2009). Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR và realtime RT- PCR trong xác định kiểu gene của virus gây viêm gan siêu vi B và C. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tuyển tập Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc khu vực phía Nam năm 2009. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. Tr.: 382-386. 6. Inui A, Komatsu H, Sogo T, Nagai T, Abe K, Fujisawa T (2007). Hepatitis B virus genotypes in children and adolescents in Japan: before and after immunization for the prevention of mother to infant transmission of hepatitis B virus. J. Med Virol 2007 jun 79(6): 670-5 7. Jutavijittum P, Yousukh A, Jiviriyawat Y, Kunachiwa W, Toriyama K (2010). Genotype of hepatitis B virus among children in Chiang Mai, Thailand. Southeast asian j trop med public health 2008 May 39(3): 394-7. 8. Kenji Abe (2010). Molecular-based epidemiology and pathology of hepatitis B virus infection. Kỷ yếu Hội nghị Sinh học phân tử và Hóa sinh Y học tòan quốc lần thứ 2. Hà nội. Tr.: 19-20. 9. Lê Thị Đỗ Quyên (2010). Đặc điểm kiểu gen cả siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính. Luận văn Thạc sỹ Y học. Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Công Long, Bùi Xuân Trường, Nguyễn Khánh Trạch và cs (2008). Nồng độ HBV-DNA cao liên quan đến kiểu gen C và bệnh gan nặng ở bệnh nhân Việt Nam nhiễm virus viêm gan B mạn tính. Tạp chí Khoa học Tiêu hóa, số 11: 669-673. 11. Phung TB, Alestig E, Nguyen TL, Hannoun C, Lindh M (2010). Genotype X/C recombinant (putative genotype I) of hepatitis B virus is rare in Hanoi, Vietnam-genotypes B4 and C1 predominate. J Med Virol. Aug; 82(8): 327-33. 12. VIRAL HEPATITIS: Five Decades of Progress and Promises for the Future. Postgraduated Course 2010. October 29-30. American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD).