Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT‐PCR khảo sát các kiểu bản sao BCR/ABL tại bệnh viện truyền máu huyết học

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  190 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT‐PCR KHẢO SÁT   CÁC KIỂU BẢN SAO BCR/ABL TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC   Nguyễn Thị Kim Định *, Phan Thị Xinh**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT‐PCR khảo sát các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL trên  bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) và bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL).  Đối  tượng và phương pháp: Từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013, 100 BN gồm 94 BN BCMDT và 6  BCCDL được khảo sát biểu hiện của tổ hợp gen BCR/ABL tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM bằng  2 kỹ thuật RT‐PCR đơn và multiplex RT‐PCR.  Kết quả: Kết quả thử điều kiện của phản ứng multiplex RT‐PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ  60oC‐65oC cho thấy nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu là 62oC. Khảo sát 100 mẫu từ BN BCMDT và BCCDL bằng 2 kỹ  thuật RT‐PCR đơn và multiplex RT‐PCR cho kết quả hoàn toàn tương đồng với 6 BN BCCDL chỉ biểu hiện  e1a2 và 86 BN BCMDT dương tính các kiểu bản sao là b3a2, b2a2 lần lượt là 58,1%, 34,9%. Đồng biểu hiện của  2 kiểu bản sao biểu hiện với tỉ lệ thấp hơn.  Kết luận: Xây dựng thành công kỹ thuật multiplex RT‐PCR để phát hiện các kiểu bản sao của tổ hợp gen  BCR/ABL lúc chẩn đoán giúp tiết kiệm được thời gian, công sức và hóa chất. Nghiên cứu này là tiền đề cho việc  xây dựng kỹ thuật multiplex PCR khảo sát các bất thường về gen thường gặp trong các bệnh lý huyết học ác tính  khác  Từ khóa: Bạch cầu mãn dòng tủy (BCMDT), Bạch cầu cấp dòng Lympho (BCCDL), BCR/ABL, multiplex  RT‐PCR.  ABSTRACT   DETECTION OF BCR/ABL TRANSCRIPTS USING MULTIPLEX RT‐PCR AT BLOOD TRANSFUSION  AND HEMATOLOGY HOSPITAL  Nguyen Thi Kim Dinh , Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 190 ‐ 194  Objectives:  Using multiplex RT‐PCR  to  detect  the  types  of  BCR/ABL  transcripts  in  chronic myeloid  leukemia (CML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL).  Material and Methods: From October 2012 to June 2013, expression of BCR/ABL fusion transcripts from  100 patients, including 94 with CML and 6 with ALL, are detected by single RT‐ PCR and multiplex RT‐PCR.  Results: By adjusting primer annealing temperature in a range from 60oC to 65oC, the optimal temperature  was determined at 62oC. The results  for detecting BCR/ABL transcripts  in 100 patients using single RT‐PCR  and multiplex RT‐PCR are the same, in which 6 ALL patients are positive for e1a2 transcript; 86 CML patients  are  positive  for  b2a2  and  b3a2  transcripts,  corresponding  to  58.1%  and  34.9%,  respectively.  Patients  simultaneously expressing two types of BCR/ABL transcripts are at lower incidence.  Conclusion:  Successful  development  of multiplex  RT‐PCR  procedure  for  detecting  types  of  BCR/ABL  transcripts at the time of diagnosis helps to save time, workforce and chemical. This study is the first step to apply  multiplex RT‐PCR for detecting genetic anomalies in other hematopoietic malignancies.  Key words: chronic myeloid leukemia (CML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), BCR/ABL, multiplex  RT‐PCR.  * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh  ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh   Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 0932.728.115   Email: phanthixinh@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  191 ĐẶT VẤN ĐỀ   Chuyển  vị  tương  hỗ  giữa  nhiễm  sắc  thể  (NST) 9 và 22 tạo ra tổ hợp gen BCR/ABL được  tìm thấy trong hơn 90‐95% bệnh nhân (BN) bạch  cầu mạn dòng  tủy  (BCMDT),  khoảng  30% BN  bạch  cầu  cấp  dòng  lympho  (BCCDL)  ở  người  lớn  và  3‐5% BCCDL  ở  trẻ  em. Trong BCMDT,  tùy điểm gãy trên gen BCR sẽ tạo ra nhiều kiểu  tổ  hợp  gen  BCR/ABL  trong  đó  thường  gặp  là  major  BCR/ABL  (b3a2,  b2a2)  kế  tiếp  là  minor  BCR/ABL  (e1a2)  và một  số  kiểu  bản  sao  hiếm  gặp  khác  như  b2a3,  b3a3,  e1a3,  e19a2,  e6a2(2,8).  Việc  sử  dụng  phản  ứng  khuếch  đại  chuỗi  (polymerase  chain  reaction: PCR)  đơn  để  khảo  sát các kiểu bản sao thường gặp như b2a2, b3a2  và e1a2 là một kỹ thuật đơn giản, độ nhạy cao(6,7).  Ngoài ra, nếu cần độ nhạy cao hơn có  thể  thực  hiện thêm nested PCR nhưng PCR đơn có nhược  điểm là tốn nhiều thời gian, công sức và hóa chất  vì phải thực hiện trên từng phản ứng PCR riêng  biệt và không phát hiện được các kiểu bản sao  hiếm gặp.  Multiplex  PCR  là  phản  ứng  PCR mà  cùng  lúc có thể khuếch đại được nhiều gen hoặc nhiều  kiểu bản sao của 1 gen với nhiều cặp mồi hoặc 1  cặp mồi trong cùng 1 phản ứng. Gần đây, một số  nghiên  cứu  trên  thế  giới  đã  sử dụng  kỹ  thuật  multiplex PCR để khảo sát các kiểu bản sao của  gen BCR/ABL trong BCMDT và BCCDL lúc chẩn  đoán(1,2,3,4,5). Với  kỹ  thuật  này  hầu  hết  các  kiểu  bản sao của gen BCR/ABL, kể cả các kiểu bản sao  hiếm gặp cũng có thể được phát hiện chỉ trong 1  phản  ứng  PCR,  giúp  tiết  kiệm  thời  gian,  công  sức, hóa chất và hạn chế sự lây nhiễm do nhiều  lần thực hiện thao tác thực nghiệm.   Tại  bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  Học  (BVTMHH) TP.HCM, từ năm 2005 kỹ thuật RT‐ PCR đơn đã được thiết lập để khảo sát các kiểu  bản  sao  thường  gặp  là  b2a2,  b3a2  và  e1a2  kết  hợp với nested PCR  để  chẩn  đoán và  theo dõi  điều  trị  BCMDT  và  BCCDL(6,7).  Trong  nghiên  cứu này, chúng  tôi chuẩn hóa  thành công điều  kiện  của multiplex PCR  và  tiến hành  khảo  sát  các kiểu bản  sao BCR/ABL bằng multiplex RT‐ PCR  trên 100 BN BCMDT và BCCDL  lúc  chẩn  đoán. Kết  quả  được  so  sánh  với  kết  quả  PCR  đơn trên cùng 100 BN.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu   Mẫu tủy hoặc mẫu máu của 94 BN BCMDT  và 6 BN BCCDL mới được chẩn đoán dựa vào  huyết  đồ,  tủy  đồ  và  dấu  ấn  miễn  dịch  tại  BVTMHH TP.HCM từ tháng 10/2012 đến tháng  6/2013.   Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới.   Phương pháp tiến hành  Ly  trích RNA  và  tổng  hợp  cDNA: Mẫu máu  ngoại vi hoặc  tủy xương  lấy  trong chống đông  EDTA  được  ly  trích RNA bằng bộ kít  Invitrap  Spin Universal RNA Mini kit (Stratec, Đức) theo  quy trình kỹ thuật do nhà sản xuất cung cấp. Sau  đó, 1 μg RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA  với  SuperScript  II  reverse  transcriptase  (Invitrogen, Mỹ) trong tổng thể tích phản ứng là  20 μL, theo chương trình luân nhiệt ở 25oC trong  10  phút,  kế  tiếp  là  42oC  trong  50  phút  và  hủy  men  còn  lại  trong  phản  ứng  ở  72oC  trong  15  phút. Sau khi pha loãng với nước tinh khiết, thể  tích cDNA là 60 μL.  Phản  ứng  multiplex  RT‐PCR:  phản  ứng  multiplex  RT‐PCR  gồm  có  2μL  cDNA,  0,4  μL  (10μM) mồi  xuôi Mul‐BCR‐F1,  0,2  μL  (10  μM)  mồi  xuôi  Mul‐BCR‐F2,  0,4  μL  (10  μM)  mồi  ngược Mul‐ABL‐R,  và  0,15  μL  Takara  Taq HS  (Takara, Nhật)  trong  20  μL  thể  tích phản  ứng.  Tiến hành thử điều kiện của phản ứng PCR với  nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 60oC‐65oC.  Chương  trình  luân nhiệt gồm biến  tính  ở 98oC  trong 3 phút; 45 chu kỳ với 98oC  trong 10 giây,  60oC‐65oC trong 30 giây, 72oC trong 45 giây; hoàn  thành phản ứng với 72oC  trong 5 phút. Sau đó,  sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên  thạch  1,2%  chứa  0,5  μg/mL  ethidium  bromide  trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc  EQ  (Biorad, Mỹ). Kết quả dương  tính nếu như  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  192 biểu  hiện  kích  thước  băng  tương  ứng  với  các  kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL (Bảng 1).  Bảng 1: Các mồi dùng cho phản ứng multiplex RT‐ PCR và các sản phẩm PCR tương ứng.  Mồi xuôi Mồi ngược Các kiểu bản sao và kích thước sản phẩm PCR Qmulti-BCR- F1 Qmulti-ABL-R b3a2 627 bp b2a2 552 bp b2a3 378 bp b1a1 580 bp e1a2 429 bp c3a2 1167bp e1a3 255bp Qmulti-BCR- F2  RT‐PCR đơn: Phản ứng RT‐PCR gồm  có 1μL cDNA, mỗi mồi 0,75 μL (10 μM) và  0,1  μL GoTaq  (Promega, Mỹ)  trong  15  μL  thể tích phản ứng. Chương trình luân nhiệt  trên máy  iCycler  (Biorad, Mỹ) với nhiệt độ  bắt  cặp  là  60oC  đối với major BCR/ABL và  65oC  đối với minor BCR/ABL  trong  45  chu  kỳ.  Sau  đó,  sản  phẩm  của  phản  ứng  PCR  được điện di trên thạch 2%. Kích thước băng  tương ứng với các kiểu bản sao theo Bảng 2.  Bảng 2: Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT‐ PCR  đơn và các sản phẩm PCR tương ứng  Tên Mồi Kích thước sản phẩm PCR Major BCR/ABL 7700-F b2a2: 212 bp b3a2: 278 bp 7700-R Minor BCR/ABL m-BA-2nd-F e1a2: 198 bp m-BA-2nd-F KẾT QUẢ   Kết  quả  thử  điều  kiện  của  phản  ứng  multiplex  RT‐PCR  với  nhiệt  độ  bắt  cặp  mồi  trong khoảng  từ 60oC‐65oC cho  thấy ở nhiệt độ  60oC  thì  xuất hiện nhiều  băng  không  đặc hiệu  (Hình 1A), ở 64oC  ‐ 65oC  thì băng đặc hiệu của  mẫu 1 và 5 không khuếch đại được (Hình 1C), ở  62oC thì các băng đặc hiệu xuất hiện đầy đủ và  không có băng phụ (Hình 1B).    1 2 3 4 5 Neg 1 2 3 4 5 Neg1 2 3 4 5 Neg A B C Hình 1: Kết quả multiplex RT-PCR ở nhiệt độ bắt cặp 60oC (A), 62oC (B) và 65oC (C) 1: BN có b2a2 và e1a2; 2: BN có  b3a2; 3: BN có b3a2 và b2a2; 4: BN có b3a2 và e1a2; 5: BN có e1a2; M: thang chuẩn; N: chứng âm. Bước  đầu  khảo  sát  biểu  hiện  của  11  BN  (BN6 – BN16) cho thấy sự tương đồng giữa kết  quả của kỹ thuật RT‐PCR đơn (Hình 2A và 2B)  và multiplex RT‐PCR (Hình 2C).  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  193 Hình 2: Kết quả của 11 BN khảo sát major BCR/ABL bằng RT‐PCR đơn (A), minor BCR/ABL bằng RT‐PCR  đơn (B) và multiplex RT‐PCR (C) Kiểu bản sao BCR/ABL của BN6: b3a2; BN7: b2a2; BN8: e1a2; BN9: b3a2  và e1a2; BN10: b2a2 và e1a2; BN11: b3a2 và e1a2; BN12 và BN13 và BN14: b3a2 và b2a2; BN15: e1a2;  BN16: âm tính; M: thang chuẩn; P: chứng dương; N: chứng âm.   Kết  quả  khảo  sát  6  BN  BCCDL  và  94  BN  BCMDT bằng 2 kỹ  thuật multiplex RT‐PCR và  RT‐PCR đơn cho kết quả  tương đồng  (Bảng 3).  Trong 94 BN BCMDT, có 8 BN không biểu hiện  tổ hợp gen BCR/ABL và 86 BN biểu hiện các kiểu  bản sao thường gặp là b3a2, b2a2 và e1a2. Kiểu  bản  sao  b3a2  là  thường  gặp  nhất,  chiếm  tỉ  lệ  58,1%,  kế  tiếp  là  b2a3  chiếm  34,9%,  đồng  biểu  hiện b3a2 và b2a2 hoặc e1a2 chiếm tỉ lệ lần lượt  là  3,5%  và  2,3%. Ngoài  ra,  có  1 BN  đồng  biểu  hiện b2a2 và e1a2 chiếm tỉ lệ 1,2% (Bảng 3).  Bảng 3: Các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL  Thể bệnh Kiểu bản sao của BCR/ABL RT-PCR đơn (BN) Multiplex RT- PCR (BN) BCCDL e1a2 6 6 BCMDT b3a2 50 50 b2a2 30 30 b3a2 và b2a2 3 3 b3a2 và e1a2 2 2 b2a2 và e1a2 1 1 Không biểu hiện tổ hợp gen BCR/ABL 8 8 BÀN LUẬN  Nhiệt độ bắt cặp đối với phản ứng RT‐PCR  đơn  khác  nhau  khi  khảo  sát  các  kiểu  bản  sao  major và minor BCR/ABL nên phải  thực hiện 2  phản ứng với 2 chương  trình khuếch  đại  riêng  biệt nên tốn thời gian, hóa chất và dụng cụ gấp  đôi.  Đối  với multiplex  RT‐PCR,  trong  cùng  1  phản  ứng  có  thể phát hiện  được  cùng  lúc hầu  hết các kiểu bản sao BCR/ABL nên rất thuận lợi  trong việc tầm soát gen trước điều trị. Tuy nhiên,  việc  thử điều kiện  để  chọn  ra  điều kiện  tối  ưu  của phản  ứng  sẽ khó khăn hơn. Trong nghiên  cứu này, chúng  tôi  thay đổi điều kiện nhiệt độ  bắt  cặp mồi  trong  khoảng  từ  60oC‐65oC  và  kết  quả cho thấy nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu là 62oC  (Hình 1).  Kết quả khảo  sát 100 BN  cho  thấy  tỉ  lệ  các  kiểu  bản  sao  của  tổ  hợp  gen  BCR/ABL  tương  đồng giữa 2 kỹ thuật multiplex RT‐PCR và RT‐ PCR đơn, trong đó 6 BN BCCDL đều biểu hiện  kiểu bản sao e1a2. Kết quả phân tích 86 trường  hợp BCMDT cho thấy kiểu bản sao thường gặp  nhất  là b3a2  (58,1%), kế đến  là b2a2  (34,9%) và  sau  đó  là  các  trường  hợp  đồng  biểu  hiện  của  b3a2, b2a2 và e1a2,  tương  đồng với các nghiên  cứu khác(1,2,3).   RT‐PCR đơn, đặc biệt  là nested RT‐PCR chỉ  sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu trong phản ứng nên  nhạy hơn multiplex RT‐PCR, phù hợp cho việc  đánh giá biểu hiện gen sau điều trị hóa trị  liệu.  Trong nghiên cứu này, không có sự khác biệt về  kết quả giữa 2 kỹ  thuật  trên 100 mẫu khảo  sát  cho  thấy ưu  điểm của multiplex RT‐PCR  trong  việc khảo sát các kiểu bản sao BCR/ABL lúc chẩn  đoán(2,3) giúp tiết kiệm thời gian, công sức và hóa  chất, làm giảm giá thành xét nghiệm.   KẾT LUẬN  Chúng tôi đã xây dựng thành công kỹ thuật  multiplex RT‐PCR để có  thể phát hiện các kiểu  bản sao thường gặp b3a2, b2a và e1a2, ngoài ra  còn có thể phát hiện các kiểu bản sao hiếm gặp  khác của tổ hợp gen BCR/ABL. Trong tương lai,  P N M B P NM B A B BN N M C Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  194 cần  ứng  dụng  kỹ  thuật multiplex  RT‐PCR  để  phát hiện các  tổ hợp gen gây bệnh  thường gặp  trong BCCDL và bạch cầu cấp dòng  tủy để  tiết  kiệm thời gian, chi phí và nhân lực.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bennour A, Ouahchi I, Moez M, et al (2012). Comprehensive  analysis  of  BCR/ABL  variants  in  chronic myeloid  leukemia  patients using multiplex RT‐PCR. Clin Lab. 58(5‐6):433‐9.  2. Burmeister  T,  Reinhardt  R  (2008).  A  multiplex  PCR  for  improved detection of  typical and atypical BCR/ABL  fusion  transcripts. Leuk Res Apr; 32(4):579‐85.   3. Goh HG, Hwang  JY, Kim  SH,  et  al  (2006). Comprehensive  analysis of BCR/ABL transcript types in Korean CML patients  using a newly developed multiplex RT‐PCR. Transl Res Nov;  148(5):249‐56.  4. Lee A, Kirk J, Edmands S, Radich J (1995). Multiplex PCR of  bcr‐abl  fusion  transcripts  in  Philadelphia  positive  acute  lymphoblastic leukemia. PCR Methods Appl. Apr; 4(5):283‐7.  5. Pallisgaard N, Hokland P, Pedersen B,  el al (1998). Multiplex  reverse  transcription‐polymerase  chain  reaction  for  simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal  aberrations in acute leukemia. Blood. Jul;92(2):574‐88.  6. Phan Nguyễn  Thanh Vân, Nguyễn  Tấn  Bỉnh  (2006).  Triển  khai kỹ  thuật FISH và RT‐PCR nhằm phát hiện những bất  thường nhiễm  sắc  thể và gene  trong bệnh  lý huyết học  tại  Bệnh viện Truyền máu ‐ Huyết học TP. Hồ Chí Minh. Tạp chí  Y học Việt Nam; 545.  7. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị  Xinh (2010). Khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp trong bạch  cầu cấp dòng  lympho  tại BV Truyền Máu  ‐ Huyết Học TP.  HCM. Tạp chí Y học Việt Nam; 373:180.  8. Yaghmaie  M,  Ghaffari  SH,  Ghavamzadeh  A,  et  al  (2008).  Frequency of BCR/ABL fusion transcripts  in Iranian patients  with chronic myeloid leukemia. Arch Iran Med; 11(3):247‐51.  Ngày nhận bài báo:      15 tháng 8 năm 2013  Ngày phản biện:      29 tháng 8 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013